Erastin 和BIBR1532 聯合應用對胃癌細胞增殖的影響

楊秋慧，郝名英，劉思琪，黃欣宇，耿鑫

（天津醫科大學基礎醫學院生物化學與分子生物學系，天津 300070）

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，在我國的發病率和致死率仍呈現上升趨勢，嚴重影響到國人的生命健康[1-2]。手術切除是早期胃癌的主要治療方式，中期胃癌的治療采用包括傳統放化療、靶向治療和免疫治療在內的綜合治療方法。靶向治療聯合化療已成為晚期胃癌的一線治療方案，但胃癌靶向藥物的選擇相對有限[3-4]。因此需要探索個性化治療策略和更深層的分子機制來滿足胃癌的治療需求。

鐵死亡是由氧化劑和抗氧化劑之間的氧化還原失衡引起的，由產生自由基和脂質氧化產物的多種氧化還原酶的活性或表達異常驅動的一種細胞死亡形式[5]。Erastin 可以誘導鐵死亡并抑制腫瘤生長[6]。鐵死亡可通過外源性和內源性兩種途徑激活，內在途徑通過阻斷細胞內抗氧化酶[如谷胱甘肽過氧化物酶（GPX4）]而被激活[7]。GPX4 是一種在其活性位點具有硒代半胱氨酸的硒蛋白，是鐵死亡的關鍵調節因子[8-9]。抑制GPX4 會導致脂質過氧化，并可誘導鐵死亡，從而抑制腫瘤細胞增殖[10]。GPX4 功能的喪失導致耐藥細胞發生鐵死亡，并防止小鼠腫瘤復發[11]。由于GPX4 在脂質過氧化過程中的關鍵作用，GPX4 已被確定為基于鐵死亡的一個有希望的腫瘤治療靶點[12]。

端粒由DNA 序列TTAGGG/AATCCC 的串聯重復序列組成，位于真核生物線性染色體末端，保護天然DNA 末端不被識別為DNA 損傷[13]。端粒酶是一種特殊的核糖核蛋白逆轉錄酶，可以維持端粒的長度和穩定性[14]。端粒和端粒酶在各種腫瘤的異常細胞增殖、轉移、干細胞維持和永生化中發揮重要作用。因此，設計靶向端粒酶和端粒的藥物具有重要意義[15]。

本研究旨在探究Erastin 和BIBR1532（端粒酶抑制劑）聯合應用對胃癌細胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 人胃腺癌細胞BG823、DMEM 培養基、胎牛血清、胰蛋白酶（美國Biological Industries 公司）；SLC7A11 抗體（A2413，武漢愛博泰克生物科技有限公司）；GPX4 抗體（A1933，武漢愛博泰克生物科技有限公司）；hTERT 抗體（ab32020，美國abcam 公司）；GAPDH 抗體（10494-1-AP，Proteintech）；HPR 標記羊抗兔抗體（SA00001-2，Proteintech）；HPR 標記羊抗鼠抗體（SA00001-1，Proteintech）；BCA 蛋白定量試劑盒（PC0020，北京索萊寶科技有限公司）；多聚甲醛固定液（E672002-0500，上海生工生物）；CCK8（C3007，中國碧云天生物技術有限公司）；PVDF 膜（EZWB05-ISEQ00010-1，德國Merck Millipore 公司）；Erastin（571203-78-6）、BIBR1532（321674-73-1），均購自美國MCE 公司。CO2恒溫培養箱購自美國賽默飛公司；酶標儀購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；低溫高速離心機購自德國Eppendorf 公司；垂直電泳系統購自美國Biorad 公司；-80℃冰箱購自美國Thermo Fisher Scientific 有限公司；超凈工作臺購自江蘇通凈凈化設備有限公司；純水機購自德國Merck Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 在TIMER2.0 和GEPIA2.0 數據庫中分析GPX4 在胃癌中的表達情況 TIMER2.0（http：//timer.cistrome.org/）由3 個主要部分組成：免疫、探索和估計。免疫組件包含4 個模塊，允許用戶研究TCGA 隊列中估計的免疫浸潤與基因表達、體細胞突變、體細胞拷貝數改變和臨床結果之間的關聯。探索組件有4 個模塊，允許用戶在TCGA 中找到與腫瘤之間的關聯[16]。本文通過此數據庫分析不同腫瘤類型中GPX4 mRNA 表達情況，在Gene_DE 的選項中輸入基因名GPX4 并分析其在乳腺癌組織和正常乳腺組織中mRNA 的表達情況。

GEPIA2.0（http：//gepia2.cancer-pku.cn/#index）是基于TCGA 和GTEx 數據的基因表達譜交互式分析工具，包括差異表達分析、圖譜繪制、相關性分析、患者生存分析、相似基因檢測和降維分析[17]。本文在GEPIA2.0 數據庫中獲得GPX4 基因與正常組織的差異基因表達分析，其中|log2FC|＞1，P＜0.01。同時運用此數據庫分析了GPX4 mRNA 表達水平與胃癌患者預后的關系，P＜0.05 具有統計學意義。

1.2.2 細胞培養及傳代 BG823 細胞用含有10%FBS 的DMEM 培養基培養，培養基中含1%青-鏈霉素，置于5%CO2、37℃培養箱中培養，待細胞融合至90%左右，用0.25%胰蛋白酶消化細胞并傳代。

1.2.3 藥物配置 10 mg Erastin 溶于1.828 mL DMSO 中，配制為10 mmol/L 儲存液。10 mg BIBR1532溶于3.02 mL DMSO 中，配制為10 mmol/L 儲存液。細胞培養液將其稀釋為實驗所需濃度。

1.2.3 Western 印跡實驗 取對數生長期BG823 接種于6 孔板，細胞貼壁后加藥處理48 h，將RIPA、磷酸蛋白酶抑制劑、蛋白酶抑制劑以100∶2∶1 配置裂解液，提取細胞總蛋白。使用BCA 試劑盒檢測蛋白濃度。配置12%的分離膠，在12%SDS-PAGE 凝膠上電泳分離等量的蛋白質提取物，電泳后將蛋白轉印到PVDF 膜，在封閉緩沖液中孵育2 h，隨后加入特異性一抗（GAPDH 1∶10 000，SLC7A11 1∶1 000，GPX4 1∶1 000，TERT 1∶1 000），4℃孵育過夜，TBST 漂洗3 次，每次10 min，加入二抗（1∶10 000）室溫孵育2 h，TBST 漂洗3 次使用化學發光試劑進行檢測。將目的蛋白與內參的灰度比值作為蛋白的相對表達豐度。

1.2.4 CCK-8 實驗 取對數生長期BG823 細胞接種于96 孔板，每組設立6 個復孔，細胞貼壁后加藥處理48 h，藥物處理結束后更換含10%FBS 的DMEM 培養基。連續檢測4 d 細胞增殖情況，每天給細胞更換新鮮的培養基100 μL 并加入10 μL CCK-8 溶液，敷箱內避光孵育1 h，用酶標儀檢測細胞在450 nm 處的吸光值并繪制其生長曲線。

1.2.5 克隆形成實驗 取對數生長期的BG823 細胞接種于六孔板，細胞貼壁后加藥持續培養兩周，去除培養液，PBS 清洗，4%的多聚甲醛固定，然后加入結晶紫染液，常溫放置10 min，PBS 清洗后拍照，記錄實驗結果。

1.2.6 端粒酶活性檢測實驗 每個實驗組1×106個細胞，PBS 洗滌后將細胞重新懸浮在100 μL CHAPS裂解液中，冰上裂解40 min，4℃，16 000×g，離心40 min，取1 μL 產物用于后續PCR。PCR 產物在12%非變性聚丙烯酰胺凝膠（加入核酸染料）上分離，通過UVP 成像系統觀察。熒光密度通過Image J定量分析。

1.3 統計學處理 GraphPad Prism 9.0 進行數據分析和作圖。所有實驗均已重復3 次，數據符合正態分布，采用t 檢驗進行差異分析，P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 GPX4 是胃癌的致癌基因 本研究在TIMER2.0數據庫中比較GPX4 mRNA 在胃癌組織（n=415）和正常胃黏膜組織（n=35）的差異表達，結果顯示GPX4 在胃癌組織中的表達明顯高于正常胃黏膜組織（P＜0.01）（圖1A）。同時也通過GEPIA2.0 數據庫比較了胃癌組織和相應的正常胃黏膜組織中GPX4 mRNA 的表達差異，胃癌組織（n=408）中GPX4 mRNA 明顯高于正常胃黏膜組織（n=211）（圖1B）。GEPIA2.0 數據庫分析結果表明GPX4 高表達的胃癌患者生存時間縮短（HR=1.5，P=0.021）（圖1C）。

圖1 GPX4 是胃癌的致癌基因Fig 1 GPX4 is a oncogenic gene in GC

2.2 GPX4 直接結合蛋白的預測分析 STRING 蛋白相互作用網絡分析顯示，GPX4 蛋白相互作用網絡包括TERT、SLC7A11、PINX1、HSP90AA1、DKC1、S LC3A2、SMARCA4、PIF1、CTNNB1、WRAP53、SMG6、RUVBL1（圖2）。

圖2 STRING 數據庫分析GPX4 蛋白相互作用網絡Fig 2 The GPX4 protein interaction network was analyzed by STRING database

2.3 Erastin 對GPX4、端粒酶活性及TERT 蛋白表達量的影響 Western 印跡實驗結果顯示，與對照組相比，10、20 μmol/L Erastin 處理后BG823 細胞內SLC7A11、GPX4 蛋白表達量均明顯降低（t=7.435、6.832、7.329、7.117，均P＜0.01），TERT 蛋白表達量也出現降低（t=3.599、8.144，均P＜0.05），見圖3A。TRAP實驗結果顯示，與對照組相比，10、20 μmol/L Erastin處理后細胞內端粒酶活性降低（t=34.29、14.28，均P<0.001），見圖3B。

2.4 Erastin 及BIBR1532 對端粒酶活性及TERT 蛋白表達量的影響 TRAP 實驗結果顯示，與對照組相比，20、50、75 μmol/L BIBR1532 處理細胞48 h 后端粒酶活性均降低（t=10.03、29.79、18.86，均P<0.001），見圖4，其中75 μmol/L BIBR1532 對端粒酶活性抑制能力最強，75 μmol/L BIBR1532 與10、20 μmol/L Erastin 聯合使用后端粒酶活性降低更明顯（t=9.931，P<0.001；t=2.543，ns），見圖5。Western 印跡結果顯示，與對照組相比，10、20 μmol/L Erastin 及75 μmol/L BIBR1532 處理后TERT 蛋白表達量均降低（t=3.745、6.592、8.248，均P<0.05），Erastin 和BIBR1532 聯合處理細胞后TERT 蛋白表達量降低更明顯（t=4.918、4.483，均P<0.05），見圖6。

圖4 BIBR1532 處理后BG823 細胞內端粒酶活性Fig 4 Telomerase activity of BG823 cells after BIBR1532 treatment

圖6 Erastin 及BIBR1532 處理后BG823 細胞內hTERT 蛋白表達情況Fig 6 hTERT protein expression of BG823 cells after Erastin and BIBR1532 treatment

2.5 Erastin 與BIBR1532 聯合使用對細胞生長增殖能力的影響 克隆形成實驗和CCK8 實驗結果顯示，與對照組相比，10 μmol/L Erastin 和75 μmol/L BIBR1532處理后細胞生長增殖能力減弱（t=8.662、4.943、27.88、18.95，P<0.01）。兩種藥物聯合使用后細胞增殖能力進一步減弱（t=4.157、25.46，P<0.05），見圖7。

圖7 Erastin 及BIBR1532 處理后各組細胞生長增殖情況Fig 7 Growth and proliferation of cells in each group after treatment with Erastin and BIBR1532

3 討論

晚期胃癌患者可以明顯受益于化療，包括阿霉素、鉑類藥物、5-氟尿嘧啶、長春新堿、紫杉醇以及靶向治療藥物。然而，原發性耐藥或獲得性耐藥最終會導致胃癌患者治療失敗和不良愈后[18-20]。因此，迫切需要開發有效的胃癌治療方法。本研究證實GPX4 在胃癌組織中高表達，并與胃癌患者不良預后相關，提示GPX4 可能是胃癌的致癌基因。已有研究報道GPX4在腫瘤中的表達增加與腫瘤的發生和轉移顯著相關[21]。彌漫性大B 細胞淋巴瘤和腎細胞癌特別容易受到GPX4 調節的鐵死亡的影響。早期的研究發現耐藥腫瘤細胞具有GPX4 依賴性，GPX4 功能的喪失導致耐藥細胞鐵死亡[11]。

鐵死亡是一種鐵依賴性的調節性細胞死亡，由脂質過氧化物的積累引起，抗氧化酶GPX4 有助于清除毒性脂質過氧化物，抑制GPX4 可以促進鐵死亡發生[22]。氧化還原環境的改變使腫瘤細胞更容易發生鐵死亡，因此腫瘤細胞更容易依賴GPX4[23-24]。Erastin 是一種經典的鐵死亡激動劑，通過抑制系統Xc-的功能，從而導致GSH 耗竭和GPX4 失活，最終引起鐵死亡[25]。本研究證實了Erastin 可以抑制胃癌細胞中GPX4 表達，誘導鐵死亡發生，使胃癌細胞增殖能力減弱。Erastin 誘導的鐵死亡涉及一系列獨特的形態學、生物化學和遺傳特征，與凋亡、壞死和自噬不同[26]。研究報道抑制半胱氨酸的攝入和GPX4 失活都會導致脂質過氧化物增多，從而造成細胞死亡[27]。另有研究表明丹參酮ⅡA 引發的胃癌細胞鐵死亡為胃癌干預提供了新證據[28]。誘導鐵死亡可能有助于發現新的腫瘤治療策略[29]。

端粒是真核細胞染色體末端TTAGGG 核苷酸的串聯重復序列。它們能夠保持染色體完整性和基因組穩定性[13]。端粒縮短會導致細胞衰老或凋亡[30-31]。由于染色體端粒縮短，繞過細胞凋亡的持續細胞分裂可能導致基因組不穩定和腫瘤發生[32]。端粒酶是一種RNA 依賴性DNA 聚合酶，通過在染色體末端添加TTAGGG 延長端粒[33]。由于TERT 基因催化亞基受到嚴格的轉錄抑制，故大多數正常人體細胞缺乏端粒酶活性。然而在高達90%的人類惡性腫瘤中觀察到TERT 表達和端粒酶激活，TERT 由于在腫瘤發生過程中的關鍵作用以及在腫瘤細胞中的普遍特異性表達而成為理想的抗癌靶點[15]。越來越多的證據表明TERT 參與細胞氧化還原代謝的調節，但TERT 和鐵死亡之間的聯系機制尚未可知。研究表明在小鼠肺上皮細胞中TERT 通過SLC7A11 調節鐵死亡[34]。STRING 數據庫預測結果顯示GPX4 可能與TRET存在相互作用。Erastin 在抑制GPX4 表達造成胃癌細胞鐵死亡的過程中，會抑制端粒酶活性和TERT 蛋白表達量，但其具體作用機制還有待探究。BIBR1532是一種非核苷酸小分子化合物，通過與TERT 活性位點非競爭性結合選擇性抑制端粒酶活性[35]。臨床前研究表明，BIBR1532 在體內和體外均可促進腫瘤細胞生長停滯并增加細胞化學敏感性[36-37]。本研究發現BIBR1532 降低胃癌細胞端粒酶活性、TERT 蛋白表達量以及胃癌細胞增殖能力。有研究表明BIBR1532 會誘導乳腺癌細胞G2 期阻滯，從而促進細胞凋亡[36]。因此筆者認為端粒酶活性降低、TERT蛋白表達量下調可能降低了胃癌細胞增殖能力。與單獨使用Erastin 相比，Erastin 和BIBR1532 聯合應用使得胃癌細胞端粒酶活性和表達量進一步降低，導致胃癌細胞生長增殖能力進一步降低。

綜上所述，GPX4 在胃癌組織中高表達，Erastin抑制胃癌細胞GPX4 表達的同時會降低端粒酶活性和TERT 蛋白表達量，導致細胞生長增殖能力減弱。聯合使用Erastin 和端粒酶抑制劑BIBR1532，會導致胃癌細胞端粒酶活性和TERT 蛋白表達量進一步降低，細胞生長增殖進一步被抑制。