制麥過程優勢真菌分離鑒定及其群落結構和多樣性分析

張雷淵,張春強,李慧,楊海鶯,李小燕,佟恩杰,陳文波*,謝和*

1(貴州大學 生命科學學院/農業生物工程研究院,山地植物資源保護與保護種質創新教育部重點實驗室, 山地生態與農業生物工程協同創新中心,貴州 貴陽,550025) 2(中糧麥芽(大連)有限公司,遼寧 大連,116200)3(中糧營養健康研究院,北京,102209)

麥芽是啤酒釀造的主要原料,其制備從原料大麥開始,包括浸麥、發芽和干燥3個環節。工業制麥對原料大麥的需求量巨大,多數情況下制麥企業需要從全球不同國家和地區進口大麥原料,如俄羅斯、德國、法國、烏克蘭、澳大利亞等。大麥產區分布廣泛,覆蓋范圍從接近北極圈的斯堪的維納半島到赤道附近的埃塞俄比亞和南美洲,從低于水平面的死海到安第斯山和喜瑪拉雅山,從濕潤溫暖的西歐到北美、非洲和澳大利亞的部分干燥區域等[1]。

不同產區大麥的微生物組成千差萬別。大麥表面被纖維質的谷殼包裹,成為眾多細菌、酵母和絲狀真菌的理想“棲息地”[2]。在制麥過程中,這些微生物會持續生長繁殖,并影響大麥的發芽性能以及麥芽和最終啤酒的品質。與細菌相比,真菌對制麥的影響會更明顯,因為制麥過程中所需的水解大麥淀粉、蛋白質和半纖維素等高分子物質的酶,除了來源于大麥,還可由大麥籽粒表面的真菌提供[3]。目前,大麥原料中微生物具體的種屬與胞外酶活之間的關系尚不清楚。另外,真菌污染也會降低大麥的發芽率、引發啤酒酵母超前絮凝和啤酒噴涌等問題[4-5]。因此,控制真菌污染一直是制麥行業的研究熱點。

近年來,高通量分子測序技術因其具有測序深度大、準確度高等特點,已在不同食品領域的微生物群落分析中得到廣泛應用[6]。本研究采用MiSeq高通量測序技術,并結合可培養的優勢真菌分離技術對制麥過程中的真菌進行分析;同時結合理化指標分析和可培養真菌的產酶情況,揭示制麥過程真菌菌群結構演替規律及其對麥芽品質的影響,以期為工業制麥過程微生物的控制及制麥工藝優化提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

大麥:La Trobe(澳大利亞產區)。

1.1.2 培養基

孟加拉紅培養基、PDA培養基和WL培養基,北京陸橋技術有限責任公司;YPD培養基(g/L):酵母粉10,蛋白胨20,葡萄糖20,瓊脂20,調節pH至 6.0,于121 ℃、20 min條件滅菌后備用。

1.1.3 試劑

乳酸酚棉藍染液,北京陸橋技術有限責任公司;E×Taq酶、dNTPs Mixture、10×Buffer I,TaKaRa公司;真菌DNA提取試劑盒,北京天根生化科技有限公司;羧甲基纖維素鈉、酪蛋白、可溶性淀粉、剛果紅(分析純),上海滬試公司;木聚糖,阿拉丁試劑有限公司;NaCl、葡萄糖、(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O、K2HPO4、KCl、NaNO3、FeSO4(分析純),國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

VB-7101-3/4微型制麥系統,德國SEEGER公司;S1000 TM PCR儀,美國Bio-Rad公司;Illumina HiSeq 2500測序平臺,美國Illumina公司;Scope A1正置相差顯微鏡,德國ZEISS公司;IPP260低溫培養箱,德國Memmert公司;Scan1200自動菌落計數儀,法國Interscience公司;AC2-4S1生物安全柜,新加坡ESCO公司;SQ510C高壓蒸汽滅菌鍋,日本YAMATO公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 制麥流程及樣品采集

麥芽制備流程如下所示:

原料大麥→浸麥(15 ℃、30 h,浸麥度43%～44%)→發芽(15 ℃、96 h)→排潮(45～55 ℃、6 h)→干燥(65～85 ℃、11 h,降低水分至3%～5%)→除根(成品麥芽)

利用多點采樣法分別對不同制麥工藝階段的樣品進行無菌取樣,用于優勢真菌的分離鑒定及真菌群落結構和多樣性分析。大麥原料樣品編號為M1、浸麥結束樣品編號為M2、發芽24 h樣品編號為M3、發芽結束樣品編號為M4、排潮結束樣品編號為M5、成品麥芽編號為M6。

1.3.2 菌種的分離與純化

稱取樣品25 g,置于盛有225 mL滅菌生理鹽水及玻璃珠的三角瓶中,于振蕩培養箱中150 r/min振搖30 min,制得1∶10稀釋度的樣品勻液。將此樣品依次進行10倍梯度稀釋至10-6。取各梯度樣品稀釋液1 mL均勻涂布在孟加拉紅培養基和YPD平板培養基上,28 ℃恒溫倒置培養3～5 d。菌落計數后,根據菌落形態、大小及顏色等特點,挑選不同的單菌落劃線接種至WL培養基和PDA培養基中。重復此純化過程至少3次。將所得單菌落接種于YPD培養基和PDA培養基試管斜面,培養結束后,4 ℃保存備用。

1.3.3 真菌的形態觀察

將保存的絲狀真菌接種于PDA培養基上,28 ℃培養7 d;酵母菌接種于WL培養基上培養,28 ℃培養2～3 d。根據菌落生長情況及菌落形態,挑取單個酵母菌落制成水浸片,用于菌體形態觀察;挑取絲狀真菌菌落用乳酸酚棉藍染液染色,用于菌絲及產孢結構觀察。

1.3.4 真菌的分子生物學鑒定

取單個酵母菌落和單個絲狀真菌菌落,接種于液體培養基中,28 ℃培養3～7 d。取1 mL菌液,4 000 r/min離心10 min后,棄去上清液,收集菌體沉淀,使用真菌DNA提取試劑盒提取菌株DNA。使用超微量紫外分光光度計檢測所得基因組DNA的濃度和純度。使用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)擴增真菌的ITS區。將PCR產物進行純化后送至北京新時代眾合科技有限公司進行測序。

將測序獲得的有效序列在美國國立生物技術信息中心(National Center of Biotechnology Information, NCBI)的GenBank數據庫中進行BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)同源序列比對。根據比對結果,導出同源性≥98%的菌株ITS基因序列區。借助MEGA 11.0軟件,采用鄰接法(neighbor-joining method, NJ)構建系統發育樹。

1.3.5 真菌多樣性測定

采用E.Z.N.A.?soil DNA kit試劑盒提取樣品中的微生物總DNA。使用引物ITS3F(5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′)和ITS4R(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對總DNA進行PCR擴增。擴增體系與程序參照文獻[7]。將擴增產物送至上海美吉生物醫藥科技有限公司利用Illumina MiSeq PE300平臺進行雙端測序。采用美吉云計算平臺分析,對序列進行操作分類單位(operational taxonomic unit,OTU)聚類,對每條序列進行物種分類注釋,比對UNITE 8.0數據庫,基于分類學信息,在不同分類學水平上進行群落結構統計分析。測序原始數據已上傳至NCBI數據庫,SRA登錄號為PRJNA907033。

1.3.6 蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶和纖維素酶活性檢測

使用透明圈法檢測所得菌株產胞外蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶和纖維素酶的能力。以3點接種法將活化的菌株接種到相應篩選培養基上,25 ℃培養3～7 d后觀察菌落周圍透明圈的出現情況[8-11]。

1.3.7 產酶菌株對麥芽品質的影響驗證

將產酶菌株孢子懸液噴灑在浸麥結束后的大麥上,進入發芽環節。接種方法參照趙志超等[12]的描述并稍作修改:選取產胞外酶能力較強的菌株接種到PDA培養基中,28 ℃培養至孢子長出。將其沖洗到已滅菌的培養基中并調整孢子濃度至106個/mL,30 ℃萌發6 h。按照2%(mL/100 g)的接種量將孢子萌發液均勻噴灑在浸麥結束的大麥上進行發芽。麥芽浸出率和糖化力的測定參照QB/T 1686—2008中規定的方法。

1.3.8 數據處理

所有檢測試驗重復3次,使用Excel軟件進行數據計算和分析。利用R軟件(v3.5.3)和Origin 2018軟件進行圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 制麥過程中酵母及絲狀真菌數量變化情況

不同制麥階段樣品中的可培養酵母和絲狀真菌的數量如圖1所示。原料大麥(M1)自身攜帶一定數量的酵母和絲狀真菌,其數量分別為1.4×104、7.1×103CFU/g。隨著制麥過程的進行,酵母和絲狀真菌均出現先升高后下降的趨勢。這與制麥過程中水分和溫度的變化密切相關[13]。發芽結束時(M4)樣品中酵母和絲狀真菌數量達到峰值,分別為6.2×107、3.2×105CFU/g。隨著溫度的上升和水分含量的下降,排潮階段(M5)樣品中微生物的數量下降。在成品麥芽(M6)中酵母和絲狀真菌數量分別為2.1×105、1.1×104CFU/g,約為制麥過程中微生物峰值的1/3。

圖1 制麥過程中酵母及絲狀真菌數量變化情況Fig.1 Amount changes in yeast and filamentous fungi during malting

2.2 制麥過程中可培養優勢真菌的分離與鑒定

2.2.1 制麥過程中可培養真菌的分離與純化

從制麥工藝的6個階段樣品中共分離得到174株真菌,包括酵母及酵母樣真菌93株、絲狀真菌81株。酵母及酵母樣真菌菌落表現為表面光滑、不透明和黃油質的平坦菌落;蠟狀、不透明,乳白色至奶油白;奶油質地和粉紅色或紅色等。菌落直徑為1～4 mm,小部分菌落直徑小于1 mm。光學顯微鏡下酵母菌的細胞形態主要有球形、近球形、卵圓形、橢圓形、檸檬形等形狀,直徑為1.5～5 μm。生長于PDA培養基上的絲狀真菌,菌落形態為放線狀皺紋或中心有臍狀突起,質地絨狀,略帶絮狀,也有茸毛狀、絮狀菌落,菌落顏色為淺黃色、褐色、灰色等。部分真菌菌落形態和顯微結構如圖2所示。

圖2 制麥過程中部分可培養真菌菌落及顯微結構圖Fig.2 Colony and microstructure photos of some fungi from malting

2.2.2 可培養真菌的分子鑒定

根據菌落形態及顯微結構對分離得到的真菌進行初步分組,將菌落形態及顯微結構相類似的菌株劃分為一組。選取菌落形態差異較大的代表菌株進行ITS-rRNA基因序列測序分析,共測序78個菌株。如表1所示,ITS基因序列一致性比對結果表明,78株真菌的ITS基因序列與數據庫中2個門(Basidiomycota和Ascomycota)10個目的25個模式菌株ITS序列的一致性均大于98%。其中,絲狀真菌有10種,酵母狀真菌有15種。絲狀真菌主要分離自大麥原料樣本,這可能與大麥原料水分過低,不適合酵母類微生物生長相關[14]。浸麥之后,大麥水分增加明顯,促進了酵母快速繁殖和真菌休眠孢子萌發。因此,在浸麥結束和發芽初期(M2和M3)樣品中的真菌以酵母為主,特別是擔子菌門的酵母。這與擔子菌門酵母在低于20 ℃的環境中生長良好密切相關[13-15]。與浸麥和發芽初期不同,發芽結束樣本(M4)至成品麥芽(M6)中的優勢真菌為子囊菌,與LAITILA等[14]的研究結果一致。

以25株代表菌株的ITS-rRNA序列(GenBank登錄號為ON008181-ON008205)及與其相似度最高的模式菌株構建系統發育樹。如圖3所示,所得菌株與GenBank內相應同源性參考菌株聚為一支,且大多數菌株與同源性參考菌株聚為一支的支持率為100%,顯示分離菌株與模式菌株存在很強的親緣關系。

圖3 基于ITS-rRNA序列構建的可培養真菌系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of the culturable fungi based on the ITS-rRNA gene sequences

2.3 制麥過程中真菌菌群的Alpha多樣性分析

制麥過程中真菌菌群的Alpha多樣性分析結果如表2所示。每個樣品的Coverage值均達到0.999,表明各樣品文庫的覆蓋率高,測序結果足夠體現樣品中真菌菌群多樣性的真實情況。發芽24 h樣品(M3)的Shannon指標達到最高值1.58,意味著真菌的物種多樣性在此階段最高。Chao和Ace是用來評價菌群豐富度的指標,數值越大,豐富度越高[16]。Chao和Ace指數均呈現先下降后升高的趨勢。在原料大麥(M1)中,Ace和Chao的數值分為52.5和54.0,均高于發芽結束的樣品(M4),說明大麥原料中的真菌豐富度非常高。因此,有學者將大麥種子視為一個珍貴的天然菌種庫[17]。浸麥后樣品(M2)的Ace和Chao值分別降低至30.6和32.0,這可能是浸麥操作洗掉了大麥表面附著的真菌所致。隨后,真菌的豐富度呈現上升趨勢,直至最終成品麥芽(M6),Ace和Chao的值達到55.0和53.0的水平。這表明較高的焙焦溫度未降低成品麥芽中真菌的豐富度。這與BIANCO等[18]的研究結果一致。

2.4 制麥過程中真菌菌群的Beta多樣性分析

制麥過程6個不同階段樣品中真菌OTUs的聚類分析和主成分分析結果如圖4所示。基于OTUs的聚類分析顯示了不同樣本中真菌菌群結構的相似性或差異關系[19]。如圖4-A所示,大麥(M1)菌群單獨為一支。浸麥結束后,大麥水分含量上升,酵母和休眠孢子萌發,真菌菌群相似性增加,因此,浸麥結束樣品(M2)和發芽24 h樣品(M3)真菌菌群聚為一支。發芽結束后,樣品中真菌的種類和數量達到峰值。隨后的排潮和焙焦環節因溫度較高,不利于真菌種類和數量的增加,樣品中的真菌群落具有較高相似度。因此,發芽結束樣品(M4)、排潮結束樣品(M5)和成品麥芽(M6)聚為一支。

A-聚類分析;B-主成分分析圖4 制麥過程6個不同階段樣品中真菌OTUs的 聚類分析及主成分分析Fig.4 Cluster analysis and principal component analysis on fungus OTUs from the 6 different stages of malting

如圖4-B所示,對制麥過程樣品進行主成分分析,以樣品點之間的距離來衡量其真菌群落結構組成的相似或差異程度。分析發現,大麥原料(M1)與各個樣品距離相對較遠,即真菌群落差異較大;浸麥結束樣品(M2)和發芽24 h樣品(M3)距離較近,發芽結束樣品至成品麥芽(M4、M5、M6)聚在一起,與圖4-A聚類分析結果相一致。聚類分析與主成分分析結果相互佐證,進一步表明制麥前期樣品(M2和M3)與制麥后期樣品(M4～M6)真菌群落差異明顯,但各相鄰樣品的真菌群落結構差異性不明顯,即進入制麥后真菌群落結構的變化是一個逐步演替的過程。

2.5 制麥過程中真菌菌群結構多樣性分析

為深入揭示制麥過程中真菌菌群在各分類學水平上的組成情況,對不同制麥階段樣品中真菌菌群結構的門水平和屬水平的特征進行分析(圖5)。在門水平上,所有樣品中真菌群落共包含2個門(圖5-A)。其中,子囊菌門為大麥原料樣品(M1)中的優勢菌門,其相對豐度為81.79%,隨后呈現先下降后上升的趨勢,并保持在95.33%～97.82%的相對豐度,為整個制麥過程中的優勢菌門。擔子菌門在浸麥(M2)和發芽24 h(M3)階段為優勢菌門,浸麥階段相對豐度達到98.17%,隨后呈下降趨勢。

A-門水平;B-屬水平圖5 不同制麥階段真菌群落結構圖Fig.5 Community structure of the fungi from different stage in the malting process

從不同制麥階段的樣品中共鑒定出57個真菌屬,其中未被分類的酵母目(unclassified_o_Saccharomycetales)、線黑粉酵母屬(Filobasidium)、鏈格孢屬(Alternaria)等13個真菌屬平均相對豐度≥1%,為優勢菌屬(圖5-B)。大麥原料(M1)中相對豐度最高的優勢真菌屬為Alternaria,相對豐度為68.03%,浸麥結束(M2)后下降至1.3%,可能是由于浸麥水的沖洗,或是浸麥溫度相對較低不適于該屬的真菌生長所致。Filobasidium是浸麥結束(M2)和發芽前期(M3)樣品中相對豐度最高的優勢菌屬,在大麥原料中該屬的相對豐度僅為6.99%,但在浸麥結束和發芽前期分別上升至84.51%和69.79%。浸麥階段和發芽初期為制麥過程中濕度條件最大的2個階段,推測Filobasidium的生長可能和環境較高的濕度有關[20]。發芽結束(M4)、排潮結束(M5)和成品麥芽(M6)階段的絕對優勢菌屬是unclassified_o_Saccharomycetales,并一直保持著較高的豐度。

2.6 制麥過程中可培養真菌產胞外酶分析

將分離得到的真菌接種至蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶及纖維素酶篩選培養基上,考察各菌株產胞外酶的情況,結果如表3所示。使用透明圈法篩選到了7株產蛋白酶的真菌、6株產淀粉酶的真菌、7株產木聚糖酶的真菌和12株產纖維素酶的真菌菌株。至少產1種胞外酶的真菌共有16株,其中,6株真菌具有同時產3種胞外酶的能力,2株真菌具有同時產4種胞外酶的能力。

表3 制麥過程中可培養真菌產胞外酶的能力Table 3 The ability of the culturable fungi from malting to produce extracellular enzymes

2.7 產酶菌株對麥芽品質的影響

糖化力是指麥芽中酶分解自身胚乳淀粉的能力。浸出率是指每百克無水麥芽中可溶性物質的含量,在一定程度上反映了大麥籽粒發芽過程中干物質的損耗情況[21]。在制麥過程中接種產酶菌株后,麥芽糖化力和浸出率的變化情況如圖6所示。結果表明,接種產胞外酶的菌株后,麥芽的糖化力均有所提升,以接種PAT-Y265(R.mucilaginosa)菌株的提升最為顯著,這可能是因為該菌株產生的胞外淀粉酶提高了麥芽糖化力。由圖6-B可知接種產胞外酶菌株也提升了麥芽的浸出率,特別是PAT-Y265(R.mucilaginosa)、PAT-M17(C.halotolerans)和PAT-M25(T.barcinensis)對麥芽浸出率的提升最為明顯,達到了顯著的水平。這可能是因為它們分泌的胞外纖維素酶、蛋白酶、木聚糖酶促進了麥芽胚乳細胞壁、蛋白質等生物大分子的水解[22],進而提高了麥芽的浸出率。產胞外酶菌株接種麥芽的結果再次表明,合理控制制麥過程中的真菌組成有助于提升麥芽糖化力、浸出率等品質指標。

A-糖化力;B-浸出率圖6 產酶菌株對麥芽糖化力和浸出率的影響情況(P<0.05)Fig.6 Effect of extracellular enzyme producing strains on malt diastatic power and malt extract (P<0.05)

3 結論

本研究利用傳統分離培養方法,對制麥過程中不同階段樣品的真菌群落進行了分析。結果表明,制麥過程中酵母菌數量遠高于絲狀真菌,且酵母菌和絲狀真菌呈現先升高后下降的趨勢。利用分離培養法在不同制麥階段采集的樣品中分離到174株真菌,形態學及ITS-rRNA序列分析結果表明,這些真菌屬于2門、17屬、25種。其中,絲狀真菌主要分離自大麥原料,在浸麥結束和發芽初期的樣品中主要分離到擔子菌門酵母,而發芽結束到成品麥芽樣品中以子囊菌酵母為優勢菌群。利用平板篩選法對制麥過程中可培養真菌的蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶和纖維素酶4種水解酶活性進行篩選,結果表明制麥過程中真菌群落對麥芽水解酶系有一定貢獻作用。此外,選取了5株產胞外酶能力較高的菌株并將其應用到制麥過程中,所得成品麥芽的糖化力和浸出率均有所提升,進一步說明這些微生物在制麥過程中具有促進麥芽溶解的作用。

對樣品的高通量測序結果表明,在浸麥結束(M2)時真菌物種豐富度最低,隨后呈上升趨勢。聚類分析與主成分分析結果相互佐證,制麥前期樣品(M2和M3)與制麥后期樣品(M4～M6)的真菌群落有明顯差異,但各相鄰樣本的真菌群落結構差異性不明顯,說明進入制麥后真菌群落結構的變化是一個逐步演替的過程。從制麥樣品中共檢出2真菌門、58真菌屬。門水平上,大麥原料(M1)及制麥后期(M4～M6)樣本以Ascomycota為優勢門,而Basidiomycota為浸麥結束(M2)和發芽前期(M3)樣本中的優勢門,此結果與平板分離培養結果一致。制麥過程的優勢菌屬主要有unclassified_o_Saccharomycetales、Filobasidium和Alternaria等13屬。

本研究利用分離培養結合高通量測序技術揭示了制麥過程中豐富的真菌群落多樣性及其演替情況,這些真菌在制麥生態系統中扮演著重要的角色,對麥芽產品的質量有著重要影響,其具體功能性及安全性有待深入研究。此外,通過對制麥過程中真菌群落的分析,在豐富了制麥微生物資源的同時,也為麥芽質量控制以及麥芽食品安全控制提供了重要的理論依據。