模型建構在PCR擴增目的基因過程的應用

龐會平

(陜西省寶雞市陳倉區虢鎮中學)

基因工程中與PCR(聚合酶鏈式反應)的相關內容,是高中生物學教學中的重難點,為學生搭建了科學探究和理性思維的平臺,為生物學命題提供大量的素材。《普通高中生物學課程標準(2017年版2020年修訂)》要求:為幫助學生達成對選擇性必修課程概念5(基因工程賦予生物新的遺傳特性)的理解,促進學生生物學學科核心素養的提升,應開展利用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增DNA片段并完成電泳鑒定,或運用軟件進行虛擬PCR實驗等教學活動。這一要求凸顯了PCR技術在基因工程中的重要地位。有關PCR擴增目的基因過程中引物的種類選擇和數量計算、子代DNA的類型、數量和比例推算等問題,對學生的能力要求較高,作答時存在較大困難。

模型建構是生物學的一種重要科學方法,恰當使用這一方法可以讓學生體驗科學探究過程,培養學生的理性思維,提高學習效率。為突破PCR擴增目的基因過程中相關問題,可以先運用計算機繪圖軟件或多媒體動畫,以模擬圖等形式直觀呈現前三輪擴增的結果,合理定義基本組成單位并從中發現變化規律,根據規律先建構物理模型,再運用數學歸納法建構數學模型。

例題：如圖1為從靶DNA片段上通過PCR擴增目標片段(目的基因)過程圖,請據圖回答有關問題:

(1)PCR技術利用的基本原理是________。利用該技術擴增目標DNA片段(子鏈的延伸方向從5′→3′),應選擇圖中的引物________(填字母)與模板DNA結合。在PCR擴增過程中,經過n輪循環后,共有________個引物參與子代DNA分子的合成。

(2)PCR體系經過n輪循環可使DNA數量得到約2n倍的擴增。若反應體系加入m個靶DNA,經3輪循環后含有圖中所示目標片段為________個,所占的比例為________;經過n輪循環后,含有目標片段為________個,所占的比例為________。

1.DNA類型的物理模型

PCR反應需要在一定的緩沖溶液中進行,需提供DNA模板、可分別與兩條模板鏈結合的2種引物、4種脫氧核苷酸和耐高溫的DNA聚合酶;通過控制溫度使DNA在體外擴增。PCR體系中的耐高溫DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)不能從頭開始合成脫氧核苷酸鏈,故需要引物。引物是一小段能與DNA母鏈(模板鏈)的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸,用于PCR的引物長度通常為20～30個核苷酸。引物只能結合在母鏈(模板鏈)的3′端,作為子鏈(新合成鏈)的合成起點,脫氧核苷酸鏈合成的方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸,即從引物3′端依次連接單個脫氧核糖核苷酸,最終延伸成脫氧核苷酸鏈。一般情況下,PCR只能特異性地擴增兩個引物之間的DNA片段,也就是說引物決定了PCR擴增產物的長度和特異性。

運用計算機繪圖軟件或多媒體動畫,以模擬圖形式直觀呈現前三輪擴增的結果,如圖2。

圖2 PCR前三輪擴增結果的模擬圖

從圖中可發現:PCR體系中存在三種不同長度的脫氧核苷酸鏈:即長鏈(Long chain)、中鏈(Medium chain)、短鏈(Short chain)。為了方便構建物理模型,將其依次定義為L鏈、M鏈、S鏈。由相同長度或不同長度的脫氧核苷酸鏈所構成的DNA分子共4種類型:L-L型DNA、L-M型DNA、M-S型DNA、S-S型DNA。

運用DNA半保留復制原理并結合圖2過程,推理PCR過程形成的DNA分子類型,建構物理模型一,如圖3。

圖3 PCR擴增產物的物理模型一

為了方便建構模型,本文所建構的物理模型統一規定:從G1代開始,各代的DNA均以“母鏈(模板鏈)-子鏈(新合成鏈)”模式建構。

在第一輪循環中,以G0代L-L型DNA的2條L鏈為模板,合成2條新的脫氧核苷酸鏈:M鏈,組成2個L-M型DNA分子,即G1代的2個 DNA分子,均為不等長的L-M型DNA分子。

從第二輪循環開始,上一輪循環的產物也可作為模板鏈參與反應。第二輪循環中,G1代的2個L-M 型DNA分子共含有2條L鏈和2條M鏈,除了以2條L鏈為模板合成的2個L-M型DNA分子外,還有以2條M鏈為模板合成的2個M-S型DNA分子。G2代共4個DNA分子,均為不等長DNA分子。

在第三輪循環中,G2代的2個L-M型DNA分子和2個M-S型DNA分子,共含有2條L鏈、4條M鏈和2條S鏈。以2條L鏈、4條M鏈為模板合成6個不等長DNA分子不再復述;以2條S鏈為模板合成的2個S-S型DNA分子為等長DNA分子。可見,等長的DNA片段在第三輪循環產物中才出現。G3代共8個DNA分子,其中S-S型DNA分子為PCR擴增過程中的目標片段,也就是目的基因。

以此類推:G4代、G5代等。

2.DNA類型的數學模型

從G3代開始,每代擴增產物均有3種類型的DNA分子,即L-M型DNA、M-S型DNA、S-S型DNA。只有S-S型DNA為等長的DNA分子,L-M 型DNA、M-S型DNA均為不等長DNA分子。每代擴增產物的數量關系滿足:

總DNA分子數=L-M型DNA分子數+M-S 型DNA分子數+S-S型DNA分子數

L-M型DNA、M-S型DNA分子結構上都含有一條M鏈,即M鏈的數目即為L-M型DNA分子和M-S型DNA分子數目之和(不等長DNA分子數目)。M鏈只能以L鏈為模板復制形成,PCR過程中,每增加一輪循環,M鏈就增加2條,循環n輪后,產生2n條M鏈,進而形成2n個不等長DNA分子,其中L-M型DNA分子共2個,M-S 型DNA分子共(2n-2)個。故Gn代擴增產物共2n個DNA分子,其中S-S型DNA分子共(2n-2n)個,如表1。

表1 PCR擴增產物的數學模型一

PCR的每一次循環后目的基因的量可以增加一倍,即呈指數形式擴增(約為2n,其中n為擴增循環的次數)。據數學模型一可知,Gn-1代DNA分子不同長度的DNA單鏈(即模板鏈)數目等于Gn代不同類型DNA分子數目,據此,也可構建數學模型二,如表2。

表2 PCR擴增產物的數學模型二

3.引物種類的物理模型

綜合考慮引物的種類和位置及子鏈的合成方向,建構出物理模型二,如圖4。

圖4 PCR擴增產物的物理模型二

PCR體系中先后合成6種類型的DNA分子:L-MA型DNA、L-MB型DNA、MA-SB型DNA、MB-SA型DNA、SA-SB型DNA、SB-SA型DNA。物理模型二可直觀呈現不同DNA分子所含的引物種類、位置和數量。

4.引物種類的數學模型

PCR體系中經過n輪循環后,在Gn代共形成的2n個DNA分子中,保留G0代DNA兩條模板鏈的DNA為L-MA型DNA和L-MB型DNA,含有引物A或引物B中的一個;而其他DNA分子:MA-SB型DNA、MB-SA型DNA、SA-SB型DNA和SB-SA型DNA,同時含有引物A和引物B。所以,只含引物A或引物B的DNA分子數目為1個,含引物A(或引物B)的DNA分子數目為(2n-1)個,同時含有引物A和引物B的DNA分子數目為(2n-2)個。

第n輪循環時,以Gn-1代2n-1個DNA為模板進行擴增,以2n條脫氧核苷酸鏈為模板,新合成2n條脫氧核苷酸鏈,所以需要引物2n個。

在此基礎上建構數學模型二,如表3。

表3 PCR擴增產物的數學模型二