人著絲粒蛋白E 在人腎透明細胞癌中的表達及對細胞增殖的影響

劉芬，李世賓，李曉石

（1.新鄉市中心醫院，新鄉醫學院第四臨床學院病理科，新鄉 453000；2.新鄉市中心醫院，新鄉醫學院第四臨床學院泌尿外科，新鄉 453000）

腎細胞癌（RCC）是較常見的惡性腫瘤之一，包括多種組織病理類型及遺傳相關亞型。腎透明細胞癌（ccRCC）是腎細胞癌中最常見的組織病理類型，占腎惡性腫瘤的80%以上，也占RCC 相關死亡的大部分。局限性和局部進展性RCC 患者的治療方法是手術切除或消融，但晚期患者的治療選擇受到限制[1-2]。近年來，靶向治療對于ccRCC 的治療顯示出巨大優勢，多種靶向治療藥物對于ccRCC 患者的預后具有顯著改善作用[3-4]。然而，靶向治療對ccRCC腫瘤抑制和個體患者的生存有不同的影響，這意味著需要更新的治療靶點來改善患者的預后。

人著絲粒蛋白E（centromere protein E，CENPE）大小為312 kD，是維持穩定的動點與微管連接、保持紡錘體檢查點功能的一個重要分子馬達蛋白[5]。目前發現，CENPE 具有多種細胞生物學功能，如調節動粒組裝、驅動染色體運動等，進而影響細胞分裂[6]。已有研究表明，CENPE 在很多腫瘤中均顯著高表達，如肺癌、乳腺癌、骨肉瘤等，且CENPE 表達與腫瘤患者的不良預后及藥物的抗藥性相關[7-9]。

許多研究表明CENPE 與多種類型腫瘤的發生和發展密切相關。例如，CENPE 與骨肉瘤的發生有關[10]。CENPF 的表達與乳腺癌的臨床病理參數、分子亞型、臨床結果以及內分泌治療的療效有關[11]。雖然CENPE在ccRCC 中的作用尚不明確，但鑒于其在腫瘤中的潛在作用，推測CENPE 與ccRCC 進展相關。

1 材料和方法

1.1 臨床資料 收集2014 年9 月—2021 年8 月新鄉市中心醫院77 例ccRCC 患者手術切除的癌組織及癌旁組織標本，分析其臨床病理資料特征。全部病例均經過病理證實，具有完整的病例資料。收集患者的一般臨床資料，包括年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤分化等。患者平均年齡（52.5±3.75）歲；男性43 例，女性34 例；腫瘤直徑＜4 cm 的34 例，＞4 cm的43 例；腫瘤低分化的38 例，高分化的39 例。

1.2 試劑 CENPE 的抗體為兔抗人單克隆抗體，購自英國abcam 公司（ab133583，abcam，Cambridge），免疫組化稀釋濃度為1∶100，免疫印跡稀釋濃度為1∶1 000；β-肌動蛋白（β-actin）抗體（免疫印跡1∶1 000 稀釋，ab8226，abcam）。免疫組化二步法檢測試劑盒購于北京中衫金橋生物技術有限公司（PV-6001），DAB 顯色試劑盒購自北京中衫金橋生物技術有限公司（ZLI-9018）；CCK-8 試劑盒購自北京碧云天公司。

1.3 方法及免疫組化染色結果的評分標準 ccRCC 的腫瘤及癌旁組織進行福爾馬林固定，常規取材，石蠟包埋，將蠟塊行切片及免疫組化染色，切片二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，行二步法行免疫組化染色，抗體1∶100 稀釋，CENPE 抗體37℃孵育2 h，DAB 染色，蘇木素復染。切片于蔡司顯微鏡下觀察拍照。CENPE 染色評分標準：陽性細胞數<15%為0 分；陽性細胞15%～50%記1 分；陽性細胞50%～80%記2 分；陽性細胞＞80%則為3 分；同時對陽性著色細胞的染色強度進行評分：陰性表達記0 分，弱表達記1 分，中等2 分，強陽性記為3 分；最終計分結果為陽性細胞比例分數加染色強度分數，范圍為0～6 分。分數0～2 分為CENPE 低表達，3～6 分為CENPE 高表達。

1.4 細胞培養及轉染 HTB-47 和CRL-1932 細胞購自美國模式菌種收集中心（ATCC）。shRNA 質粒購自Addgene。HTB-47 和CRL-1932 細胞均于含有10%胎牛血清（FBS，美國Gibco 公司）的RPMI-1640 培養基（美國Gibco 公司）中進行培養。細胞轉染采用脂質體轉染法進行，分別加入質粒或Lipo 2000 和1.5 mL Opti-MEM 培養基，室溫孵育5 min。隨后兩者混合后孵育20 min，加入細胞培養基中，6 h 后換液，24 h 后進行功能實驗。CENPE shRNA靶向序列：AAGAATCACTTGGAGAAACTGCC。

1.5 Western 印跡實驗 利用RIPA 細胞裂解液提取細胞總蛋白，使用BCA 法測量蛋白濃度。總蛋白進行8%SDS-PAGE 電泳，隨后轉膜至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，5%脫脂奶粉進行室溫固定2 h，室溫條件下一抗孵育2 h，隨后Tris-HCL 緩沖液（TBST）洗脫未結合抗體，共洗5 次，每次5 min；隨后室溫山羊抗兔二抗（1∶1 000）孵育45 min，隨后TBST洗脫未結合抗體，共洗5 次，每次5 min，加入ECL增強顯影底物后在曝光儀中檢測信號，所得信號使用Image J 7.0 軟件進行分析。

1.6 實時定量熒光PCR 通過TRIzol 試劑提取細胞內總RNA，并進行兩步法反轉錄，條件為42℃，1 h，cDNA 使用SYBR 熒光探針進行實時定量聚合酶鏈式反應（PCR），并使用GAPDH 作為內參，檢測相關mRNA 的表達水平。實驗結果采用2×δCT 法進行定量。CENPE 正向：5'-CCAAGGCTGTGGCAAACG-3'，反向：5'-GGATTAGGGATTCGGTGGTAC-3'。GAPDH：正向：5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'，反向：5'-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3'。

1.7 CCK-8 實驗 細胞鋪于96 孔板中，進行質粒轉染處理后于48 h 時間點加入20 μL 的CCK-8 試劑（購自北京碧云天公司），37℃培養箱孵育4 h，隨后在450 nm 波長下使用多功能酶標儀檢測其吸光度值。每組實驗設3 個重復，統計結果。

1.8 集落形成實驗 細胞進行質粒轉染處理后于48 h 時間點鋪于6 孔板中，每孔800 個細胞，37℃培養箱培養14 d，隨后使用0.1%的結晶紫染色30 min，使用4%多聚甲醛室溫固定20 min，流水緩慢沖洗，隨后奧林巴斯熒光顯微鏡下觀察拍照，使用Image J 7.0 軟件分析圖片。

1.9 統計學處理 所有細胞實驗重復3 次。使用Graphpad 7.0 軟件（Graphpad software，LaJolla，CA，USA）進行數據分析。采用Spearman 相關分析。細胞實驗中，利用Mann-Whitney U 檢驗進行兩組之間的比較，正態分布的計量數據采用表示，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 生信分析揭示CENPE 在ccRCC組織的表達及與預后的關系 通過GPEIA 數據庫（http：//gepia.cancer-pku.cn/detail.php?gene=CENPE）分析CENPF的mRNA 水平在523 例ccRCC 癌組織及100 例癌旁組織中的差異，發現在癌組織中CENPE 的mRNA顯著上調（圖1A，P<0.05）。生物信息學分析結果證實，ccRCC 患者癌組織CENPE 的表達與患者無病生存期與總生存期顯著相關（圖1B，P=0.035、0.029）。

圖1 CENPE mRNA 水平在ccRCC 中顯著增加并與患者不良預后相關Fig 1 mRNA levels of CENPE were significantly increased in ccRCC and were significantly associated with poor prognosis in patients

2.2 CENPE 蛋白在ccRCC 患者腫瘤組織的表達及與患者臨床病理特征的相關性 免疫組織化學染色檢測結果發現，相對于癌旁組織，CENPE 蛋白在ccRCC 癌組織中呈顯著高表達（圖2）。

CENPE 的表達水平與ccRCC 患者的腫瘤直徑（P=0.021）顯著相關，而與其他臨床特征如年齡（P=0.429）、性別（P=0.670）、腫瘤分化（P=0.575）等無顯著相關性（表1）。

表1 77 例腎透明細胞癌CENPE 表達與臨床病理特征的關系Tab1 Relationships of CENPE and clinicopathologicalcharacteristics in 77 patients with ccRCC

2.3 下調CENPE 蛋白抑制ccRCC 細胞增殖 與對照組shRNA 質粒相比，轉染CENPE 的shRNA 質粒的HTB-47 和CRL-1932 細胞24 h 后，CENPE 的mRNA 水平及蛋白水平均顯著下降（圖3A，P=0.013 8、0.010 9；圖3B，P=0.010 9、0.014 4）。

圖3 CENPE 的shRNA 在腎透明細胞癌細胞系HTB-47 和CRL-1932 中的沉默效率Fig 3 shRNA silencing efficiency of CENPE in ccRCC cell lines HTB-47and CRL-1932

集落形成實驗結果表明，在HTB-47 和CRL-1932 細胞中，CENPE 蛋白的下調會導致集落數量下降（圖4A，P=0.013 5、0.015 4）。CCK-8 實驗結果表明，HTB-47 和CRL-1932 細胞中，CENPE 蛋白敲低后導致450 nm 處吸光度值顯著下調（圖4B，P=0.009 1、0.013 3）。

圖4 CENPE 下調抑制腎透明細胞癌細胞增殖Fig 4 CENPE down-regulation inhibited the proliferation of ccRCC cell

3 討論

RCC 是一種常見的泌尿系統惡性腫瘤，在我國居第2 位，僅次于膀胱癌，過去近30 年RCC 發病率在逐年上升[12]。而ccRCC 是其中主要的組織學類型[3]。目前RCC 的治療仍以根治性手術為主，但術后復發有一定比例，且放、化療效果不佳[3]。研究顯示，腫瘤分子靶向治療的出現，為解決這一問題提供了可能[4]。PBRM1、BAP1 和SETD2 是其中常見的高頻突變基因，這些突變基因的檢出往往與不同的預后和臨床療效相關[13]。多種靶向治療藥物，如舒尼替尼、培唑帕尼、卡博替尼等，在治療晚期ccRCC 中發揮一定的作用。然而為了進一步提高生存率，仍需開發更有效的治療靶點。本研究發現并證實了CENPF在ccRCC組織中的高表達，并與患者的不良預后密切相關，因此可作為一個潛在的治療靶點。

在本研究中，發現CENPE 在ccRCC 中的異常表達，表明其與ccRCC 的進展密切相關。進一步利用兩種ccRCC 的細胞系開展體外實驗。通過CENPE的shRNA 質粒轉染的手段，下調CENPE，并通過集落形成實驗和CCK-8 實驗檢測對細胞增殖的影響，結果表明CENPE 的下調顯著抑制ccRCC 細胞增殖。因此，本研究初步揭示了CENPE 在ccRCC 中的功能。CENPE 也可作為一種新的生物標志物和視網膜母細胞瘤的潛在治療靶點[7]。另有研究表明，CENPE 抑制導致髓母細胞瘤細胞有絲分裂突變和DNA 損傷[9]。CENPE 的表達也與骨肉瘤和肺癌的進展有關[10]。這些結果均表明CENPE 可作為腫瘤的潛在治療靶點。

染色體的非整倍性與有絲分裂的異常往往會導致腫瘤的發生。CENPE 基因敲除小鼠的腫瘤發生概率顯著增加[15]。而CENPE 定位在著絲粒上，與染色體功能和有絲分裂進程均密切相關[15]。有研究證實，CENPE 也參與了有絲分裂后期著絲粒對于微管的捕捉。CENPE 蛋白是一種重要的著絲粒定位的蛋白，其主要存在于著絲粒外部，是有絲分裂中期所必需的蛋白。多項研究證實CENPE 的表達與定位均受到嚴格控制。也有研究證實，CENPE 在紡錘體檢查點組裝與行使功能的機制中至關重要[16]。CENPF 在著絲粒上的定位受到多種因素的影響，如受到著絲粒組裝的上游蛋白的影響。CENPE 主要通過自身結構改變影響BubR1 蛋白的功能，因而影響紡錘體檢查點[17]。CENPE 蛋白在細胞的有絲分裂S期高表達，而在細胞間期基本不表達，進一步揭示其在有絲分裂與腫瘤進展中的重要作用[18]。然而，CENPE 對于腫瘤，特別是ccRCC 進展的影響及分子機制尚需進一步研究。

綜上，本研究首次發現CENPE 蛋白在ccRCC 中顯著高表達，并與患者的無病生存期與總生存期顯著相關。CENPE 表達水平與ccRCC 患者的腫瘤直徑密切相關，且下調CENPE 能夠抑制ccRCC 的細胞增殖。因此證實CENPE 對ccRCC 進展的影響，表明其可作為ccRCC 治療的潛在靶點。