結(jié)直腸癌中PAQR3 的表達(dá)水平及臨床病理意義

孫冉，習(xí)貴富，趙楠，3，楊士民

（1.天津市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院胃腸外科，天津 300100；2.天津醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，天津 300070；3.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院病理科，天津 300052）

近年來，我國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率逐年上升，2016年結(jié)直腸癌已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)新發(fā)病例數(shù)位列第2（40.8 萬(wàn)例）、病死率第4（19.6 萬(wàn)例）的癌種，且呈現(xiàn)年輕化的趨勢(shì)，闡明結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，尋找有效的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)對(duì)提高結(jié)直腸癌生存率具有重要意義[1]。結(jié)直腸癌的發(fā)生是多個(gè)基因共同作用的結(jié)果，抑癌基因功能失活在其中發(fā)揮重要作用[2]。孕激素和脂肪Q3 受體（progestin and adipoQ receptor 3，PAQR3）是近期發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，在乳腺癌、胃癌、肝癌、骨肉瘤、急性白血病等多種惡性腫瘤中低表達(dá)，有研究表明結(jié)腸癌中PAQR3基因失活，但其調(diào)控結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制尚不完全清楚[3]。本研究通過比較65 例結(jié)直腸癌和41例腸道黏膜中PAQR3 表達(dá)，研究其在結(jié)直腸癌和腸道黏膜中的表達(dá)水平及臨床病理意義，并采用TIMER（Tumor IMmune Estimation Resource）等網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(kù)分析PAQR3 表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系及相關(guān)分子通路。

1 材料與方法

1.1 生物信息學(xué)分析 采用TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//cistrome.shinyapps.io/timer/）分析泛癌種PAQR3 在腫瘤組織和正常對(duì)照組織中的表達(dá)差異[4]。為研究PAQR3 表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的影響，采用TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//cistrome.shinyapps.io/timer/）分析結(jié)直腸癌組織內(nèi)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、B 細(xì)胞和CD4+/CD8+T 細(xì)胞浸潤(rùn)與PAQR3表達(dá)水平的關(guān)系[5]。

在cBioPortal 數(shù)據(jù)庫(kù)中（http：//cbioportal.org）[6]，選擇癌癥基因組圖譜結(jié)腸腺癌（The Cancer Genome Atlas-colon adenocarcinoma，TCGA-COAD）數(shù)據(jù)集，通過斯皮爾曼相關(guān)性分析檢測(cè)癌組織中PAQR3 表達(dá)與其他基因表達(dá)的相關(guān)性及P 值。采用R 語(yǔ)言“ggplot2”及“ggrepel”包繪制相關(guān)性分析結(jié)果的火山圖，進(jìn)而使用“l(fā)usterProfiler”、“org.Hs.eg.db”、“enrichplot”包對(duì)PAQR3 和與其相關(guān)性最高的前100 個(gè)基因進(jìn)行了KEGG（Kyoto Gncyclopedia of Genes and Genomes）和GO（Gene Ontology）基因通路富集分析。

1.2組織標(biāo)本 本研究收集天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院2002 年1 月至2005 年12 月65 例臨床病例資料完整且未經(jīng)過放化療的結(jié)直腸癌患者手術(shù)切除標(biāo)本，選取該部分患者的41 例腸道黏膜標(biāo)本作為對(duì)照，并經(jīng)2 位有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師確診均為腺癌，其他病理類型的樣本不選入本研究。65 例結(jié)直腸癌患者年齡為28～83 歲，男性28 例，女性37 例。本研究結(jié)直腸癌臨床分期采用TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)，65 例結(jié)直腸癌患者中，TNMⅠ/Ⅱ期25 例，TNM Ⅲ/Ⅳ期40 例；高分化18 例，中分化27 例，低分化20 例；確診時(shí)有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者37 例，無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者28 例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者31 例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者34 例。隨訪時(shí)間為手術(shù)日期開始至2016 年6 月30 日結(jié)束。

1.3 免疫組化染色 免疫組化采用SP 法染色。將石蠟包埋組織切片4 μm，經(jīng)二甲苯脫蠟，無(wú)水乙醇Ⅰ5 min，無(wú)水乙醇Ⅱ5 min，3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化酶30 min，95%乙醇水化5 min，80%乙醇水化5 min，自來水沖洗5 min，微波修復(fù)10 min，自然冷卻后，自來水洗，PBS 平衡后，用山羊血清封閉30 min，一抗PAQR3（1∶150 稀釋）孵育4℃過夜。次日室溫恢復(fù)1 h 后PBS 洗3 次，加二抗（即用型）孵育1 h，PBS 洗3 次，DAB 顯色，自來水洗，蘇木精復(fù)染核，脫水，中性樹膠封片。PAQR3 為鼠單克隆抗體購(gòu)自Santa 公司，山羊抗小鼠二抗購(gòu)自中杉金橋公司。

1.4 免疫組化染色結(jié)果判讀 免疫組化染色結(jié)果用Mattern 積分法計(jì)算。陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：每例標(biāo)本目標(biāo)組織著色范圍小于10%為0 分，10%～25%為1 分，25%～50%為2 分，50%～100%為3 分。染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：陰性為0 分，淡黃色為1分，深黃色為2 分，棕黃色為3 分。陽(yáng)性細(xì)胞百分率得分和染色強(qiáng)度得分相加，結(jié)果＞3 分為高表達(dá)，≤3 分為低表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 SPSS21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料組間率的差異采用χ2檢驗(yàn)分析，Kaplan-Meier 生存分析檢測(cè)PAQR3 表達(dá)對(duì)65 例結(jié)直腸癌患者生存的影響，以P＜0.05 為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)中結(jié)直腸癌腫瘤組織與對(duì)照組織PAQR3mRNA 表達(dá)的差異 本研究選用TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)比較了多種惡性腫瘤組織與周圍對(duì)照組中PAQR3mRNA 表達(dá)的差異，結(jié)果顯示PAQR3 在膽管癌（cholangiocarcinoma，CHOL）、食管癌（esophageal carcinoma，ESCA）、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSC）、結(jié)腸腺癌（colon adenocarcinoma，COAD）、直腸腺癌（rectal adenocarcinoma，READ）、直腸癌與對(duì)照組織PAQR3 表達(dá)差異具有顯著性（均P＜0.005，圖1）。

2.2 PAQR3 表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的影響 本研究選用TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)分析PAQR3 mRNA表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的影響，顯示結(jié)腸癌PAQR3 表達(dá)與B 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及樹突細(xì)胞等浸潤(rùn)水平呈正相關(guān)（圖2，均P＜0.05）。直腸癌PAQR3 表達(dá)與B 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及樹突細(xì)胞等浸潤(rùn)水平呈正相關(guān)（圖2，均P＜0.05）。

圖2 PAQR3 表達(dá)與結(jié)直腸癌免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平相關(guān)Fig 2 PAQR3 expression was correlated with the level of immune infiltration in colorectal cancer

2.3 結(jié)腸癌PAQR3 共表達(dá)基因及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析 通過Spearman 相關(guān)性分析了TCGA-COAD數(shù)據(jù)集中PAQR3 與其他基因的相關(guān)系數(shù)，其中相關(guān)性最高的前5 個(gè)基因?yàn)槊撗醢占っ福╠eoxycytidine kinase，DCK）、叉頭蛋白N2（forkhead box N2，F(xiàn)OXN2）、MOB 激酶激活因子1A（MOB kinase activator 1A，MOB1A）、高爾基運(yùn)輸1B（golgi transport 1B，GOLT1B）和核孔蛋白54 kD（nucleoporin 54 kD，NUP54）（圖3A）。對(duì)PAQR3 及相關(guān)性最高的前100個(gè)基因進(jìn)行了富集分析，GO 富集分析結(jié)果顯示PAQR3 及相關(guān)分子參與了“蛋白酶體蛋白分解代謝過程”、“蛋白酶體蛋白介導(dǎo)的泛素化依賴蛋白”等生物學(xué)過程，這些分子與“蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶活性”以及“泛素耦聯(lián)酶”活性相關(guān)（圖3B）。KEGG 富集分析結(jié)果顯示PAQR3 及相關(guān)分子參與活躍的信號(hào)通路有“細(xì)胞衰老”、“泛素化介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解”（圖3C）。富集分析結(jié)果表明PAQR3 可能通過影響機(jī)體蛋白質(zhì)合成及修飾過程影響了結(jié)直腸癌代謝過程。

圖3 結(jié)腸癌PAQR3 共表達(dá)基因及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析Fig 3 Enrichment analysis of PAQR3 co-expressed genes and signal transduction pathways in colon cancer

2.4 65 例結(jié)直腸癌與41 例腸道黏膜中PAQR3 表達(dá)的差異 PAQR3 表達(dá)于結(jié)直腸癌和腸道黏膜上皮細(xì)胞漿，41 例腸道黏膜中38 例高表達(dá)PAQR3，3 例低表達(dá)PAQR3，陽(yáng)性率為92.7%；65 例結(jié)直腸癌中32 例高表達(dá)PAQR3，33 例低表達(dá)PAQR3，陽(yáng)性率為49.2%；卡方檢驗(yàn)結(jié)果表明二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4，χ2=21.165，P＜0.001）。

圖4 結(jié)直腸癌與腸道黏膜中PAQR3 表達(dá)的差異Fig 4 Differences in the expression of PAQR3 between colorectal cancer and intestinal mucosa

2.5 65 例結(jié)直腸癌PAQR3 表達(dá)與腫瘤臨床病理特征之間的關(guān)系 與PAQR3 低表達(dá)組相比，PAQR3 高表達(dá)組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率顯著升高（P=0.034）。結(jié)直腸癌PAQR3 低表達(dá)組患者臨床分期多為Ⅲ~Ⅳ期，PAQR3 高表達(dá)組患者多為Ⅰ~Ⅱ期，二者差異具有顯著性（χ2=8.855，P=0.031，表1）。結(jié)直腸癌PAQR3 低表達(dá)組比PAQR3 高表達(dá)組更易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（χ2=3.972，P=0.046，表1）。結(jié)直腸癌PAQR3 低表達(dá)組腫瘤分化程度較低，而PAQR3 高表達(dá)組腫瘤多為高分化，但二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表1）。結(jié)直腸癌中PAQR3 表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小等無(wú)顯著差異。

表1 65 例結(jié)直腸癌PAQR3 高表達(dá)組與低表達(dá)組臨床病理特征比較[n（%）]Tab 1 Comparison of clinical pathological characteristics between the PAQR3 high expression group and low expression group in 65 cases with colorectal cancer[n（%）]

PAQR3 低表達(dá)組和高表達(dá)組總生存時(shí)間分別為（60.524±8.863）個(gè)月和（99.636±8.762）個(gè)月，結(jié)直腸癌PAQR3 低表達(dá)組和高表達(dá)組無(wú)病生存時(shí)間為（54.091±7.692）個(gè)月和（78.031±8.944）個(gè)月。Kaplan-Meier 生存分析結(jié)果顯示PAQR3 高表達(dá)組較PAQR3 低表達(dá)組的總生存時(shí)間和無(wú)病生存時(shí)間長(zhǎng)、預(yù)后好（χ2=10.305，P=0.001，χ2=4.135，P=0.042，圖5）。

圖5 PAQR3 表達(dá)對(duì)65 例結(jié)直腸癌患者生存的影響Fig 5 The impact of PAQR3 expression on the survival of 65 colorectal cancer patients

3 討論

PAQR3 屬于PAQR 家族成員，人PAQR3 基因定位于4 號(hào)染色體（4q21.21），編碼約37 kD 的蛋白，PAQR3 參與調(diào)控能量代謝、細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過程，與惡性腫瘤、糖尿病、創(chuàng)傷愈合等相關(guān)[7-8]。2007 年首次發(fā)現(xiàn)PAQR3 為分布于高爾基體的跨膜蛋白，具有Ⅲ型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)[7-8]。PAQR3 的主要生物學(xué)功能是將細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的B-Raf 和C-Raf 激酶錨定到高爾基體上，引起Raf 激酶空間分布變化，干擾Raf 激酶與其上游活化G 蛋白R(shí)as-GTP 以及下游底物絲裂原活化的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase，MEK）激酶的結(jié)合，從而阻抑其活化信號(hào)的傳遞，阻斷絲裂原信號(hào)Ras/Raf/MEK/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）通路的活化，抑制細(xì)胞增殖[9]。

目前研究發(fā)現(xiàn)PAQR3 基因在乳腺癌、胃癌、肝癌、骨肉瘤、急性白血病等組織中低表達(dá)[10]，提示PAQR3 可能作為抑癌基因參與惡性腫瘤的發(fā)生和演進(jìn)過程。本研究中通過檢測(cè)人結(jié)直腸癌樣本和網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)與腸道黏膜相比結(jié)直腸癌中PAQR3表達(dá)降低，說明PAQR3 功能失活促進(jìn)了結(jié)直腸癌的發(fā)生。同時(shí)，結(jié)直腸癌低表達(dá)提示腫瘤易于淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后不良，說明PAQR3 可作為預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌患者生存的標(biāo)志物。Wang 等[11]在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中發(fā)現(xiàn)PAQR3 基因敲除促進(jìn)APC（min/+）小鼠自發(fā)腸癌的形成。體外實(shí)驗(yàn)表明PAQR3 能負(fù)向調(diào)控表皮生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的EPK 磷酸化及細(xì)胞核內(nèi)β-catenin 而抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞SW-480 的增殖[12]。上述結(jié)果說明PAQR3 在結(jié)腸癌中可能作為一種新的抑癌基因，通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，促進(jìn)腫瘤發(fā)生及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。

惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與腫瘤免疫微環(huán)境（tumorimmune microenvironment，TIME）密切相關(guān)，TIME由免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、腫瘤血管及細(xì)胞外基質(zhì)等多種成分組成[13]。TIME 中包括T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞，CD4+、CD8+T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、NK 細(xì)胞等通過監(jiān)測(cè)局部組織穩(wěn)態(tài)，識(shí)別、清除腫瘤細(xì)胞，發(fā)揮抗腫瘤免疫效應(yīng)，抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展[14]。M2 型巨噬細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）等可抑制腫瘤免疫應(yīng)答，如M2 型巨噬細(xì)胞通過分泌抑制性細(xì)胞因子，抑制免疫反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移[15-16]。腫瘤細(xì)胞可通過多種方式影響腫瘤免疫微環(huán)境組成和免疫細(xì)胞功能，腫瘤細(xì)胞可通過分泌誘導(dǎo)性一氧化氮合酶和酸性纖維蛋白等物質(zhì)抵御免疫效應(yīng)，腫瘤細(xì)胞還可通過分泌、釋放白細(xì)胞介素10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-beta，TGF-β）等細(xì)胞因子和細(xì)胞活性氧等物質(zhì)抑制免疫細(xì)胞活化或促進(jìn)免疫細(xì)胞耗竭，從而抑制腫瘤免疫，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸[14]。本研究發(fā)現(xiàn)PAQR3 高表達(dá)與CD8+T細(xì)胞、B 細(xì)胞等免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)，提示PAQR3低表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌CD8+T 細(xì)胞、B 細(xì)胞浸潤(rùn)，導(dǎo)致腫瘤組織內(nèi)缺乏免疫效應(yīng)細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞逃避免疫微環(huán)境的監(jiān)視和抑制，利于腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。

TGF-β 信號(hào)通路是調(diào)控免疫細(xì)胞功能的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可通過調(diào)節(jié)T 淋巴細(xì)胞來影響惡性腫瘤演進(jìn)。TGF-β 通過活化下游轉(zhuǎn)錄因子T-box express in T cells（TBET）和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子4（signal transducer and activator of transcription，STAT4），抑制幼稚T 淋巴細(xì)胞或通過激活母親DPP同源物1（果蠅）[mothers against DPP homolog 1（Drosophila），SMAD]調(diào)控Treg 形成，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[17]。其次，TGF-β 能促進(jìn)Smad3 和4 與輔助因子ERBB2轉(zhuǎn)導(dǎo)因子（1 transducer of ERBB2，TOB1）作用，抑制CD4+T 細(xì)胞增殖；也可促進(jìn)T 細(xì)胞線粒體內(nèi)的Smad3 和4 磷酸化，干擾能量代謝抑制T 細(xì)胞活性[18]。而且TGF-β 還能夠通過Smad3 選擇性地增強(qiáng)CD279（PD-1）基因轉(zhuǎn)錄，使CD8+T 細(xì)胞PD-1 表達(dá)增加，促進(jìn)CD8+T 細(xì)胞耗竭，促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌進(jìn)展[23]。PAQR3 是TGF-β 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制分子，賁門癌中PAQR3 可通過抑制TGF-β、Smad2 和3 磷酸化，抑制TGF-β/Smad 通路活性[18]。本研究通過生物信息學(xué)分析還發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌中PAQR3 表達(dá)與DCK、FOXN2、MOB1A、GOLT1B、NUP54 等基因關(guān)系密切。敲除小鼠腸道上皮細(xì)胞MOB1A 后，可活化TGF-β 通路，導(dǎo)致腸黏膜穩(wěn)態(tài)失衡[19]。MOB1A 被泛素-蛋白酶體途徑降解后可抑制Hippo 通路，從而促進(jìn)了結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[20]。上述結(jié)果提示結(jié)直腸癌中PAQR3 基因失活導(dǎo)致TGF-β 信號(hào)通路活化，抑制免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和發(fā)揮免疫應(yīng)答，促進(jìn)了結(jié)直腸癌發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，PAQR3 基因功能失活重塑了結(jié)直腸癌免疫微環(huán)境，PAQR3 可作為結(jié)直腸癌患者預(yù)后和免疫治療預(yù)測(cè)的標(biāo)志物。

綜上，結(jié)直腸癌組織中PAQR3 蛋白表達(dá)顯著降低，其低表達(dá)與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移和免疫浸潤(rùn)降低密切相關(guān)，提示抑癌基因PAQR3 功能失活激活了TGF-β 信號(hào)通路，導(dǎo)致局部免疫微環(huán)境重塑和腫瘤免疫抑制，促進(jìn)了結(jié)直腸癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移。