通竅活血湯通過激活音猬因子信號通路減輕腦缺血后大鼠腦水腫的實驗研究*

白馬瑞雪 葉育鋒 柏魯寧

（1.陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫藥大學附屬醫院，陜西 咸陽 712046）

腦缺血（IS）是腦血流中斷引起的嚴重神經損傷疾病，屬中醫“中風”范疇。IS 的病理特征之一是血腦屏障（BBB）完整性的破壞［1］，通透性增大，使腦水腫加重［2-3］，而腦水腫是IS 最常見和最嚴重的并發癥之一，嚴重影響患者預后［4］。目前臨床上IS的藥物治療方法有限，迫切需要新的治療方法。研究發現，Shh/Gli1 信號通路在IS 后表現出神經保護作用，星形膠質細胞可分泌音猬因子（Shh）上調BBB 的完整性［5-6］。中醫學對中風有良好的預防和治療作用，通竅活血湯可修復腦缺血后Claudin5（Cldn5）蛋白的結構，下調水通道蛋白4（AQP4）蛋白表達，降低BBB 的通透性［7］。但通竅活血湯是否通過激活Shh信號通路來調控BBB 的完整性，減輕腦水腫從而發揮對大腦中動脈閉塞（MCAO）大鼠的神經保護作用，目前報道較少。本研究以MCAO 大鼠為模型，以Shh 信號通路為切入點，通過研究通竅活血湯對MCAO 大鼠BBB 相關蛋白的影響，進一步探討通竅活血湯減輕腦缺血大鼠腦水腫的可能機制，為臨床防治IS提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選雄性SD 大鼠72 只，周齡（10±1）周，體質量（300±10）g，由成都達碩實驗動物有限公司提供，動物許可證號：SCXK（川）2022-030，在陜西省中醫藥管理局中藥藥效機制與物質基礎重點研究室飼養，相對濕度45%～55%，溫度20～25 ℃。適應性飼養5 d。動物實驗的飼養、手術操作以及標本收集均經過陜西中醫藥大學倫理委員會審核通過（SUCMDL30210924001）。

1.2 實驗藥物

通竅活血湯：生姜50 g，赤芍30 g，人工麝香1.5 g，大棗70 枚，川芎30 g，桃仁90 g，蔥30 g，紅花90 g。將中藥材置于10 倍量的黃酒中浸泡1 h，加熱回流提取3次，每次2 h，將3 次濾液合并，蒸發，濃縮，加入黃酒稀釋液和麝香，再次過濾，配制成含生藥2 g/mL 的溶液，于4 ℃冰箱保存備用。中藥飲片均購自陜西中醫藥大學附屬醫院，經陜西中醫藥大學藥學院鑒定為正品。尼莫地平片（山西亞寶藥業集團股份有限公司，國藥準字號H14022821）。黃酒（紹興柯橋第三酒廠）。

1.3 試劑與儀器

HE 染液套裝、通用型組織固定液（武漢塞維爾生物科技有限公司，批號分別為：G1003、G1101）；Shh 抗體、Gli1 抗體、Cldn5 抗體（武漢三鷹生物技術有限公司，批號分別為：20697-1-AP、66905-1-Ig、29767-1-AP）；AQP4 抗體（武漢塞維爾生物科技有限公司，批號：GB11530）。水迷宮（上海吉量軟件科技有限公司，型號：JLBehv-MWMG）；包埋機（武漢俊杰電子有限公司，型號：JB-P5）；病理切片機（上海徠卡儀器有限公司，型號：RM2016）；組織攤片機（浙江省金華市科迪儀器設備有限公司，型號：KD-P）；組化筆（武漢塞維爾生物科技有限公司，G6100）；顯微鏡（尼康儀器有限公司，型號：E100）。

1.4 分組及給藥

適應性飼養5 d 后，將72 只大鼠隨機分為6 組，每組12 只，即假手術組、模型組、尼莫地平組及中藥低、中、高劑量組。根據人與大鼠換算比計算，連續7 d對各組大鼠進行藥物干預：假手術組、模型組灌胃生理鹽水6 g/kg，每日1 次；尼莫地平組灌胃尼莫地平藥液10 mg/kg，每日1 次；中藥低、中、高劑量組分別灌胃通竅活血湯2.9、5.8、11.6 g/kg，每日1次。

1.5 模型制備

最后1 次藥物干預結束2 h 后，開始造模。大鼠術前禁食12 h，自由飲水，采用經典改良Zea-Longa 線栓法［8］制備大鼠MCAO 模型。取20%烏拉坦（1 g/kg）腹腔注射麻醉大鼠，麻醉后將大鼠仰臥固定于手術臺。選擇大鼠頸部正中偏右備皮、消毒行縱向手術切口，鈍性分離并暴露皮下組織，找到頸總動脈（CCA）交叉處，分離迷走神經、CCA、頸內動脈（ICA）與頸外動脈（ECA）。插入線栓約17～18 mm遇到阻力時停止，使線栓經CCA與ICA到達大腦中動脈，固定線栓，將CCA外多余線栓剪掉，傷口消毒縫合。假手術組大鼠僅分離血管不插入線栓，其余步驟與模型組相同。待大鼠清醒后行神經功能學評分，分值1～3 分為造模成功。對造模失敗或意外死亡的大鼠，選擇同批次SD大鼠按相應組別要求補足實驗大鼠數量。

1.6 標本采集與檢測

1.6.1 神經功能學評分 造模24 h 后使用Zea-longa神經功能評分法［8］（5 級4 分法）對大鼠神經功能缺損程度進行評定。分數高低與腦功能正常與否呈反比。

1.6.2 Morris 水迷宮實驗 造模前5 d 將大鼠放入水迷宮行定位航行試驗，每天分別從第1、4 象限將大鼠放入水中訓練2次。第6日進行空間探索實驗，將平臺撤離并取原平臺所在對象限作為大鼠入水點。記錄90 s內大鼠穿過原平臺所在位置的次數及停留原平臺象限所用時間。造模后24 h 再次行空間探索實驗，完成后整理數據并評估造模后大鼠空間記憶能力的差異。實驗過程中保證實驗環境的固定和安靜。

1.6.3 腦組織病理學觀察 腹腔注射20%烏拉坦麻醉處死，取缺血側海馬組織用4%甲醛溶液固定24 h以上。將組織修整、標記。依次行脫水、浸蠟、包埋、切片，-20 ℃冰箱冰凍切片；脫蠟、復溫固定、HE 染色、脫水、中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。

1.6.4 免疫組織化學法檢測腦組織Shh、Gli1、Cldn5、AQP4 蛋白的表達 如前述方法取缺血側海馬組織石蠟包埋、切片后，脫蠟、抗原修復、封閉、敷一抗、敷二抗、顯色、復染、脫水、封片膠封片，顯微鏡下觀察。

1.6.5 蛋白免疫印跡（Western blotting）法檢測腦組織Shh、Gli1、Cldn5、AQP4 蛋白的表達 取鮮腦后，迅速于冰袋上將缺血側海馬組織取出放入無菌EP管，置于液氮罐中，過夜后存儲于-80 ℃冰箱中保存備用。檢測時將海馬組織研磨，加入裂解緩沖液，提取總蛋白、測定蛋白濃度、SDS-PAGE 電泳、轉膜及抗體孵育、顯像處理。掃描后分析膠片目的條帶的灰度值。

1.7 統計學處理

應用SPSS25.0 統計軟件。符合正態分布且方差齊的數據，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 檢驗；非正態分布的數據采用非參數檢驗進行分析。計量資料均以（±s）表示。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠神經功能評分比較

見表1。造模24 h 后，假手術組大鼠神經功能評分為0 分，無神經功能缺損；模型組評分為（2.75±0.45）分，在各組大鼠中評分最高，神經功能缺損最嚴重，說明造模成功。與假手術組相比，模型組大鼠神經功能評分顯著增高（P＜0.05）；與模型組相比，尼莫地平組及通竅活血湯中、高劑量組大鼠神經功能評分顯著降低（均P＜0.05）；與尼莫地平組相比，中藥中、高劑量組大鼠神經功能評分略高，但差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠神經功能評分、穿越平臺次數和平臺所在象限停留時間比較（±s）

表1 各組大鼠神經功能評分、穿越平臺次數和平臺所在象限停留時間比較（±s）

注：與假手術組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01；與尼莫地平組比較，△P ＜0.05。下同。

組 別假手術組模型組尼莫地平組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組n 12 12 12 12 12 12神經功能評分（分）0 2.75±0.45*1.33±0.49#2.33±0.49△1.42±0.52#1.58±0.67#穿越平臺次數（次）3.33±0.78 0.92±1.00*3.08±1.44#1.33±0.78△3.25±0.87#2.31±1.35△停留時間（s）40.41±3.01 14.67±1.10*24.83±0.91#17.40±0.71#△27.49±4.52#19.64±0.73#△

2.2 各組大鼠空間記憶能力比較

見表1。經過5 d 訓練各組大鼠造模前游泳軌跡差別不大。造模24 h后，與假手術組相比，模型組大鼠穿越平臺次數與平臺所在象限停留時間顯著減少（P＜0.05）；與模型組比較，尼莫地平組和中藥中劑量組大鼠穿越平臺次數顯著增加（P＜0.05），平臺所在象限停留時間顯著延長（P＜0.05）；與尼莫地平組相比，通竅活血湯中劑量組大鼠穿越平臺次數與平臺所在象限停留時間略高，但差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.3 各組大鼠腦組織病理學

假手術組海馬組織細胞形態正常，胞質胞核邊界清楚，排列緊密，為細胞正常形態。模型組大鼠海馬組織結構明顯異常，細胞排列紊亂，可見大量細胞核破裂，核固縮深染，細胞明顯水腫且大量壞死，而中藥中劑量組與尼莫地平組細胞壞死現象減輕，細胞水腫程度較模型組減輕。見圖1。

圖1 各組大鼠腦組織病理觀察（HE染色，200倍）

2.4 各組大鼠腦組織Shh、Gli1、Cldn5、AQP4 蛋白表達比較

見圖2。假手術組中，海馬內Shh、Gli1、Cldn5、AQP4 正常表達，呈淺棕色或棕色。與假手術組相比，模型組Shh、Gli1 黃色或棕色顆粒表達略增多，蛋白表達增高不明顯；Cldn5 黃色著色區域明顯減少，蛋白表達顯著減少；AQP4 棕色或褐色顆粒明顯增多，蛋白表達顯著增多。與模型組相比，尼莫地平組和中藥中劑量組Shh、Gli1、Cldn5 黃色或棕色顆粒增多，表達顯著增多；AQP4棕色著色變淺，表達顯著減少。

圖2 各組大鼠腦組織蛋白表達（免疫組化染色，200倍）

2.5 各組大鼠腦組織Shh、Gli1、Cldn5、AQP4 蛋白的表達比較

見表2、圖3。與假手術組比較，模型組Shh、Gli1表達上調（P＜0.05）；Cldn5 蛋白顯著減少（P＜0.01）；AQP4 表達顯著上調（P＜0.01）。與模型組比較，尼莫地平組與中藥中劑量組Shh、Gli1 表達顯著上調（P＜0.01）；中藥中劑量組Cldn5 蛋白表達上調（P＜0.01）、AQP4 表達下調（P＜0.01）；與尼莫地平組相比，中藥中劑量組大鼠Shh、Gli1、Cldn5蛋白略高，AQP4蛋白表達略低，但差異無統計學意義（均P＞0.05）。

圖3 各組大鼠腦組織蛋白表達條帶

表2 各組大鼠Shh、Gli1、Cldn5、AQP4蛋白相對表達量比較（±s）

表2 各組大鼠Shh、Gli1、Cldn5、AQP4蛋白相對表達量比較（±s）

組 別假手術組模型組尼莫地平組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組n3 3 3 3 3 3 Shh 1.00±0 1.82±0.11*3.47±0.19##2.44±0.12 4.82±0.53##3.13±0.15##Gli1 1.00±0 1.71±0.06*3.24±0.19##2.59±0.19#3.42±0.17##3.35±0.40##Cldn5 1.00±0 0.59±0.04**0.82±0.01##0.66±0.02 0.97±0.03##0.82±0.05##AQP4 1.00±0 3.05±0.59**1.74±0.25#2.47±0.42 1.34±0.20##1.99±0.30#

3 討 論

IS 的發病率、致死率及疾病負擔有逐年升高的態勢，近年來已逐漸成為我國居民第一大死亡原因［9-10］。目前臨床上已做出各種努力來改善中風發作后的結局，如及時的靜脈溶栓治療和機械性血栓切除術，以實現腦血管再通［11］。幾乎所有無禁忌證的患者都推薦使用抗血小板或抗凝劑等抗血栓治療［12］，但對IS 的藥物治療效果仍有限，迫切需要新的治療方法。

局部缺血后，腦組織ATP 合成中斷、能量缺乏、離子穩態受損導致BBB 結構破壞，通透性增大，導致腦水腫［2］。腦容量受到顱骨剛性的限制，即使是微小的容量增加，也會導致顱內壓升高、腦疝等嚴重后果，故腦水腫對IS 的發病率和死亡率有重要影響［13］。中醫治療中風歷史悠久，中藥可通過多靶點、多途徑作用于IS，臨床療效顯著［14］。通竅活血湯是著名中醫經典方劑，對IS有神經保護作用，已被廣泛用于治療IS患者［15］。研究發現［7］，腦缺血后，通竅活血湯可上調Cldn5表達，下調AQP4 表達，降低BBB 的通透性，減輕腦水腫，但通竅活血湯調節蛋白表達、保護BBB 的具體機制仍不清楚。

BBB是可以精確控制大腦內環境穩態的物理和生化屏障，由緊密排列的血管內皮細胞、星形膠質細胞和周細胞等細胞組成。內皮細胞間由緊密連接（Tjs）蛋白連接，Cldn5是Tjs的主要蛋白之一，保證腦血管完整性和BBB 功能。其結構的破壞會使血管內皮細胞的細胞旁通透性增高，導致腦組織水腫；同時會使炎癥因子、血漿和血清蛋白等進入中樞神經系統，導致神經炎癥，進一步加重BBB 破壞，形成惡性循環［16］。研究發現，腦組織缺血缺氧使Cldn5 蛋白結構破壞，BBB 通透性增加，加重腦水腫［17］。AQP4 是大腦中主要的水通道蛋白，集中在血管周圍星形膠質細胞足突上表達，兼具細胞外滲透壓感受器和水平衡調節器的功能，對腦組織水分子的轉運起主導作用，對維持腦組織內環境的穩定具有重要作用［18］；同時AQP4 與腦脊液的分泌和重吸收有關，而腦脊液是IS 水腫液的主要來源［19-20］。腦缺血后，星形膠質細胞內外的電解質平衡紊亂，使滲透壓梯度發生變化，上調了AQP4 的表達，改變細胞膜結構，導致星型膠質細胞水腫［21］，增加了BBB 通透性和細胞水分滲透性，使血管內液體與周圍腦脊液加速流入腦實質［19］。在AQP4 被抑制后，這種內流顯著減少，使流向腦組織的水滲透減少，顯著減輕腦水腫［22］。本實驗結果顯示，模型組Cldn5表達最少、AQP4 表達增強，說明模型組大鼠BBB 破壞最為嚴重，腦水腫程度最大；而中藥中劑量組Cldn5 表達明顯回升、AQP4 表達明顯減少，說明通竅活血湯通過調控Cldn5 和AQP4 蛋白表達保護缺血后BBB，減輕腦水腫，改善MCAO 大鼠神經功能缺損程度與空間記憶能力。這與汪寧等［7］的研究結果一致。

Shh 信號通路在中樞神經系統發生、發育中起重要作用，該信號通路已成為治療IS 的新靶點。腦組織缺血缺氧后，星形膠質細胞分泌Shh，與內皮細胞膜上的Ptch蛋白結合，解除Ptch對Smo蛋白的抑制，后者在初級纖毛細胞器中積累并啟動下游信號通路級聯，觸發Gli1 的激活。Gli1 是一種轉錄激活因子，其存在表明細胞Shh 活性活躍［23］。研究發現，Shh 信號通路可修復MCAO動物模型的Tjs蛋白，顯著減輕腦水腫和維持BBB 的通透性［24］，而Shh 信號傳導抑制劑環巴胺可逆轉這一作用［25］。本實驗結果顯示，模型組大鼠腦組織中Shh 與Gli1 蛋白表達略增多，表明僅在缺血刺激下，Shh 信號通路不能被完全激活；與模型組比較，中藥中劑量組大鼠Shh 與Gli1 蛋白表達顯著增多，提示通竅活血湯可在一定程度上激活Shh信號通路表達。

綜上所述，通竅活血湯對MCAO 大鼠的神經保護作用可能是通過激活Shh/Gli1信號通路，調控Cldn5表達增加、AQP4 表達減少來保護BBB 完整性，達到減輕腦水腫的效果，但是其具體機制還需要進一步研究。本實驗仍存在諸多不足，如實驗中未應用Shh 抑制劑更進一步說明通竅活血湯可激活Shh 通路發揮作用。我們將在后續的實驗中進一步研究他們之間的關系。