姜辣素對餐廚垃圾厭氧發酵的影響及調控研究

薛文娜,周云龍,趙明星*,阮文權

1(江南大學 環境與土木工程學院,江蘇 無錫,214122)2(江蘇省厭氧生物技術重點實驗室,江蘇 無錫,214122) 3(江蘇晨潔再生資源科技有限公司,江蘇 張家港,215600)

餐廚垃圾是指居民在日常生活和消費過程中產生的生活廢棄物,是城市固體廢棄物的主要組成。隨著我國人民生活水平的提高和城市化進程的發展,餐廚垃圾約占全國垃圾的10%～60%[1]。餐廚垃圾具有成分復雜、有機物含量高、含水率高等特點,可以通過微生物將其降解并回收甲烷、氫氣等能源[2]。此外,基于國內垃圾分類的普及以及國家“碳達峰,碳中和”目標要求,餐廚垃圾的資源化處理成為重要的處置途徑[3]。厭氧發酵技術是一種被廣泛使用的處理方式,可用于餐廚垃圾的處置以及生產高價值附加產品。

由于餐廚垃圾組成復雜,因此其對厭氧發酵體系的影響因素較多,如氨氮和揮發性脂肪酸抑制等[4-5]。隨著研究的深入,更多厭氧發酵的其他影響因素被發現,近年來有學者研究了餐廚垃圾中的辣素對厭氧發酵的影響。DU等[6]研究發現辣椒素濃度的提高降低了餐廚垃圾厭氧產甲烷,這可能是因為辣椒素通過改變關鍵酶活性,降低細胞內NAD+/NADH比值使得細胞死亡,對水解、產酸和產甲烷有抑制作用。針對此類抑制效應,預處理方法可以緩解辣素的影響,提高復雜底物的降解率,從而提升甲烷產量。辣素可以分為多種具體成分,包含大蒜素、辣椒素和姜辣素等,其中姜辣素是生姜中所有辣味物質的總稱,6-姜酚是姜辣素中的主要代表活性物質。但是目前對姜辣素在餐廚垃圾厭氧發酵產甲烷中的影響及其抑制解除的研究還較少。采用預處理方式解除姜辣素對餐廚垃圾厭氧消化的抑制非常必要。YUE等[7]采用過碳酸鈉/紫外線產生的自由基降解辣椒素,提高脂質和餐廚垃圾厭氧發酵甲烷產量。史進程等[8]發現在25、60 ℃熱處理條件下,可以改變6-姜酚濃度。本文選取熱解、超聲和光催化氧化3種預處理手段,這些方式具有可操作性強、技術成熟和效果好等優勢。

本文以餐廚垃圾厭氧發酵為研究對象,研究了不同濃度的姜辣素對餐廚垃圾厭氧發酵的影響。對比分析了高溫、超聲和TiO2聯合紫外光催化氧化3種預處理方法,研究了不同預處理方式解除姜辣素對餐廚垃圾厭氧發酵抑制的效果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

餐廚垃圾中每1 kg餐廚垃圾分別有400 g大米、350 g卷心菜、200 g豬肉和50 g豆腐;所有食材煮熟后按照比例進行混合;厭氧顆粒污泥取自無錫市某食品廠的厭氧發酵池;接種污泥和底物的性質如表1所示。由于6-姜酚為姜辣素主要代表成分,本文選取6-姜酚為研究對象,6-姜酚(純度96%),成都普瑞法科技有限公司。

表1 接種污泥和餐廚垃圾的主要特性Table 1 Characterizations of the inoculated sludge and food waste

1.2 實驗設計

1.2.1 不同濃度姜辣素對餐廚垃圾厭氧發酵影響實驗

實驗在工作容積為400 mL的500 mL血清瓶中進行,反應溫度為(37±0.5) ℃。實驗開始前,利用葡萄糖馴化取自食品廠的厭氧污泥7 d,底物與接種污泥的比例為1∶1.5(VS比)[9]。每個反應瓶中加入8 g VS餐廚垃圾和12 g VS接種污泥,每1 g總VS餐廚垃圾中加入不同量的6-姜辣素(4、8、12、16、20 mg),實驗組分別標記為B1、B2、B3、B4、B5。不添加6-姜辣素的試驗作為空白組,標記為CK。采用NaHCO3和3 mol/L氫氧化鈉或鹽酸溶液將各組的初始pH值調節為8.0。

1.2.2 不同預處理條件下餐廚垃圾厭氧發酵產甲烷實驗

實驗中污泥的馴化和接種比同1.2.1節。由1.2.1節的實驗結果發現B4組濃度有顯著的抑制影響,根據B4組的比例濃度,每個反應瓶中加入6 g VS餐廚垃圾、9 g VS接種污泥和16 mg/g總揮發性固體姜辣素進行解抑制實驗。上述物質混合后分別在60 ℃下處理1 h[8]、超聲功率為20 000 Hz下處理1 h[10]、1.25 g/L TiO2和紫外燈聯合處理1 h[11],這3種預處理的反應瓶分別標記為A1、A2、A3,其中對照組標記為K1。在反應開始前,用NaHCO3和3 mol/L的氫氧化鈉或鹽酸溶液調節反應體系的初始pH值為8.0。

1.3 實驗分析方法

TS、VS采用重量法測定,溶解性化學需氧量(soluble chemical oxygen demand, SCOD)測定根據《國家水和廢水監測分析方法》[12]。C、N、H、S、O采用元素分析儀測定,pH采用pH計測定。揮發性脂肪酸(total volatile fatty acid, TVFAs)濃度采用氣相色譜儀(日本島津GC-2010 PLUS)測定。甲烷產量采用AMPTS測定[13]。蛋白質利用凱式定氮法[14]測定,可溶性碳水化合物采用苯酚-硫酸法測定[15]。根據試劑盒方法測定乙酸激酶(acetokinase,ACK),堿性蛋白酶(alkaline protease,AKP),脫氫酶(dehydrogenase,DHA)活性,通過分光光度法測定輔酶F420活性[16]。反應結束后的污泥胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)采用ZHANG等[17]的方法進行提取,利用熒光分光光度計對松散型EPS(loosely bound EPS, LB-EPS)和緊密型EPS(tightly bound EPS, TB-EPS)進行激發-發射矩陣(excitation-emission matrix,EEM)光譜分析。掃描速度為12 000 nm/min,電壓為500 V。激發波長(excitation wavelength,Ex)為200～450 nm,發射波長(emission wavelength,Em)為250～550 nm,Ex和Em的狹縫和采樣間隔設置為5 nm,儀器的光譜校正被設定為自動校正。

1.4 微生物群落分析

取1.2.2節反應結束后各組的污泥放入不同離心管中,以4 000 r/min的速度旋轉5 min。丟棄上清液,剩余的沉淀物保存在無菌離心管中,并保存在干冰上,送到測序公司進行分析。利用特異性引物擴增細菌16S rRNA基因在V3～V4區。細菌的引物為806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) 和338F(5′- ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)。古菌引物為MLfF(5′-GGTGGTGTMGGATTCACACARTAYGCWAC AGC-3′)和MLrR(5′-TTCATTGCRTAGTTWGGRTAG TT-3′),提取樣品基因組后,測定DNA的產率和純度,PCR擴增后對產物進行純化,利用IlluminaMiseq進行高通量測序。

2 結果與分析

2.1 不同預處理方式對甲烷產量變化的影響

如圖1-a所示,在不同姜辣素添加情況下,餐廚垃圾厭氧發酵產氣量各有不同。反應初期各組產氣量增加,空白組在第20天以后產氣趨于平緩,但是實驗組在第30天后累積產氣量仍然增加。這說明添加姜辣素后,微生物需要一定的時間適應環境體系。當姜辣素濃度提高到8 mg/g VS時,餐廚垃圾的最大產甲烷量為578.00 mL/g VS。但是當姜辣素濃度提高到16 mg/g VS時,餐廚垃圾的厭氧發酵受到嚴重抑制,最終累積甲烷產量僅為164.76 mL/g VS,是空白組的34%。最終的累積產氣量從大到小分別為B2>B1>B3>CK>B4>B5。這表明一定濃度的姜辣素會抑制產甲烷過程,可能是因為姜辣素的加入會影響微生物的群落組成,降低物質傳輸速率,從而降低甲烷產量[6]。

a-不同濃度下累積甲烷產量;b-不同條件下累積甲烷產量圖1 不同濃度姜辣素的甲烷累計產量和不同預處理 條件下甲烷累積產量變化Fig.1 Cumulative methane yield at different concentration of gingerol and change in cumulative methane yield under different pretreatment conditions

與對照組相比,預處理組累積產氣量有明顯提高(圖1-b),這說明實驗組的預處理方式能夠解除姜辣素對餐廚垃圾厭氧發酵的抑制。最終的累積產氣量從大到小分別為A2>A3>A1>K1。其中超聲預處理效果最好,最終累積產甲烷量為111.17 mL/g VS,比對照組提高了3.12倍,提高效果優于YUE等[18]的研究結果,這可能是因為超聲處理過程中的空化過程會破壞姜辣素的結構,減少姜辣素對微生物的抑制,從而促進產氣[19]。其次是光催化氧化預處理組,最終累積產甲烷量為89.17 mL/g VS,比對照組提高了2.22倍,這可能是因為光催化氧化產生的羥基基團破壞了姜辣素的化學鍵。A1組反應結束時的累積產甲烷量為51.67 mL/g VS,是對照組的1.87倍。

2.2 不同預處理方式對pH、TVFAs和SCOD變化的影響

如圖2-a所示,pH值總體呈現先下降后上升的趨勢,pH在前期下降是因為餐廚垃圾中的大分子有機物被微生物降解為小分子有機物而釋放到液相中,小分子有機物被產酸菌利用生成揮發性有機酸,由于酸量的積累導致溶液中pH下降,K1、A1、A2、A3組的最低pH分別為6.65、6.92、6.94和6.76,由于NaHCO3的緩沖作用pH維持在適宜產甲烷菌生長的范圍(6.5～7.5)。圖2-b為反應過程中TVFAs的變化情況,反應前10 d總酸濃度迅速提高,在反應最后10 d趨于穩定。反應結束時各組的最終酸質量濃度分別為9.145(K1)、10.56(A1)、10.482(A2)和9.26(A3) g/L。圖2-c為SCOD的變化情況,餐廚垃圾中的大分子有機物被水解菌降解為小分子有機物后使得SCOD迅速升高到12 000 mg/L左右,但從第10天后SCOD濃度緩慢下降,這是因為有機質在被降解利用。在第14天以后,有機物濃度逐漸上升。在反應結束時,SCOD維持在12 000～15 000 mg/L。

圖2 不同預處理條件下pH值、TVFAs和SCOD變化情況Fig.2 Change of pH, TVFAs and SCOD under different pretreatment conditions

2.3 不同預處理方式對可溶性蛋白質和碳水化合物變化的影響

整個反應過程中蛋白質濃度整體呈現上升趨勢(圖3-a),在反應開始時蛋白質濃度迅速上升,反應結束時實驗組的蛋白質濃度都高于對照組。結束時A1、A2、A3組的蛋白質質量濃度分別為1 146.17、1 119.4、872.72 mg/L,而對照組的蛋白質質量濃度為833.01 mg/L。這可能是因為預處理能夠促進蛋白質從固相釋放到液相中。

可溶性碳水化合物的變化如圖3-b所示,反應初期有機物不斷水解,碳水化合物濃度迅速上升,在第12天左右下降到100～150 mg/L,在第15天左右小幅上升。反應結束時K1、A1、A2、A3組碳水化合物質量濃度分別為99.52、128.33、172.05、115.31 mg/L,實驗組的濃度比對照組高,這可能是因為預處理方式促進了碳水化合物的水解。ELBESHBISHY等[20]發現超聲預處理可以使可溶性蛋白增加約20%,可溶性碳水化合物提高17%,這與本文研究結果較一致。

2.4 不同預處理方式對污泥LB-EPS和TB-EPS變化的影響

通過3DEEM分析各組反應結束時污泥中LB-EPS和TB-EPS溶液中有機物的情況,檢測主要官能團,熒光強度用于表征溶液中有機物的分布。根據報道,有機物的3DEEM熒光光譜可分為2個區域,在這些區域誘導信號的物質分別為芳香蛋白物質I(Ex/Em:200～240/300～380 nm),可溶性微生物副產物的Ⅱ區(Ex/Em:250～280/280～380 nm)[21]。如圖4所示,峰A(Ex/Em:200～240/300～380 nm)對應芳香蛋白質類物質,峰B(Ex/Em:250～280/280～380 nm)代表可溶性微生物副產物。LB-EPS中的熒光強度峰要強于TB-EPS,這說明與緊密的胞外聚合物相比,松散的胞外聚合物中的有機物含量更高。A1組的熒光強度最大,這可能是因為熱解預處理能有效地刺激微生物分泌胞外聚合物。A2和A3組的熒光強度較弱,這說明超聲和光催化氧化對微生物的影響較小。TAO等[22]研究了大蒜素對餐廚垃圾和活性污泥共發酵體系的影響,在發酵液的三維熒光分析中有機質和酪氨酸類有機物兩個峰的熒光強度分別從1 956和2 010提高到2 816和2 802。但本研究中A1組兩個峰熒光強度僅為500.28和484.08,小于TAO等[22]的研究結果,這可能是因為處理的底物組成差異而引起的。

2.5 不同預處理方式對酶活性的影響

圖5為反應結束后各體系酶活性情況。總體上實驗組的酶活性都高于對照組,這說明預處理能夠提高細胞中各種酶的活性,促進物質的傳輸速度。ACK是發酵過程中控制乙酸生成的關鍵酶。乙酸激酶活性分別為對照組的103%(A1)、187.66%(A2)和157%(A3),比對照組都有提高。DHA是指能催化物質進行氧化還原反應的酶[23],實驗組的脫氫酶活性分別比對照組提高108.45%、179.27%和102.22%。AKP是能夠在堿性條件下水解蛋白質肽鍵的酶,A1、A2、A3組的堿性蛋白酶活性分別為對照組的146.12%、157.89%和103.51%。輔酶F420是一種產甲烷菌酶,主要參與CH4的生成過程[24],實驗組中輔酶F420活性較對照組分別提高了3.0%、45.83%和37.92%,這表明預處理方式可提高輔酶F420的活性,促進甲烷的生成。NEUMANN等[25]發現經過超聲預處理后樣品的蛋白酶活性比空白提高1.8～4.3倍,這與本文的結果較一致。

2.6 不同預處理方式對微生物菌群變化的影響

如圖6-a所示,細菌群落在門水平上分布的優勢菌以Bacteroidetes、Firmicutes、Synergistota和Actinobacteria為主。對照組污泥中豐度最大的是Bacteroidetes(21.66%)、Firmicutes(22.41%)和Actinobacteria (19.70%)。經過預處理后,污泥中的微生物結構發生了變化。Bacteroidetes和Actinobacteria是厭氧發酵過程主要的產酸菌,對碳水化合物具有降解作用,其相對豐度的提高也會導致揮發性脂肪酸濃度的提高,A1組相比對照組Firmicutes和Chloroflexi的豐度增加,Chloroflexi能夠降解餐廚垃圾中的多糖和單糖,并能夠促進乙酸的生成從而為產甲烷菌提供底物。LI等[26]研究表明,Chloroflexi參與厭氧發酵過程,有利于促進水解發酵的進行。A2組中Caldatribacteriota和Proteobacteria豐度增加,Proteobacteria的類型多樣,不僅能利用葡萄糖、丙酸和丁酸等小分子化合物,而且能在水解酸化中利用有機物產生乙酸為產甲烷菌提供底物。A3組的Firmicutes豐度較高,Firmicutes可以分泌多種胞外酶降解大分子物質,如蛋白質和脂類等。因此,Firmicutes相對豐度的提高加快了有機物的降解,為產甲烷菌提供營養。實驗組和對照組的微生物群落結構差異說明預處理可以改變微生物結構,促進甲烷的生成。

圖6-b為反應結束后各體系污泥中古菌群落在屬水平上的變化。優勢菌是Methanothrix、Methanobacterium、Methanolinea,其中,Methanothrix屬于嗜乙酸型產甲烷菌,Methanobacterium和Methanolinea屬于嗜氫型產甲烷菌。與對照組接種污泥相比,實驗組中的Methanothrix在厭氧發酵體系內有所變化,分別提高了6.0%、8.0%、1.0%,說明預處理手段能夠提高嗜乙酸型產甲烷菌的生長。然而,與對照組相比,Methanobacterium由41%下降到18%～24%。此外,與實驗組相比,對照組Methanolinea的相對豐度較小,這表明經過預處理后能促進微生物從嗜氫型產甲烷菌向嗜乙酸型產甲烷菌演替,LI等[27]認為,Methanobacterium可以利用H2和CO2轉化為CH4。而與K1相比,實驗組2種嗜氫型產甲烷菌的相對豐度較低,這表明預處理可以促進嗜乙酸型產甲烷菌的富集,從而加快乙酸向CH4的轉化。

a-細菌門水平相對豐度;b-古菌屬水平相對豐度
圖6 細菌門水平和古菌屬水平的相對豐度
Fig.6 Relative abundances of bacterial phylum and archaeal genus

3 結論

研究表明姜辣素濃度大于16 mg/g總揮發性固體時,對餐廚垃圾厭氧發酵產甲烷有影響。姜辣素的預處理對解除餐廚垃圾厭氧發酵的產氣抑制具有較好的效果。其中超聲預處理后餐廚垃圾的產氣量最高,是對照組的4.12倍。光催化氧化預處理下的產氣量為對照組的3.22倍,熱解預處理效果最差,最終產氣量是對照組的1.87倍。與對照組相比,實驗組的可溶性有機物含量較高,預處理可以促進有機質的釋放。預處理還提升了ACK、AKP、DHA和輔酶F420的活性。預處理可以改變微生物群落結構,促進Firmicutes、Chloroflexi和Proteobacteria菌的生長,同時產甲烷古菌從嗜氫型向嗜乙酸型演替。本文研究結果可為餐廚垃圾厭氧發酵的抑制解除提供借鑒,但本研究為批式反應,后續需要在連續處理情況下,深入研究姜辣素對餐廚垃圾的影響及其解除方式。