多囊卵巢綜合征關鍵基因的篩選及其與疾病進展和預后的相關性分析

孫奎奎，楊微微，王文靖，郝穎新，郭波，任晨春，鞠明艷

（1.天津醫科大學研究生院，天津 300070；2.天津市中心婦產科醫院檢驗科，天津 300100）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是育齡婦女最常見的婦科內分泌疾病之一，臨床表現多為排卵障礙/無排卵、多囊卵巢、高雄激素血癥[1]，臨床發病率可達4%～21%[2]。PCOS 不僅影響生殖內分泌功能，還可能增加代謝綜合征、糖尿病、心血管疾病等并發癥的長期風險，嚴重威脅女性健康[3]。此外，伴隨嚴重的月經減少、閉經而發生的雌激素水平的破壞也會增加子宮內膜增生和子宮內膜癌（UCEC）的發生風險[4]。PCOS 是由遺傳、內分泌、環境等多種因素引起的[5]，然而，PCOS 的發病和進展機制尚不清楚[6]。因此，臨床醫生必須及時掌握預測、診斷和評估PCOS 患者康復狀態的方法，以控制病情進展，改善預后。

近幾年，生物信息學分析和公共數據庫的蓬勃發展[7]，為發現PCOS 潛在的分子靶點和制定新的診斷治療策略提供了基礎。在本研究中，筆者使用生物信息學工具分析了基因表達綜合（gene expression om nibus，GEO）數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中的數據集，以確定PCOS 患者和匹配對照組之間的差異表達基因，為進一步的臨床應用和實驗研究提供客觀依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 從GEO 數據庫[7]中檢索和下載GSE34526 數據，從TCGA 數據庫中下載卵巢癌（ovarian cancer，OC）、乳腺癌（breast cancer，BRCA）、子宮內膜癌UCEC 的臨床和表達數據[8]，分析差異基因對女性腫瘤的影響。

1.2 研究方法

1.2.1 差異基因分析 使用R/Bioconductor 的軟件及Limma 包分析基因表達數據[9]。對GSE34526 數據集中的7 例PCOS 患者和3 例對照樣本的基因表達進行limma 歸一化，分析差異表達基因，校正后P＜0.05 和|log2FC|＞1 被認為差異有統計學意義。使用ggplot2 包繪制火山圖，pheatmap 包繪制熱圖。

1.2.2 KEGG 和GO 富集分析 使用R 軟件中的clusterProfiler 4.4.4 包[10]對差異基因進行京都基因與基因組百科全書（KEGG，http：//www.kegg.jp/）和基因本體論（GO，富集分析http：//www.geneontology.org）[11-12]，校正P＜0.05 為差異有統計學意義。并將結果可視化，利用ggplot2 包繪制KEGG 氣泡圖和GO條形圖。

1.2.3 單樣本基因富集分析（single-sample gene set enrichment analysis，ssGSEA） 為了進一步研究PCOS 的炎癥微環境，從表達數據推斷免疫細胞浸潤的相對水平，本研究整合了免疫相關變量的方法進行計算。使用這種方法，將PCOS 表達數據轉換為標準化分數，以表示特定免疫細胞類型的相對豐度。為了在免疫圖譜上可視化免疫表型，將來自PCOS患者和對照組的10 個樣本分類為免疫“熱”和“冷”位點，根據其評分進行比較。使用ssGSEA 評分[13]量化每個PCOS 樣品中29 個免疫信號的富集水平，收集免疫細胞基因集，進行抗腫瘤免疫和促腫瘤抑制評分[14]。免疫評分通過R 包gsva 的“ssgsea”方法進行富集，熱圖和線性圖由pheatmap 和ggplot2 包繪制。

1.2.4 人類蛋白質圖譜 利用人類蛋白質圖譜數據庫在（The Human Protein Atlas，HPA）（https：//www.proteinatlas.org/）收集腫瘤組織和正常組織的蛋白表達譜[15]，分析差異基因在BRCA、OC 和UCEC 中的蛋白表達水平。

1.2.5 生存分析 采用Kaplan-Meier 圖分析差異基因在BRCA、OC 及UCEC 預后中的表達，利用survival和survivalROC 軟件包，基于受試者工作特征（ROC）曲線分析3 年、5 年和10 年癌癥生存率。

2 結果

2.1 與PCOS 患者相關的差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）的鑒定 結合TCGA女性癌癥臨床數據和GEO 數據庫RNA 陣列數據的分析，篩選PCOS 潛在標志物（圖1A）。最終共篩選出16 個校正P 值有顯著差異的基因，分別為CD163、MRC1、MAFB、EPB41L3、ITGAM、FCGR1B、TGFBI、EMB、HMOX1、CD93、LILRB3、VSIG4、HLADPA1、SIGLEC10、HAS2、MMP9（圖1B）。其中，HAS2在對照組中表達，而在PCOS 患者中不表達；與PCOS進展高度相關的基因MMP9 在PCOS組中高表達；在PCOS組中，巨噬細胞標志物MRC1 高表達（圖1C）。差異表達基因的相關性分析表明，ITGAM 和HMOX1 與其他基因具有強相關性（P＜0.05，圖1D）。

2.2 ITGAM 和HMOX1 是與PCOS 患者疾病進展相關的關鍵基因 對上述16 個DEGs 分別進行GO和KEGG 富集分析。KEGG 通路富集結果顯示細胞黏附分子（cell adhesion molecules，CAMs）、補體和凝血級聯與PCOS 的進展相關（圖2A）。GO 富集結果顯示為生物學進程中上皮細胞遷移和創面炎癥反應的正向調控（圖2B），尤其是MHC Ⅱ類受體活性和免疫受體活性在GO 功能分析中富集。這些失調的信號通路可能導致PCOS 患者卵巢功能受損。最終在這些通路中富集得到ITGAM 和HMOX1 兩基因，二者在本研究中被定義為與PCOS 進展高度相關的基因。

圖2 DEGs 的功能和通路富集情況Fig 2 Functional and pathway enrichment of DEGs

2.3 ITGAM、HMOX1 與PCOS 患者免疫浸潤異質性的相關性 在PCOS 患者中，免疫抑制細胞類型如骨髓來源的抑制性細胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）、中性粒細胞、巨噬細胞、漿細胞樣樹突狀細胞和調節性T 細胞評分較高（圖3A）。免疫細胞分為促腫瘤抑制和抗腫瘤免疫，PCOS組的樣本更接近于促腫瘤抑制（圖3B）。ITGAM 和HMOX1基因的表達相關性分析顯示，ITGAM 與HMOX1 表達呈正相關（r=0.69，P=0.028，圖3C）。

圖3 ITGAM、HMOX1 與PCOS 免疫細胞的相關性分析Fig 3 Correlation analysis of ITGAM，HMOX1 and immune cells in PCOS

ITGAM、HMOX1 與促炎免疫細胞的相關性分析顯示，ITGAM 與巨噬細胞（r=0.86，P=0.001）、MD－SCs（r=0.93，P＜0.001）、中性粒細胞（r=0.63，P=0.051）、漿細胞樣樹突狀細胞（r=0.65，P=0.04）、調節性T 細胞（r=0.94，P＜0.001）呈正相關。HMOX1 與巨噬細胞（r=0.92，P＜0.001）、MDSCs（r=0.87，P= 0.001）、中性粒細胞（r=0.91，P＜0.001）、漿細胞樣樹突狀細胞（r=0.92，P＜0.001）、調節性T 細胞（r=0.86，P=0.001）呈正相關（圖4）。

圖4 ITGAM、HMOX1 與促炎免疫細胞的相關性分析Fig 4 Correlation analysis of ITGAM，HMOX1 and pro-inflammatory immune cells

2.4 差異基因在BRCA、OC 和UCEC 中的蛋白表達水平 免疫組織化學結果顯示，在BRCA、OC 和UCEC 中，ITGAM 和HMOX1 蛋白水平較高，而正常對照組中無表達（圖5）。

圖5 BRCA、OC 和UCEC 3 種腫瘤中ITGAM 和HMOX1 蛋白表達情況Fig 5 ITGAM and HMOX1 protein expression in BRCA，OC and UCEC tumors

2.5 ITGAM 和HMOX1 在女性腫瘤患者中的預后分析 對TCGA 數據庫分析表明，作為不良預后因素，ITGAM 顯著影響OC 患者的生存（P=0.004 6），而在BRCA 和UCEC 中影響不顯著，HMOX1 對3 種腫瘤的預后無明顯影響，但有不良預后因素的趨勢（圖6A）。ITGAM 與HMOX1 對腫瘤患者3、5、10 年生存率的影響的分析結果表明，ITGAM 在OC中生存預測率ROC 曲線下面積（AUC）均＞0.5，其中10 年AUC ＞0.59。HMOX1 在BRCA、OC 和UCEC 中的3 年AUC＞0.5，其中在BRCA 中的10年AUC＞0.6（圖6B）。

在BRCA 中，ITGAM+HMOX1 在3、5、10 年聯合預測的ROC 曲線下AUC 分別為0.51、0.498、0.606，在OC 中分別為0.563、0.537、0.481，在UCEC中分別為0.556、0.479、0.472（圖7A）。用TIME2.0 可視化預測MDSCs+ITGAM+HMOX1 對腫瘤患者生存的影響，分析結果顯示，在大多數腫瘤中，MDSCs 是預后不良的因素（圖7B），其中BRCA 和UCEC 中為顯著不良預后（P＜0.05），OC 不顯著（P＞0.05）。

圖7 ITGAM+HMOX1 聯合預測對腫瘤患者生存率的影響Fig 7 The impact of combined ITGAM+HMOX1 prediction on survival of patients with tumor

3 討論

近年來，多項研究報道了PCOS 患者的潛在標志物和核心通路[16-18]。然而到目前為止，還沒有明確的生物標志物有效評價PCOS 的進展和預后。在本研究中，筆者使用生物信息學分析來識別PCOS 的診斷標志物，通過GSE34526 隊列篩選出16 個DEGs，GO 和KEGG 分析發現ITGAM 和HMOX1 在CAMs、補體和凝血級聯、上皮細胞遷移和炎癥反應的正向調控相關通路中顯著富集，是與PCOS 患者進展高度相關的關鍵基因。

慢性炎癥在PCOS 的發病過程中具有重要作用，慢性炎癥導致內皮功能障礙和氧化應激增加[19]，抗炎治療已被證實可有效減輕顆粒細胞凋亡，改善卵巢功能[20]。本研究鑒定的關鍵基因ITGAM 編碼CD11b 蛋白，屬于整合素家族，是介導細胞間和細胞外基質黏附的重要跨膜蛋白家族[21]。研究證實，ITGAM 可促進白細胞跨內皮細胞遷移，破壞內皮屏障功能[22]。HMOX1 是血紅素分解代謝的關鍵酶，其分解代謝產物CO 可調節AMPK、VEGF、NF-κB 等炎癥信號通路，影響多種細胞因子的產生[23]。為了研究PCOS 中的炎癥微環境，本研究通過ssGSEA 分析數據集GSE34526 的免疫細胞浸潤，ITGAM 和HMOX1 的表達符合顯著協同共表達的特征，且二者的表達與促炎免疫細胞亞型評分呈正相關，說明在PCOS 的進展中，ITGAM 和HMOX1 的高表達可能起到促進炎癥發生的作用。

既往研究顯示，由于PCOS 患者存在代謝和內分泌異常，容易發展成為某些腫瘤，如BRCA、OC 和UCEC[16，24]。多項研究發現，高水平的HMOX1 與多種婦科腫瘤相關[25-26]。MDSCs 可以抑制機體免疫細胞發揮正常的穩態和適應性免疫功能，既往對MDSCs的研究闡明了它與腫瘤發生和發展的密切關系。例如，Sun 等[27]分析了結腸癌患者腫瘤組織中MDSCs促進遠處轉移的作用。本研究結果顯示，ITGAM 和HMOX1 基因的水平與免疫抑制細胞（如MDSCs）的評分有更強的相關性。在PCOS組中，促炎細胞較對照組高表達，這意味著在PCOS 的發生、發展中，免疫細胞可能發揮著促炎，而不是抑炎作用，存在一些機制待探索。對促腫瘤抑制和抗腫瘤免疫分析結果顯示，對照組的3 個樣本更相關于抗腫瘤免疫，而PCOS組的7 個樣本更相關于促腫瘤抑制，即促炎反應，表明PCOS 患者的卵巢顆粒細胞可能處于免疫紊亂的微環境中，反過來加速PCOS 向多種腫瘤的演變。此外，ITGAM 和HMOX1 激活異常與腫瘤患者預后不良有關。聯合ITGAM+HMOX1 的表達對3 種腫瘤3 年總體生存率有較好的預測準確性（AUC＞0.5），這對PCOS 不良進展的早期篩查具有一定的指導作用。因此推測，ITGAM 和HMOX1 可能是PCOS 發展為腫瘤的新的風險標志物，但這一假設尚需要進一步的研究來驗證。

綜上所述，ITGAM 和HMOX1 在PCOS 中的表達升高可能代表炎癥異常狀態或機體的代償性保護機制，對疾病的早期篩查具有一定的指導作用。當發生失代償時，高水平的ITGAM 和HMOX1 可能意味著不良結果，發展為腫瘤的風險更大。有針對性的治療方案有望降低ITGAM 和HMOX1 的表達，二者的水平可作為治療效果的評價因素。本研究對PCOS 的診斷和治療可能有一定的臨床意義。