基于生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析C/EBPα靶基因及其在急性髓系白血病中的潛在機(jī)制

章瑞琪，郭 虹

（麗水學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 麗水 323000）

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一種骨髓和外周血髓系細(xì)胞發(fā)育受阻的惡性腫瘤，主要表現(xiàn)為髓系原始細(xì)胞增殖不受控制，骨髓分化受抑制，從而抑制正常血細(xì)胞的發(fā)育。該病占白血病總發(fā)病數(shù)的50%以上，其中在AML 亞型之中M2與M5的發(fā)病率較高［1］。而AML的發(fā)生、發(fā)展、治療和預(yù)后與轉(zhuǎn)錄因子CCAAT 增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α（CCAAT/enhancer binding protein alpha，C/EBPα）的異常表達(dá)密切相關(guān)。在中國AML成年患者中，約有11.7%患者的CEBPA基因突變陽性［2］，這干擾了CEBPA基因的正常表達(dá)，阻礙了其功能的發(fā)揮。而正常表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα因含有堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域，可以通過形成二聚體、與目標(biāo)基因的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合、調(diào)控轉(zhuǎn)錄激活等手段發(fā)揮其對(duì)維持血液系統(tǒng)穩(wěn)定的功能：維持造血干細(xì)胞的自我更新、支持粒細(xì)胞的分化，并參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期與新陳代謝過程。

為進(jìn)一步闡釋C/EBPα 的異常表達(dá)與AML 間的作用機(jī)制，筆者利用生物信息學(xué)技術(shù)探究C/EBPα的靶基因，并通過分析靶基因的功能與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)一步了解C/EBPα 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，且重點(diǎn)揭示靶基因信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（JAK-STAT信號(hào)通路、MAPK通路、PI3K-Akt通路），總結(jié)它們對(duì)維持正常血液系統(tǒng)的功能和在AML 發(fā)生、發(fā)展及治療過程中的作用與影響，揭開C/EBPα通過靶基因信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在AML 中的潛在機(jī)制，并進(jìn)而為AML臨床治療與預(yù)后提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取

通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫（http：//www.genecards.org）檢索得到107個(gè)與AML相關(guān)的基因，將其作為候選預(yù)測(cè)靶基因。在基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中檢索得到包含敲除Cebpa基因的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的GSE146288、GSE153622、GSE71687數(shù)據(jù)集。

1.2 篩選差異表達(dá)基因

運(yùn)用GEO 數(shù)據(jù)庫提供的GEO2R 分析工具對(duì)上述107 個(gè)候選預(yù)測(cè)靶基因的表達(dá)量進(jìn)行綜合分析，篩選Cebpa敲除前后的差異表達(dá)基因，得出其在Cebpa基因敲除前后的比較結(jié)果。

1.3 差異基因的GO功能與KEGG富集分析

為進(jìn)一步解釋差異表達(dá)基因在AML發(fā)病過程中發(fā)揮的作用，對(duì)C/EBPα的42個(gè)差異表達(dá)靶基因進(jìn)行分析。借助DAVID 數(shù)據(jù)庫綜合分析工具（http：//david.ncifcrf.gov）進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）富集分析、京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，篩選顯著差異的數(shù)據(jù)（P＜0.05），探索差異基因潛在影響的功能與通路。

1.4 C/EBPα 與信號(hào)通路中差異表達(dá)基因的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)

利用STRING 數(shù)據(jù)庫（https：//cn.string-db.org/）分析調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI），對(duì)KEGG 富集分析結(jié)果中的JAK-STAT信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路與PI3K-Akt 信號(hào)通路中所包含的基因進(jìn)行分析，構(gòu)建其與C/EBPα之間的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 篩選差異表達(dá)基因結(jié)果

運(yùn)用GEO2R分析工具對(duì)上述107個(gè)候選預(yù)測(cè)靶基因的表達(dá)量進(jìn)行綜合分析，得出其在Cebpa基因敲除前后的比較結(jié)果（見表1），將表達(dá)量隨Cebpa基因敲除而下降的基因作為預(yù)測(cè)靶基因，共42個(gè)，并對(duì)這些差異表達(dá)基因開展深入研究。

表1 Cebpa基因敲除后AML相關(guān)基因表達(dá)

2.2 差異基因的GO功能富集

借助DAVID 綜合分析工具對(duì)C/EBPα的42個(gè)差異表達(dá)靶基因進(jìn)行GO富集分析，篩選顯著差異的數(shù)據(jù)（P＜0.05），得到GO 富集分析結(jié)果：主要富集于26個(gè)基因功能，按生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能3類基因功能分類，分類結(jié)果如圖1所示。

圖1 C/EBPα預(yù)測(cè)靶基因的GO功能富集分析

由觀察分析結(jié)果可知：在生物學(xué)過程分類中，差異基因主要富集于RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、造血、基因表達(dá)的正向調(diào)控等。在細(xì)胞組分分類中，差異基因主要富集于細(xì)胞核、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、染色質(zhì)等。在分子功能分類中，差異基因主要富集于蛋白質(zhì)結(jié)合、染色質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、DNA結(jié)合等。

2.3 差異基因的KEGG通路分析

在GO功能富集分析的基礎(chǔ)上，利用DAVID綜合分析工具進(jìn)行KEGG富集分析，篩選差異顯著的數(shù)據(jù)（P＜0.05），得到KEGG 富集分析結(jié)果，結(jié)果如圖2所示：差異基因主要富集于癌癥的通路、急性髓性白血病、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、癌癥中的微小RNA、慢性粒細(xì)胞白血病、PI3K-Akt 信號(hào)通路、JAKSTAT信號(hào)通路、乙型肝炎、造血細(xì)胞譜系、MAPK信號(hào)通路。差異基因在癌癥的通路中富集最多，共有15 個(gè)基因富集于此通路。借助STRING 在線數(shù)據(jù)庫，繪制PI3K-Akt 信號(hào)通路、JAK-STAT信號(hào)通路與MAPK信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果如圖3所示。

圖2 C/EBPα預(yù)測(cè)靶基因的KEGG信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)富集分析

圖3 KEGG信號(hào)通路的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)

2.4 C/EBPα與信號(hào)通路的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)

分別將JAK-STAT信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路與PI3K-Akt 信號(hào)通路所包含的蛋白基因?qū)隨TRING在線數(shù)據(jù)庫，獲取上述通路中所包含差異基因與C/EBPα的相互作用網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果如圖4所示：C/EBPα與JAK-STAT信號(hào)通路所包含的差異基因間共有6 條相互作用關(guān)系；C/EBPα 與MAPK 信號(hào)通路所包含的差異基因間共有6條相互作用關(guān)系；C/EBPα 與PI3K-Akt 信號(hào)通路所包含的差異基因間共有5條相互作用關(guān)系。

圖4 C/EBPα與MAPK、JAK-STAT及PI3K-Akt信號(hào)通路的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)

3 討論

轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα 的異常表達(dá)對(duì)AML 的發(fā)病及預(yù)后產(chǎn)生重要影響，研究表明C/EBPα能夠調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞的細(xì)胞周期，促進(jìn)中性粒細(xì)胞的分化，對(duì)骨髓發(fā)育起著重要作用。大部分AML患者的C/EBPα 表達(dá)量下降，但C/EBPα 不同的突變形式影響著AML 患者的預(yù)后，C/EBPα 單突變的AML 患者往往預(yù)后較差［3］，而C/EBPα雙突變的AML患者的死亡率較低，往往預(yù)后較好［4］。這說明C/EBPα的不同表達(dá)會(huì)對(duì)AML的發(fā)病與預(yù)后產(chǎn)生不同的影響，借助生物信息學(xué)技術(shù)，研究C/EBPα 靶基因功能及其信號(hào)通路，有利于進(jìn)一步揭示AML 的發(fā)病機(jī)理，同時(shí)為臨床開發(fā)針對(duì)C/EBPα靶點(diǎn)的免疫治療藥物提供理論支持。

本研究主要運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)，在GEO 數(shù)據(jù)庫中篩選敲除Cebpa基因的實(shí)驗(yàn)組及正常造血干細(xì)胞間的差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因共86 個(gè)，其中共有42 個(gè)基因隨Cebpa基因的敲除而表達(dá)下降，將其作為預(yù)測(cè)靶基因進(jìn)行了GO 功能分析和KEGG 通路富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些基因在RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、造血、基因表達(dá)的正向調(diào)控等功能上富集，并且很可能通過JAK-STAT信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路及PI3K-Akt信號(hào)通路發(fā)揮作用。不僅如此，我們還證明了C/EBPα 與JAK-STAT 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路中所包含的差異表達(dá)基因有互相作用，提示C/EBPα 功能的發(fā)揮與上述3 條通路的信號(hào)傳導(dǎo)具有密切聯(lián)系，推測(cè)轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα可能通過JAK-STAT 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路的傳導(dǎo)對(duì)急性髓系白血病的發(fā)病與預(yù)后產(chǎn)生一定影響。

已有研究已論證：JAK-STAT信號(hào)通路在非典型C/EBPα雙突變的AML患者中會(huì)被異常激活，破壞其原有抗腫瘤作用，使得穩(wěn)態(tài)失衡，進(jìn)而加劇AML患者的病情發(fā)展［5］；MAPK信號(hào)通路主要包括MEK1/2-ERK1/2 通路、JNKs 通路、p38 通路及MEK5-ERK5-MEF2C 通路4 類信號(hào)通路，在調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期方面發(fā)揮著重要作用［6-8］，其中MEK1/2-ERK1/2 通路活性的增強(qiáng)，會(huì)下調(diào)C/EBPα 的表達(dá)量，從而抑制粒細(xì)胞分化，進(jìn)而誘導(dǎo)AML 的發(fā)生［9-10］，而MEK5-ERK5-MEF2C通路也能夠通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα 與C/EBPβ來引導(dǎo)髓系分化［11］；PI3K-Akt 信號(hào)通路能夠控制C/EBPα 的磷酸化，以此介導(dǎo)骨髓細(xì)胞正常發(fā)育［12］，而該通路的過度激活往往會(huì)導(dǎo)致AML 細(xì)胞不受控制的增殖［13］。這些論據(jù)均說明C/EBPα 的異常表達(dá)對(duì)AML患者的影響與JAK-STAT信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路的傳導(dǎo)密不可分。

綜上所述，本研究篩選出與C/EBPα表達(dá)相關(guān)的差異基因，并分析所述基因的功能及其相關(guān)信號(hào)通路，研究結(jié)果有助于探索尋求臨床治療AML的免疫靶點(diǎn)，為揭示AML 發(fā)生發(fā)展過程提供理論基礎(chǔ)。