擬穴青蟹四種形態(tài)群體的形態(tài)比較和聚類分析

甄夢婷，胡韻月，高麗娟，申情雨，吳露晨，劉子明

（麗水學院生態(tài)學院，浙江 麗水 323000）

0 引言

擬穴青蟹（Scylla paramamosain）是梭子蟹科中體型最大、生長較快、適應性強的經(jīng)濟蟹類，具有肉味鮮美、營養(yǎng)豐富和藥用價值高等優(yōu)點。近年來，我國青蟹的生產(chǎn)規(guī)模不斷擴大，2021年捕撈產(chǎn)量高于7萬噸，養(yǎng)殖產(chǎn)量超過16萬噸［1］。作為傳統(tǒng)出口水產(chǎn)品和主要養(yǎng)殖品種之一，青蟹產(chǎn)業(yè)已成為我國東南沿海漁業(yè)的重要組成部分。雖然我國青蟹養(yǎng)殖產(chǎn)量呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，但人工育苗產(chǎn)量有限，養(yǎng)殖苗種主要來源于野生蟹苗［2］。捕撈自不同區(qū)域的蟹苗在全國范圍內(nèi)調(diào)運，未進行區(qū)分便混養(yǎng)在一起，易造成不同地理群體間的種質(zhì)混雜，進而降低青蟹種群多樣性。為合理開發(fā)和保護青蟹自然資源，并規(guī)范青蟹養(yǎng)殖業(yè)的生產(chǎn)，開展青蟹種群遺傳多樣性的研究顯得十分重要。

青蟹廣泛分布于我國東南沿海的不同海區(qū)，緯度高和緯度低的東南海區(qū)其季節(jié)水溫變化存在很大差異。例如：浙江屬亞熱帶季風氣候，四季分明，夏季高溫，冬季水溫可低于零度；海南屬熱帶季風氣候，長夏無冬，在最冷的一月份水溫仍可達到17～24 ℃。經(jīng)過漫長歷史的適應，不同地理群體的青蟹對溫度變化的響應機制可能存在可遺傳的代謝差異?；诖耍覀冮_展 “擬穴青蟹不同群體對溫度變化的適應性機制研究” ，并取得了一些成果：將擬穴青蟹分為 “一對螯足腕節(jié)外緣中部都不具有發(fā)達的刺——多數(shù)個體” 與 “至少一只螯足腕節(jié)外緣中部具有發(fā)達的刺——少數(shù)個體” 兩大類形態(tài)群體，比較這兩個群體線粒體呼吸速率和呼吸酶活性的季節(jié)變化，結果表明這兩個群體呼吸代謝的季節(jié)變化模式差異很顯著［3］；棲息于浙江、福建和海南的擬穴青蟹群體其線粒體呼吸速率存在顯著差異，在緯度越高的海區(qū)兩個形態(tài)群體線粒體呼吸速率的差異越大［4］；在37℃高溫應激中擬穴青蟹兩個形態(tài)群體抗氧化酶活性和熱休克蛋白表達呈現(xiàn)出不一致的響應機制［5］；轉(zhuǎn)錄組測序結果顯示，低溫應激第6 h在兩個形態(tài)群體的肝胰腺中檢測到264個差異表達基因［6］，同時采用RT-qPCR技術檢測到4個與低溫適應相關的基因［7］。

前期研究結果表明：擬穴青蟹兩大類形態(tài)群體的生理生化代謝存在顯著差異，且形態(tài)群體的進一步細分將有助于闡明擬穴青蟹不同群體的遺傳多樣性。本文在已有工作積累的基礎上，根據(jù)左螯足和右螯足腕節(jié)外緣刺的數(shù)量進一步將擬穴青蟹細分為四種不同形態(tài)的群體，采用形態(tài)學方法比較四種形態(tài)群體的主要形態(tài)特征差異并對其進行聚類分析，探究擬穴青蟹四種形態(tài)群體的表型多樣性。這項工作的開展將有利于擬穴青蟹種質(zhì)資源的開發(fā)和保護及其水產(chǎn)養(yǎng)殖的生產(chǎn)和管理。

1 材料與方法

1.1 青蟹采集和鑒定

80 只肢體完整、大小相似的雄性青蟹采集自福建省泉州海區(qū)，參照Keenan 等［8］的方法鑒定擬穴青蟹：（1）頭胸甲背面無白色斑點，其顏色與螯足相似（圖1-a）；（2）頭胸甲額緣4 齒長度長，尖銳，呈三角形（圖1-b）；（3）最后兩對附肢上網(wǎng)格狀圖案不明顯，圖案顏色較淡（圖1-c）。再基于左螯足腕節(jié)外緣有1 根刺（圖1-d）、右螯足腕節(jié)外緣有1 根刺（圖1-e）、左螯足腕節(jié)外緣有2 根刺（圖1-f）、右螯足腕節(jié)外緣有2 根刺（圖1-g）這4個特征將擬穴青蟹分為四種不同形態(tài)的個體：Z1Y1（圖1-A）、Z2Y1（圖1-B）、Z1Y2（圖1-C）、Z2Y2（圖1-D）。

圖1 擬穴青蟹四種形態(tài)個體的主要形態(tài)特征

1.2 形態(tài)測量

參照Keenan 等［8］的方法測量擬穴青蟹的形態(tài)參數(shù)，Keenan 等共測定青蟹23 個形態(tài)指標，包括頭胸甲長、頭胸甲寬、頭胸甲內(nèi)寬、第八齒頭胸甲寬、頭胸甲后部寬、腹部寬、腹甲寬、額緣寬、額緣中齒距、額緣側(cè)齒距、額緣中齒高、第3 步足長節(jié)長、第5步足指節(jié)長、第5步足指節(jié)寬、螯足長節(jié)長、螯足指節(jié)長、螯足腕節(jié)外刺、螯足腕節(jié)內(nèi)刺、螯足掌節(jié)外刺、螯足掌節(jié)內(nèi)刺、螯足掌節(jié)高、螯足掌節(jié)長、螯足掌節(jié)寬。前期研究結果顯示，擬穴青蟹左螯足和右螯足的形態(tài)測定指標可能存在差異，故實驗同時測定左螯足和右螯足的形態(tài)指標，一共測量30 個形態(tài)參數(shù)指標。參照Keenan 等［8］的方法將這30個形態(tài)參數(shù)換算得到34個形態(tài)比值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 17.0 軟件對所有數(shù)據(jù)進行分析，實驗結果用平均值±標準差表示。根據(jù)34 個形態(tài)比值對擬穴青蟹四種形態(tài)群體進行單因素方差分析和聚類分析。單因素方差分析中任意兩個形態(tài)群體的顯著差異性分析采用LSD（least significant digit，最低有效位）法多重比較，聚類方法為歐氏距離的最短距離系統(tǒng)聚類法。

2 實驗結果

2.1 四種形態(tài)群體的采樣和鑒定

經(jīng)形態(tài)鑒定，采集的80只青蟹均為擬穴青蟹，未發(fā)現(xiàn)鋸緣青蟹、紫螯青蟹和欖綠青蟹。采集的擬穴青蟹中近三分之二個體為Z1Y1 群體，Z1Y2、Z2Y1 和Z2Y2 群體的數(shù)量比例分別為12.50%、11.25%和10.00%。單因素方差分析的結果表明擬穴青蟹四種形態(tài)群體之間的殼寬和體質(zhì)量均無顯著差異（表1）。

表1 擬穴青蟹四種形態(tài)群體的數(shù)量比例、殼寬和體質(zhì)量

2.2 四種形態(tài)群體形態(tài)比值的比較

測定的34 個形態(tài)參數(shù)比值中，四種形態(tài)群體的比較有19 個指標達到顯著差異水平（P＜0.05）（表2），15個指標未達到顯著差異水平（表3）。數(shù)量最多的Z1Y1 群體分別有6、11、13 個指標與Z2Y1、Z2Y2、Z1Y2 群體的比較達到顯著差異水平（P＜0.05）。其中右螯足掌節(jié)長/頭胸甲內(nèi)寬、右螯足掌節(jié)寬/右螯足掌節(jié)長、右螯足掌節(jié)高/右螯足掌節(jié)長、右螯足掌節(jié)寬*右螯足掌節(jié)高/右螯足掌節(jié)長、右螯足掌節(jié)外刺/右螯足掌節(jié)長這5 個指標的測定結果均表現(xiàn)為Z1Y1 和Z2Y1 群體的數(shù)值與Z1Y2和Z2Y2群體的數(shù)值存在顯著差異（P＜0.05）。右螯足指節(jié)長/右螯足掌節(jié)長、右螯足掌節(jié)內(nèi)刺/右螯足掌節(jié)長、左螯足長節(jié)長/左螯足掌節(jié)長這3 個指標的測定結果均表現(xiàn)為Z1Y1 群體的數(shù)值與Z1Y2和Z2Y2群體的數(shù)值存在顯著差異（P＜0.05）。四種形態(tài)群體形態(tài)特征差異的詳細情況見表2。

2.3 四種形態(tài)群體的聚類情況

基于34個形態(tài)參數(shù)比值，80只擬穴青蟹的聚類分析結果如圖2所示。最先由21只青蟹聚成的分支中，Z1Y1 群體有18 只，剩余3 只都為Z2Y1 群體。最后聚入的7 只青蟹均不屬Z1Y1 群體，其中Z2Y1群體有3只（Z2Y1-1、2、5），Z1Y2群體有2只（Z1Y2-1、4），Z2Y2群體有2只（Z2Y2-1、8）。對于Z1Y1 群體，Z1Y1-1、4、15、24、37、53；Z1Y1-6、11、12、18、31、43；Z1Y1-25、28、29、51；Z1Y1-2、9、21、45 都單獨聚為一個小分支。由11 只青蟹聚成的小分支中，有6只青蟹（Z1Y2-2、5、6、7、8、10）均為Z1Y2群體，占Z1Y2群體總數(shù)的54.55%。

圖2 擬穴青蟹四種形態(tài)群體的聚類圖

3 討論

3.1 青蟹形態(tài)鑒定

青蟹螯足腕節(jié)外緣刺的數(shù)量是青蟹屬分類鑒定的重要依據(jù)之一。在Keenan 等［8］的青蟹屬分類檢索系統(tǒng)中，4種青蟹根據(jù)習性和形態(tài)可分為Mamosain 和Banhawin 兩大類。Mamosain 指的是體型較小、會挖穴的青蟹，即擬穴青蟹（S.paramamosain）和欖綠青蟹（S.olivacea），這類青蟹的螯足腕節(jié)外緣中部的刺退化且甲殼背面沒有白色斑點。Banhawin 指的是體型較大、行自由生活的青蟹，即鋸緣青蟹（S.serrata）和紫螯青蟹（S.tranquebarica），這兩種青蟹的螯足腕節(jié)外緣有兩根發(fā)達的刺且甲殼背面有白色斑點。然而，林琪等［9］采集中國東南沿海13個地區(qū)的擬穴青蟹進行形態(tài)學研究，發(fā)現(xiàn)擬穴青蟹有33.3%未成熟個體的螯足腕節(jié)外緣有兩根發(fā)達的刺。本實驗的采樣和鑒定結果表明，左螯足或右螯足腕節(jié)外緣有兩根發(fā)達刺的擬穴青蟹（Z1Y2、Z2Y1 和Z2Y2）其數(shù)量比例為33.75%，這與林琪等［9］的實驗結果相一致。由此可知，不能憑借螯足腕節(jié)外緣刺的數(shù)量這一特征來鑒別擬穴青蟹。

3.2 四種形態(tài)群體的形態(tài)特征差異

形態(tài)特征測量是種質(zhì)資源鑒定的常用方法之一，具有簡單、快速、直觀的優(yōu)點。喻國洪等［10］比較擬穴青蟹（S.paramamosain）浙江寧波和越南群體的24 個形態(tài)參數(shù)比值，結果顯示兩個地理群體的形態(tài)差異主要集中在頭胸甲，其中寧波群體的頭胸甲長/頭胸甲寬和腹部寬/頭胸甲寬比越南群體大，體高/頭胸甲寬比越南群體小。姜曉東等［11］采用地標點法比較中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）中國長江和荷蘭群體頭胸甲的形態(tài)差異，結果顯示兩個地理群體形態(tài)特征的主要差異為頭胸甲邊緣額刺和側(cè)刺的位置，且選取5個貢獻率大的變量建立判別方程，長江和荷蘭群體的判別準確率都為100%。本實驗比較擬穴青蟹四種形態(tài)群體之間的形態(tài)差異，測得的19個顯著形態(tài)參數(shù)比值中，18 個指標均為左螯足或右螯足的差異，頭胸甲的形態(tài)差異只有1 個（額緣中齒高/額緣中齒距），原因可能在于擬穴青蟹這四種群體的劃分本身就是基于螯足形態(tài)的差異——左螯足和右螯足腕節(jié)外緣刺的數(shù)量。將擬穴青蟹分為兩大類形態(tài)群體（Z1Y1 群體和其他三種形態(tài)群體），前期研究結果表明在季節(jié)馴化、不同緯度、高溫應激和低溫應激條件下擬穴青蟹這兩類形態(tài)群體的生理、生化和分子水平上均存在著代謝差異［3-7］。對于四種形態(tài)群體之間的形態(tài)特征差異，本實驗結果表明數(shù)量最多的Z1Y1 群體與其他三種形態(tài)群體的差異最為明顯，這與前期的多個研究結果相呼應。由此說明左右螯足腕節(jié)外緣都只有一根刺與左螯足或右螯足腕節(jié)外緣有兩根刺的擬穴青蟹在形態(tài)和代謝水平上有著明顯的區(qū)別。

3.3 四種形態(tài)群體的聚類分析

有關魚、蝦、貝、蟹等水產(chǎn)經(jīng)濟動物群體多樣性的形態(tài)學研究，研究對象主要集中在不同地理群體［11-14］。結合多年的探究結果，本實驗首次將擬穴青蟹分為四種形態(tài)群體進行形態(tài)學分析，80只擬穴青蟹的聚類分析結果顯示：Z1Y1 群體的有些個體能夠獨自地聚為一小支，Z1Y2 群體有一半多的個體聚在一塊，最后聚入的7只青蟹都是數(shù)量很少的Z1Y2、Z2Y1、Z2Y2 群體，這些都表明擬穴青蟹這四類形態(tài)群體有一定程度的表型分化，也再一次說明群體多樣性研究中將擬穴青蟹劃分為四種形態(tài)群體具有可行性。對于四種形態(tài)群體之間的形態(tài)差異比較，在最先聚集的分支中共有21只青蟹，其中18 只為Z1Y1 群體，剩余3 只為Z2Y1群體，這說明相比Z1Y2和Z2Y2群體，Z1Y1群體與Z2Y1群體的形態(tài)相似度更高。此外，相比Z1Y2群體的13 個和Z2Y2 群體的11 個形態(tài)參數(shù)比值，Z2Y1 群體只有6 個形態(tài)參數(shù)比值與Z1Y1 群體的比較達到顯著差異水平，這同樣說明相較于Z1Y2和Z2Y2 群體，Z1Y1 和Z2Y1 這兩個群體的形態(tài)特征更為相似。一般而言，水生動物的形態(tài)特征往往與其棲息的環(huán)境相適應。此外，水環(huán)境的溫度、酸堿度、硬度，土壤底質(zhì)，捕食關系等因素也會對動物的外部形態(tài)產(chǎn)生影響［15］。因此，在今后的研究中，筆者將從基因水平進一步揭示擬穴青蟹這四個形態(tài)群體的遺傳差異，為擬穴青蟹種質(zhì)資源的開發(fā)和保護奠定相關的基礎。