基于刺突蛋白（S）和核衣殼蛋白（N）的冠狀病毒進(jìn)化關(guān)系分析

任青燕，陸子鑫，涂盈穎，韋 力，喬 芬

（麗水學(xué)院生態(tài)學(xué)院，浙江 麗水 323000）

冠狀病毒（Coronavirus）是一種單鏈RNA 病毒，具有球形顆粒和包膜結(jié)構(gòu)，其基因組大小為27～32 kb［1-2］，在物種分類中，冠狀病毒屬于套式病毒目（Nidovirales）冠狀病毒亞目（Cornidovirineae）冠狀病毒科（Coronaviridae）［3］。2018 年國(guó)際病毒學(xué)分類委員會(huì)將冠狀病毒科分成勒托病毒亞科（Letovirinae）和正冠狀病毒亞科（Orthocoronavirinae）兩個(gè)亞科［4］。勒托病毒亞科僅包含一個(gè)屬，即甲勒托病毒屬（Alphaletovirus）。正冠狀病毒亞科基于基因型和血清學(xué)則可分為4個(gè)屬，即α、β、γ和δ冠狀病毒屬［5-6］，其中α、β冠狀病毒屬病毒主要感染哺乳動(dòng)物和人，γ和δ冠狀病毒屬病毒主要感染禽類和豬［1，7］。冠狀病毒的宿主范圍很廣，可以通過(guò)動(dòng)物跨物種感染人類，甚至導(dǎo)致人際傳播［8-9］。冠狀病毒具有較強(qiáng)的傳染性，且致死率高［10］。經(jīng)過(guò)科學(xué)家在電子顯微鏡下的觀察以及結(jié)合基因組測(cè)序結(jié)果，確認(rèn)新型冠狀病毒感染（corona virus disease 2019，2019-nCoV，簡(jiǎn)稱 “新冠感染” ）為由新型冠狀病毒感染引起的急性呼吸道傳染?。?1］。由于該病毒與SARS-CoV 具有較高的相似性，都屬于β冠狀病毒屬，與SARS-CoV 是姊妹病毒，對(duì)人類的健康造成重大威脅，國(guó)際病毒命名委員會(huì)將其改命名為SARS-CoV-2［12］，因序列信息注釋中使用的為2019-nCoV，所以本文使用2019-nCoV。除2019-nCoV 外，目前已發(fā)現(xiàn)能感染人的冠狀病毒有6 種，分別是屬于α-CoV 的HCoV-229E 和HCoV-NL63，屬于β-CoV 的HCoV-OC43、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV［13］。近10多年來(lái)，由冠狀病毒引起的烈性傳染病已經(jīng)嚴(yán)重危害到人類健康，針對(duì)冠狀病毒的預(yù)防及研究已然成為全世界必須重視的工作。新型冠狀病毒具有傳播速率快、范圍廣、傳染性強(qiáng)、易感性強(qiáng)等特點(diǎn)［14］。新型冠狀病毒感染的臨床表現(xiàn)以發(fā)熱、乏力、干咳為主，少數(shù)伴有鼻塞、流鼻涕、咽痛、惡心、腹瀉等癥狀。重癥患者發(fā)病一周后常有呼吸困難的癥狀，并迅速發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征、敗血癥、感染性休克、代謝性酸中毒和凝血功能障礙，部分患者甚至死于多器官功能衰竭［3，15］。由于新冠感染患者眾多，對(duì)于患者的康復(fù)治療儼然成為當(dāng)今社會(huì)棘手的問(wèn)題。對(duì)于新冠感染的治療，臨床上可以考慮借鑒非典型肺炎和中東呼吸綜合征的治療方案。中草藥治療體現(xiàn)出一定優(yōu)勢(shì)：早期干預(yù)、阻斷病程、減輕癥狀、縮短治療時(shí)間、減少并發(fā)癥、減少大劑量激素引起的毒副作用［16］。

冠狀病毒含有30 kb大小的基因組和4種編碼結(jié)構(gòu)蛋白，分別為刺突蛋白（S）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）及核衣殼蛋白（N）［10］。通常有一些小的開(kāi)放讀碼框（ORFs）存在于結(jié)構(gòu)蛋白之間。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證明，雖然某些ORFs對(duì)病毒復(fù)制不是必需的，但與病毒的致病性存在聯(lián)系，同時(shí)還可以決定病毒的種群特異性［2］。因此，選擇冠狀病毒中合適的蛋白序列進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建和分析是非常有必要的。

冠狀病毒的S蛋白由1 160～1 400個(gè)氨基酸組成，包括21～35 個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。S 蛋白以三聚體的形態(tài)在病毒表面形成特殊的皇冠結(jié)構(gòu)，冠狀病毒因此而得名［7］。S 蛋白的作用是負(fù)責(zé)結(jié)合病毒受體、介導(dǎo)宿主細(xì)胞的融合以及誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，是一種重要的毒力蛋白［17］。S 蛋白由S基因編碼，S基因突變能力較強(qiáng)，是毒株毒力的指征性基因，其突變和重組可能會(huì)影響冠狀病毒的毒力，進(jìn)而產(chǎn)生新的毒株。同時(shí)S蛋白也是新型冠狀病毒與人類細(xì)胞受體ACE2結(jié)合的關(guān)鍵，在病毒侵襲和感染人體的過(guò)程中起到關(guān)鍵作用［18］。冠狀病毒N 蛋白是指核衣殼蛋白，與病毒基因組RNA互相纏繞形成病毒核衣殼［19］。N 蛋白被N基因編碼，在病毒粒子組裝過(guò)程中起到?jīng)Q定性作用，是一種重要的結(jié)構(gòu)蛋白［20］。N 蛋白具有增強(qiáng)病毒基因組轉(zhuǎn)錄、在病毒組裝過(guò)程中與其他蛋白質(zhì)結(jié)合、通過(guò)破壞各種細(xì)胞活動(dòng)而對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒性等不同特征［21］，并且可刺激宿主產(chǎn)生具有高親和力但沒(méi)有中和活性的抗體。在CoV的結(jié)構(gòu)蛋白中，N蛋白是最保守和最穩(wěn)定的蛋白［22］。對(duì)于冠狀病毒而言，S 蛋白影響其毒力且易突變，而N 蛋白決定其結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定。故選擇冠狀病毒S、N蛋白序列作為構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)的主要數(shù)據(jù)。

目前，大部分冠狀病毒的蛋白序列信息已被收錄在世界主要的蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank 中。本研究通過(guò)對(duì)冠狀病毒蛋白序列進(jìn)行篩選和整理，運(yùn)用MEGA7.0 軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)并分析其進(jìn)化關(guān)系，同時(shí)比較S、N 蛋白構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)的區(qū)別，為認(rèn)識(shí)和研究冠狀病毒打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)的來(lái)源與蛋白選擇

本文所有冠狀病毒蛋白序列信息均來(lái)自于GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/）。從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選冠狀病毒S、N蛋白序列各30條，序列包括來(lái)自寄主為人、豬、牛、羊、犬、貓、鼠、禽、蝙蝠、駱駝的冠狀病毒S蛋白和N蛋白，包括2株2019-nCoV序列和28株具有代表性的α、β、γ和δ冠狀病毒屬的冠狀病毒，同時(shí)對(duì)其序列進(jìn)行進(jìn)化分析。其中有云南省的中菊頭蝠冠狀病毒RaTG13，以及SARS-CoV、MERS-CoV 和其他蝙蝠冠狀病毒，還包括α冠狀病毒屬的宿主為貓、狗、豬和人的冠狀病毒，β冠狀病毒屬的宿主為駱駝、牛、兔、馬和人的冠狀病毒，γ冠狀病毒屬的不同宿主（火雞、鴿）的冠狀病毒，δ冠狀病毒屬的夜鶯冠狀病毒HKU11和畫(huà)眉冠狀病毒HKU12（表1、表2）。

表1 冠狀病毒S蛋白序列信息

1.2 進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

運(yùn)用MEGA 7.0 軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，采用距離依靠法中的鄰接法（neighbor-joining，N-J）構(gòu)建N-J 進(jìn)化樹(shù)。將在GenBank 上下載到的冠狀病毒蛋白序列以FASTA 格式導(dǎo)入MEGA 7.0 進(jìn)行多序列與模型篩選。進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建使用p-distance模型，選擇Bootstrap值5 000，其他為默認(rèn)值。

1.3 保守基序分析

冠病毒代表性N 蛋白和S 蛋白序列保守基序motif 預(yù)測(cè)通過(guò)MEME在線網(wǎng)站進(jìn)行（https：//memesuite.org/meme/tools/meme）［23］，基序最大數(shù)量設(shè)置為3，數(shù)據(jù)結(jié)果使用TBtools 進(jìn)行可視化［24］。

2 結(jié)果

2.1 基于S蛋白的進(jìn)化關(guān)系分析

S 蛋白進(jìn)化分析結(jié)果顯示：β屬新型冠狀病毒聚到一個(gè)大的分支，其中2019-nCoV 與分離自云南省的中菊頭蝠冠狀病毒RaTG13關(guān)系最近，其次與SARS 相關(guān)毒株的進(jìn)化關(guān)系較近。多種哺乳類動(dòng)物感染的α冠狀病毒屬、家養(yǎng)禽類感染的γ冠狀病毒屬、野生禽類感染的δ冠狀病毒屬的冠狀病毒與2019-nCoV 關(guān)系較遠(yuǎn)。然而α、γ、δ冠狀病毒屬之間沒(méi)有很好地區(qū)分成獨(dú)立的分支，尤其是豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒（SADS-CoV）未與其他株系聚類到一起，表明其可能與其他毒株進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)（圖1）。

圖1 冠狀病毒S蛋白構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)結(jié)果圖

2.2 基于N蛋白的進(jìn)化關(guān)系分析

N蛋白進(jìn)化分析結(jié)果顯示：α、β屬冠狀病毒分別聚到2個(gè)大的分支中，γ冠狀病毒屬與δ冠狀病毒屬聚到了1 個(gè)分支中。新型冠狀病毒2019-nCoV 同樣與分離自云南省的中菊頭蝠冠狀病毒RaTG13 關(guān)系最近；其次與人和蝙蝠感染的SARS冠狀病毒具有較近的關(guān)系，尤其是蝙蝠感染的SARS冠狀病毒HKU3-2。其他哺乳類動(dòng)物和禽類感染的α冠狀病毒屬、γ冠狀病毒屬、δ冠狀病毒屬病毒與新型冠狀病毒2019-nCoV 的關(guān)系較遠(yuǎn)。該結(jié)果與S蛋白進(jìn)化關(guān)系分析結(jié)果相似（圖2）。

圖2 冠狀病毒N蛋白構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)結(jié)果圖

2.3 冠狀病毒N蛋白與S蛋白的保守基序分析

利用MEME 軟件對(duì)該N、S蛋白的保守元件進(jìn)行分析，如圖3 所示：N 蛋白中，選擇的30 個(gè)蛋白中有9 個(gè)只含有motif 1 和motif 2 保守元件，其他成員含有3 個(gè)保守元件，保守元件在蛋白中的分布相對(duì)均勻。S 蛋白中，選擇的30 個(gè)蛋白均含有motif 1、motif 2 和motif 3 保守元件，且集中在C端，整體看來(lái)保守元件所在位置和保守元件種類高度相似，表明冠狀病毒的N、S 蛋白具有一定的保守性。

圖3 冠狀病毒的N、S蛋白保守元件分析

3 討論

冠狀病毒可感染人和多種動(dòng)物，例如豬、牛、羊、犬、貓、鼠等。一些宿主可以被多種冠狀病毒感染，而一種冠狀病毒也可以感染多個(gè)宿主［25］。冠狀病毒還可以感染雞、鴨、鵝、鴿子、麻雀等禽類動(dòng)物，其中：雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）和火雞冠狀病毒屬于γ 屬冠狀病毒；夜鶯冠狀病毒HKU11、鵝口瘡冠狀病毒HKU12 等屬于δ屬冠狀病毒［26］。最早的冠狀病毒是由雞身上分離出來(lái)的，即雞傳染性支氣管炎病毒（IBV），因此禽類是冠狀病毒的早期宿主。故選擇禽類、豬、牛、羊、犬、貓、鼠的冠狀病毒蛋白或基因序列作為構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)的數(shù)據(jù)，有助于對(duì)冠狀病毒進(jìn)化關(guān)系及其對(duì)人類潛在的危害性的分析。蝙蝠是馬爾堡病毒、狂犬病病毒、尼帕病毒、亨德拉病毒等多種侵染人類的病毒的天然宿主，也被認(rèn)為是SARS-CoV、MERS-CoV和2019-nCoV 的天然宿主［26］。另有研究表明：?jiǎn)畏羼橊勈侵袞|呼吸綜合征冠狀病毒的主要宿主（MERS-CoV），并且是人群中出現(xiàn)中東呼吸綜合征感染的動(dòng)物來(lái)源［27-28］。

本研究運(yùn)用S、N兩種蛋白序列構(gòu)建冠狀病毒進(jìn)化樹(shù)所得的進(jìn)化關(guān)系總體上相似，β冠狀病毒屬的新型冠狀病毒2019-nCoV與分離自云南省的中菊頭蝠冠狀病毒RaTG13關(guān)系最近，其次與人和蝙蝠感染的SARS冠狀病毒具有較近的關(guān)系，然而基于S 蛋白的進(jìn)化分析沒(méi)有很好地將α、γ、δ冠狀病毒屬區(qū)分成獨(dú)立的分支，尤其是豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒（SADS-CoV）未與其他株系聚類到一起，說(shuō)明運(yùn)用S 蛋白建樹(shù)所得結(jié)果存在一定偏差。一些研究運(yùn)用二代測(cè)序結(jié)合三代測(cè)序獲得2019-nCoV 全基因組序列，測(cè)序長(zhǎng)度為29 688～29 899 bp，并涵蓋了全部病毒的編碼區(qū)［25］。通過(guò)對(duì)39株2019-nCoV的全長(zhǎng)基因組核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，證明其與SARS 冠狀病毒（SARS-CoV）的基因相似性平均為78.7%［26］，說(shuō)明2019-nCoV與人和蝙蝠感染的SARS冠狀病毒的確具有較近的關(guān)系，與N蛋白構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)結(jié)果一致。筆者推測(cè)：與S蛋白相比，運(yùn)用N 蛋白構(gòu)建冠狀病毒進(jìn)化樹(shù)更合適，所得到的進(jìn)化關(guān)系也更加準(zhǔn)確。

新型冠狀病毒于2019 年12 月初在中國(guó)被報(bào)道，對(duì)人類健康的危害程度已遠(yuǎn)超2003 年暴發(fā)的SARS病毒［27］。本研究通過(guò)S、N蛋白序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，表明新型冠狀病毒2019-nCoV與分離自云南省的中菊頭蝠冠狀病毒RaTG13 關(guān)系最近，并且與SARS-CoV也存在較近的關(guān)系，與全長(zhǎng)基因組核苷酸序列進(jìn)化關(guān)系分析結(jié)果一致［26］。因此，可借鑒SARS的預(yù)防與治療思路。由于新冠病毒的突變率較高，病毒群體在較短時(shí)間內(nèi)便可積累相當(dāng)數(shù)量的突變，進(jìn)化方向不可預(yù)測(cè)，從進(jìn)化生物學(xué)和群體遺傳學(xué)的角度分析，其結(jié)果有助于新冠病毒的監(jiān)測(cè)與防控［29］。公眾、各地疾病預(yù)防控制中心和社區(qū)醫(yī)生需要認(rèn)識(shí)冠狀病毒及其遺傳進(jìn)化關(guān)系，以促進(jìn)對(duì)新冠病毒的預(yù)防與治療［30］。