非布司他原料藥微生物限度檢查法的建立

鄭域茹 吳燕燕 程 琳 林玉雙

福建省食品藥品質量檢驗研究院，福建福州 350001

藥品微生物限度檢查是保障臨床用藥的有效性以及藥品安全性的重要措施[1-3]。非布司他為非嘌呤類黃嘌呤氧化酶抑制劑，為新一代痛風治療藥[4]。本研究中的非布司他原料藥作為制劑重要的上游產品，其微生物限度是反映產品安全性和質量可控性的重要指標之一。《中華人民共和國藥典》2020年版對非無菌藥用原料及輔料的微生物限度只規定了需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數，控制菌未作統一規定[5]。由于該原料藥的下游產品為口服制劑，控制菌還應檢查大腸埃希菌。為提高該原料藥的質控水平，本研究擬建立非布司他原料藥的微生物限度檢查法，為該藥品的生產管理提供切實可行、行之有效的方法學參考。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器設備

ME2002E電子天平（梅特勒托利多）、HVA-110高壓蒸汽滅菌器（日本Hirayama）、HFsafe-12CY生物安全柜（上海力康）、HTY-306A過濾系統（浙江泰林）、IPP410培養箱（德國Memmert）、BagMixer 400CC均質器（法國Interscience）、側邊過濾膜均質袋（法國Interscience）和VITEK2 COMPACT全自動微生物鑒定儀（梅里埃）。

1.2 菌種

金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、黑曲霉[CMCC（F）98003]和白色念珠菌[CMCC（F）98001]均購自于中國食品藥品檢定研究院。

1.3 培養基

胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA）（批號：210421）、沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA）（批號：210929）、胰酪大豆胨液體培養基（TSB）（批號：211210）、麥康凱液體培養基（批號：200823）和麥康凱瓊脂培養基（批號：200321）均購自于北京三藥科技開發有限公司，經培養基適用性檢查，均符合要求。

1.4 稀釋劑與沖洗液

pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液和含3%吐溫80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液。

1.5 供試品

非布司他原料藥。

2 方法

2.1 試驗用菌懸液的制備

參照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則1105的方法制備適宜濃度的菌懸液[5]。

2.2 供試液制備

取非布司他原料藥10 g，加44℃含3%吐溫80的pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，振搖均勻，制成1∶10供試液，備用。以3%吐溫80的pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液為稀釋劑，將1∶10供試液分別稀釋為1∶20、1∶50和1∶100供試液，備用。

2.3 需氧菌總數（the total aerobic microbial，TAMC）檢查方法的建立與驗證

2.3.1 平皿法 方法1：取1∶50供試液，分裝于5支無菌試管中，每支9.9 ml，分別加入0.1 ml白色念珠菌、黑曲霉、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌菌懸液，控制最終含菌量≤100 cfu/ml，作為試驗組。分別吸取上述混合液2 ml置直徑為90 mm的平皿中（1 ml/皿），隨即注入TSA培養基，置33℃培養2～3 d，點計平板上的菌落數。按照《中華人民共和國藥典》2020年版的要求，制備供試品對照組和菌液對照組。本實驗進行3次重復，并計算5種試驗菌的回收率。回收率=（試驗組菌落數-供試品對照組菌落數）/菌液對照組菌落數×100%[5-6]。

方法2：參照方法1的操作，將方法1的1∶50供試液替換為1∶100供試液。

2.3.2 薄膜過濾法 采用薄膜過濾法，主要考察兩種加菌方式對試驗菌回收率的影響。第一種加菌方式為供試液制備環節加菌，設置A、B、C、D四種方法；第二種加菌方式為在培養前加菌，即薄膜過濾法的最后一次沖洗液中加菌，設置E和F兩種方法。具體操作如下。

方法A：取1∶10供試液1 ml，加入1 ml菌含量≤100 cfu的金黃色葡萄球菌，并加入100 ml pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋，薄膜過濾后，分別用300、500、700 、1000 ml的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗薄膜，每次100 ml，濾干，將膜貼于TSA平皿上，并按要求培養。

方法B：將方法A中的沖洗液pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替換為含3%吐溫80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，其余操作參照方法A。

方法C：將方法A中1∶10供試液替換為1∶100供試液，其余操作參照方法A。

方法D：將方法C中的沖洗液pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替換為含3%吐溫80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，其余操作參照方法C。

方法E：取1∶10供試液1 ml，加入100 ml pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋，薄膜過濾后，分別用300、500、700、1000 ml的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗薄膜，每次100 ml，在最后一次的沖洗液中加入1 ml菌含量≤100 cfu的金黃色葡萄球菌，濾干，將膜貼于TSA平皿上，并按要求培養。

方法F（含中和劑的沖洗液）：將方法E中的沖洗液pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替換為含3%吐溫80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，其余操作參照方法E。

上述五組同法檢測菌液對照組和供試品對照組，本實驗進行3次重復，并計算金黃色葡萄球菌的回收率。

2.4 霉菌和酵母菌總數（the total yeasts and mould，TYMC）檢查方法的建立與驗證

2.4.1 均質袋-平皿法結合使用 本研究使用的均質袋帶有孔徑小于250 μm的濾膜，濾膜將均質袋分為兩側，加供試液側稱為內側，相對應濾膜的另一側稱為外側。

取1∶10供試液100 ml全部轉移至過濾型均質袋的內側，加入白色念珠菌菌懸液，控制最終含菌量≤100 cfu/ml，均質器拍擊1 min，作為試驗組。分別吸取均質袋內外兩側的上述混合液各15 ml，置直徑為90 mm的無菌平皿中（1 ml/皿），隨即注入SDA培養基，23℃培養5 d，點計平板上的菌落數。按照試驗組操作方法，取稀釋液替代供試品溶液，作為菌液對照組。

2.4.2 薄膜過濾法 取1∶10供試液1 ml，加入1 ml菌含量≤100 cfu的黑曲霉懸液，并加入100 ml pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋，薄膜過濾后，用300 ml pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗薄膜，每次100 ml，濾干，將膜貼于SDA平皿上，并按要求培養。白色念珠菌依照此法操作。本實驗進行3次重復，并計算2株供試菌的回收率。

2.5 控制菌大腸埃希菌檢查方法的建立與驗證

取2.2制備的1∶10供試液10 ml，加到100 ml的TSB培養基中，同時接種菌含量≤100 cfu的大腸埃希菌菌懸液，33 ℃增菌24 h后取1 ml到100 ml麥康凱液體培養基中，43℃培養24～48 h后劃線于麥康凱瓊脂平板，33℃培養18～72 h。采用微生物鑒定儀對菌落生長進行鑒定，并根據鑒定結果判斷方法適用性試驗是否可行。同時分別制備供試品對照組、陽性對照組和陰性對照組。

2.6 數據處理

由于微生物菌落數服從泊松分布，2.4.1的試驗組和菌液對照組均質袋濾膜兩側的菌落計數結果需先經對數轉換，再采用Minitab軟件對lg值進行正態性檢驗，當lg值符合正態性分布時采用F檢驗進行方差齊性檢驗，最后采用t檢驗進行顯著性差異分析[7-8]，P< 0.05為差異有統計學意義。

3 結果與分析

3.1 TAMC檢查方法的建立與驗證

3.1.1 TAMC平皿法的試驗結果 非布司他原料藥為白色粉末，略溶于二甲基亞砜、甲醇，在水中幾乎不溶[9]。吐溫具有很強的增溶效果[10-13]，本研究的稀釋液采用添加3%吐溫80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，制備的供試品可均勻分散在稀釋液中。但1∶10和1∶20供試液含有較多的白色藥物，采用平皿法進行計數，不溶的白色藥物對菌落計數產生較大的干擾。因此本研究采用1∶50和1∶100稀釋級作為需氧菌總數平皿計數法的供試液。非布司他本身帶有較強的抑菌性，稀釋級為1∶50時，金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均無法生長。當稀釋級為1∶100時，金黃色葡萄球菌的回收率仍然達不到50%，不符合要求。見表1。

表1 需氧菌總數平皿法檢查試驗結果

3.1.2 TAMC薄膜過濾法的試驗結果 根據3.1.1的試驗，對非布司他最敏感的菌株為金黃色葡萄球菌，因此本部分以金黃色葡萄球菌作為供試菌。對于供試液環節加菌試驗組，本研究設置A、B、C、D四個方法，結果表明采用1∶10供試液，不管沖洗液有沒有加3%吐溫80作為中和劑（沖洗量1000 ml）試驗菌的回收率均<50%（方法A和B）；而采用1∶100供試液，沖洗液不添加中和劑，回收率同樣達不到50%（方法C），僅當沖洗液添加中和劑且沖洗量達1000 ml時，方法D的試驗菌回收率達到50%。而對于最后一次沖洗液加菌的試驗組，本研究設置E和F兩個方法，采用1∶10供試液，沖洗量為700 ml，試驗菌回收率為60%以上（方法E），符合要求；當沖洗液中添加3%吐溫80，沖洗量降低為300 ml，試驗菌的回收率達70%以上（方法F）。見表2。

表2 金黃色葡萄球菌回收率（%）

因此，若僅考慮回收率在50%～200%即符合《中華人民共和國藥典》2020版要求，非布司他原料藥的需氧菌總數方法驗證可采用供試液階段加菌，制備1∶100供試液，沖洗液1000 ml（《中華人民共和國藥典》2020年版建議沖洗量一般不超過500 ml，最多不得超過1000 ml[5]）的方法D，但考慮到大量沖洗可能造成濾膜孔徑的變化而導致無效檢驗，也可能會對藥品實際污染的本就受損或者亞致死的微生物進一步造成損傷，本研究擬采用在薄膜過濾最后一次沖洗液中加菌的方法F，取1∶10的供試液1 ml，含中和劑沖洗300 ml/膜，作為建立需氧菌總數方法適用性驗證的方案。

3.1.3 TAMC檢查方法適用性結果 采用3.1.2建立的方法F，對非布司他原料藥的需氧菌總數進行方法適用性研究，結果見表3，5株試驗菌的回收率均符合《中華人民共和國藥典》2020年版的規定。

表3 TAMC檢查方法適用性結果

3.2 TYMC檢查方法的建立與驗證

3.2.1 過濾型均質袋的濾除對微生物的影響 試驗組和菌液對照組均質袋濾膜兩側的菌落見表4，將計數結果取對數進行正態性檢驗，結果顯示，試驗組的均質袋內、外側的P值分別為0.411和0.915，菌液對照組的濾膜內、外側的P值分別為0.245和0.673，均大于0.05，表明試驗組和菌液對照組均質袋兩側的數據都接受95%概率下的正態性分布。等方差檢驗結果顯示，菌液對照組濾膜兩側數據之間均有方差齊性，試驗組濾膜兩側的數據也具有方差齊性。雙樣本t檢驗對菌液對照組的濾膜內、外側數據進行分析，P=1.00 > 0.05，表明內、外側菌數差異無統計學意義；同法分析試驗組的濾膜內、外側數據，表明試驗組中均質袋濾膜內外兩側的白色念珠菌的分布差異有統計學意義（P=0.00 < 0.05）。濾膜雖然能濾除供試液中較大顆粒的藥粉，但是同時也會濾除供試液中微生物，因此不適用于非布司他原料藥計數檢查中使用。

表4 濾膜兩側的菌落數

3.2.2 TYMC檢查方法適用性結果 由于藥渣干擾平皿法的菌落計數結果，本研究采用薄膜過濾法對霉菌酵母總數計數進行方法學驗證。在對本品的需氧菌總數計數的方法學驗證可知，試驗菌白色念珠菌和黑曲霉對非布司他原料藥均不敏感。因此采用1∶10供試液1 ml，pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗300 ml，對三批非布司他原料藥進行方法適用性研究，結果見表5，白色念珠菌和黑曲霉的回收率均符合《中華人民共和國藥典》2020年版的規定。

表5 TYMC檢查方法適用性結果

3.3 控制菌大腸埃希菌檢查方法的建立與驗證

采用2.2制備的1∶10供試液，取10 ml接種至100 ml TSB進行非布司他原料藥的大腸埃希菌的適用性試驗，結果均符合《中華人民共和國藥典》2020年版規定。見表6。

表6 大腸埃希菌檢查方法適用性試驗結果

4 討論

本研究的材料為原料藥，其微生物控制對制劑具有重要影響。為建立一種對樣本影響小，操作效率高的方法，首先需要開展方法適用性研究[14]。《中華人民共和國藥典》從2015年版開始，在微生物限度檢查微生物計數法（通則1105）的規定中指出，方法適用性實驗中應首先在供試液環節加入驗證菌株進行回收率測定[15]。理論上這樣的規定既考慮到樣品因素，也考慮到檢驗過程對檢出對象的影響，但是這一理想狀態在現實中卻不易實現[16]。本研究嘗試研究不同加菌方式在需氧菌總數方法驗證中的通過情況。結果發現非布司他原料藥在1∶10供試液中加入試驗菌，未經過進一步稀釋，是無法通過方法驗證的。馬仕洪等[16]曾對95種樣品不同加菌環節進行研究，結果45%的品種同樣無法在1∶10供試液階段加菌通過方法驗證。因此本研究將加菌環節移至薄膜過濾最后一次沖洗液中加菌。

在需氧菌總數方法適用性研究過程，本研究發現在采用1∶10稀釋級供試液薄膜過濾后，沖洗700 ml試驗菌的回收率60%以上；而當沖洗液中添加吐溫后，沖洗300 ml試驗菌的回收率即可達到70%以上。顯然吐溫可有效中和供試品的抑菌作用，減少沖洗液用量，簡化操作。

平皿法因其操作簡便快捷，在微生物計數中應用最為廣泛。為消除不溶性供試品對平皿菌落計數產生干擾，本研究在進行霉菌和酵母菌總數計數方法適用性考察時，擬采用過濾型均質袋攔截不溶藥品。均質袋在食品微生物檢驗中的應用已非常普遍，藥品微生物檢查中亦有研究顯示均質袋過濾膜63 μm的孔徑不會使伏立康唑的微生物被濾除[17]。本研究采用濾膜孔徑小于250 μm的過濾型均質袋，濾膜外側的供試液藥品顆粒細小，分布均勻，菌落在平板更明顯，易于點數，但濾膜內外兩側的試驗菌數卻存在顯著性差異。這可能是由于非布司他原料藥某些細小的藥粉顆粒堵塞了均質袋的濾膜孔徑，阻擋了試驗菌在濾膜的流動，從而導致濾膜兩側菌落數不均勻分布。因此不同供試品由于性狀和特性各異，無法生搬硬套其他樣品的檢驗方法，在檢驗方法中采取的任何處理，都應不影響微生物的檢出，需經科學嚴謹確認其有效性方能采用。