基于模擬酶切的大豆7S球蛋白酶解改性探究

陳林,ETTELAIE Rammile,余林,陳維

1(廣東工業(yè)大學 輕工化工學院,廣東省植物資源生物煉制重點實驗室,廣東 廣州,510006) 2(英國利茲大學 食品科學與營養(yǎng)學院,英國 利茲,LS29JT)3(南方醫(yī)科大學 附屬花都醫(yī)院,廣東 廣州,510800)

果蔬汁飲料、碳酸飲料、運動飲料等酸性飲料深受各國消費者喜愛,然而隨著人們健康消費意識提升,成分單一的酸性飲料已無法滿足消費者營養(yǎng)需求。大豆蛋白是中國大宗優(yōu)質植物蛋白資源,具有較高的營養(yǎng)價值和獨特的保健功能。將大豆蛋白添加到酸性飲料中,不僅可提升產品的風味,還可改善現(xiàn)有酸性飲料營養(yǎng)成分單一的缺陷,滿足消費者營養(yǎng)均衡的需求。然而大多數(shù)酸性飲料的pH值介于3.0～4.5,大豆蛋白的等電點在pH 4.5附近,大豆蛋白在等電點區(qū)域絮凝沉淀限制了其在酸性飲料中的應用[1-2]。國外已對大豆蛋白的改性技術和酸溶特性進行了大量深入研究,取得了系列成果,美國和日本已開發(fā)出具有良好酸溶特性的大豆蛋白產品,廣泛應用于各種酸性飲料[3]。但這些技術基本沒有申請專利,屬于技術機密。

酶解改性是利用蛋白水解酶在溫和條件下催化蛋白質中特定肽鍵水解斷裂,所生成的小分子肽親水性更強,分子柔順性更好,更易與水分子發(fā)生水合作用,因此具有更好的溶解特性[4-6]。酶解改性安全高效,無氨基酸破壞和有害物質產生,故被認為是食品蛋白改性的最佳方法[4]。蛋白酶的選擇對酶解改性的效果至關重要,目前的研究現(xiàn)狀往往是隨機選取蛋白酶,然后基于“試錯法”進行實驗篩選。然而蛋白酶的種類繁多,從大量蛋白酶中進行實驗篩選,工作量大且存在一定盲目性[5-7]。

隨著現(xiàn)代生物信息學的快速發(fā)展,各種蛋白質數(shù)據庫逐步完善,許多蛋白酶的酶切位點也已比較清楚,一種基于已知蛋白質氨基酸序列的模擬酶切技術成為解決當前瓶頸的有效手段[8]。PeptideCutter是由瑞士生物信息學研究所(ExPASy)開發(fā)的蛋白模擬酶切軟件,可通過輸入蛋白氨基酸序列和蛋白酶酶切位點,模擬蛋白酶解;輸出結果包括酶切肽段的氨基酸序列、分子質量、酶切位點和水解度等。該軟件還提供了ExPASy開發(fā)的各種在線蛋白分析工具,可用于分析生成肽段的理化性質和生物活性,從而預測酶解改性的效果,指導選擇適用蛋白酶[9]。如于志鵬等[10]采用PeptideCutter軟件對5種雞蛋蛋白進行模擬酶切,然后利用ExPASy提供的在線工具對生成肽段的血管緊張素轉化酶抑制活性和溶解特性進行分析預測,建立了適用水解酶的高通量篩選方法。BLEAKLEY等[11]采用PeptideCutter對燕麥蛋白進行模擬酶切,以生成的寡肽(含有10個氨基酸以下的肽段)數(shù)量為指標建立肽庫,從89種蛋白酶中篩選出4種優(yōu)勢酶,顯著降低了實驗成本并制備出了高二肽基肽酶抑制活性的酶解產物。值得注意的是利用模擬酶切的方法篩選適用水解酶,首先應掌握蛋白的氨基酸序列信息。目前大豆蛋白各組分中,只有7S球蛋白(β-伴大豆球蛋白)的完整氨基酸序列已經破譯[12],然而基于模擬酶切指導改善7S酸溶特性的研究國內外還未見報道。因此,本研究以7S為底物蛋白,在PeptideCutter軟件中采用不同酶切位點的蛋白酶對7S進行模擬酶切,然后采用ExPASy在線工具對生成肽段的酸溶特性進行分析預測,篩選出優(yōu)勢蛋白酶并進行實驗驗證。本研究為高效篩選適用于改善大豆蛋白酸溶特性的蛋白酶提供了新的思路和方法指導,也有利于實現(xiàn)大豆蛋白產品在酸性飲料中的應用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂大豆粕(蛋白質量分數(shù)51.3%,干基),山東禹王食品有限公司;蛋白酶K(EC 3.4.21.62,3.0×105U/g)、胰凝乳蛋白酶(EC 3.4.21.1,1.5×106U/g)、胰蛋白酶(EC 3.4.21.4,2.5×105U/g),上海源葉生物科技有限公司;胃蛋白酶(EC 3.4.23.1,6.0×105U/g),北京鼎國生物技術有限公司;嗜熱菌蛋白酶(EC 3.4.24.27,3.5×105U/g)、牛血清蛋白,美國Sigma-Aldrich公司;電泳預制膠及相關試劑,美國Bio-rad公司;100%酸橙汁,美國Tropicana公司;其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

PeptideCutter模擬酶切軟件,瑞士生物信息學研究所;HJ-6A多頭磁力攪拌器、DF-101S集熱式磁力攪拌器,金壇市城東新瑞儀器廠;CR22G 高速冷凍離心機,日本日立電器公司;KDN-40A 凱氏定氮儀,上海新嘉電子有限公司;ZYS20-1000超聲波粉碎機,杭州振源儀器有限公司;FA2204B電子天平,上海天美天平儀器有限公司;TIM840自動電位滴定儀,美國Radiometer公司;Mini-protean IV電泳系統(tǒng),美國Bio-Rad公司;PHS-3C pH計、L6S紫外可見分光光度計,上海儀電分析儀器有限公司;Zetasizer Nano ZE-90納米粒度及電位分析儀,英國Malvern公司;Turbiscan MA2000穩(wěn)定性分析儀,法國Formulaction公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 大豆7S球蛋白的制備與純化

參考DEAK等[13]的方法,稍加改進,過程簡述如下:低溫脫脂豆粕粉碎過200目篩,所得粉體加入Tril-HCl緩沖液(0.03 mol/L,下同),料液比為1∶15(g∶mL),調節(jié)pH值至8.5,45 ℃攪拌1 h;離心后(9 000×g,30 min)去渣得蛋白浸提液;在浸提液中加固體NaHSO3至0.3 mmol/L、加CaCl2至0.02 mmol/L,調pH值至6.4,4 ℃靜置過夜,離心后(6 500×g,30 min)收集上清液為7S球蛋白富集組分;在7S富集組分中加固體NaCl至0.25 mol/L,調節(jié)pH值至5.5,磁力攪拌1 h,離心后(9 000×g,30 min)收集上清液;兩倍體積冰水稀釋上清液,攪拌1 h,調pH值至4.8(7S等電點),離心(9 000 ×g,30 min)收集沉淀并溶解于Tris-HCl緩沖液,調節(jié)pH值至6.2,離心后(9 000×g,30 min,4 ℃)收集上清液,調節(jié)pH值至7.6得到粗β-伴大豆球蛋白提取液。向提取液中加入固體(NH4)2SO4至飽和度51%,離心后(9 000×g,30 min)收集上清液,加入固體(NH4)2SO4至飽和度100%,所得沉淀用磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L,pH 7.6)溶解,透析脫鹽后冷凍干燥得到大豆7S球蛋白,研磨后過40目篩,于密封干燥容器中保藏備用。

1.3.2 大豆7S球蛋白主要成分測定

水分含量測定參照GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》(直接干燥法);灰分測定參照GB 5009.4—2016《食品中灰分的測定》(灼燒稱重法);蛋白質含量測定參照GB 5009.5—2016《食品中蛋白質的測定》(凱氏定氮法);脂肪含量測定參照GB/T 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》(索氏抽提法)。

1.3.3 大豆7S球蛋白的模擬酶切及優(yōu)勢蛋白酶的選擇

INCI中文名稱：生育酚（維生素E），英文名稱：Tocopherol，CAS號：1406-66-2，英文名：Vitamin E。維生素E是抗氧化劑，溶于脂肪和乙醇等有機溶劑，不溶于水，對熱、酸穩(wěn)定。

從UniProt數(shù)據庫中(https://www.uniprot.org/)搜集大豆7S球蛋白α′、α、β亞基的氨基酸序列及相關資料(表1),整理后倒入模擬酶切軟件PeptideCutter的蛋白數(shù)據庫。搜集和總結國內外報道用于改善蛋白溶解特性的蛋白酶,然后選用PeptideCutter中提供的39種蛋白酶對7S中3種亞基分別進行模擬酶切,內置軟件經計算得出不同酶水解釋放的肽片段數(shù)量、氨基酸序列及水解度。將模擬酶切生成肽段氨基酸序列導入Compute pI/Mw在線分析軟件(https://web.expasy.org/compute_pi/),得到酶切肽段的等電點(isoelectric point, pI)。根據蛋白等電點與溶解特性的關系,從生成肽段中挑選pI>pH 6.0或pI

表1 大豆7S球蛋白中α′、α和β亞基的氨基酸 序列及相關資料Table 1 Amino acid sequences and related information of α′、α and β subunits for soy 7S globulin

1.3.4 大豆7S球蛋白的酶解及水解度(degree of hydrolysis,DH)測定

將上述制備的7S球蛋白分散到去離子水中配制成50 g/L的分散液,常溫下攪拌2 h。對7S分散液進行超聲波預處理以提高其酶解敏感性,超聲功率400 W,處理時間10 min(每處理5 s,停1 s)。預處理后,采用1 mol/L HCl溶液和1 mol/L NaOH溶液調節(jié)樣品分散液pH穩(wěn)定至酶解最適值,置于恒溫水浴鍋中,調節(jié)水浴溫度至最適酶解溫度,啟動磁力攪拌器,然后加入一定量的蛋白酶進行酶解(酶用量為1.0%,質量分數(shù),蛋白酶/底物蛋白)。酶解過程中采用自動電位滴定儀自動滴加0.1 mol/L NaOH溶液入樣品分散液,從而控制pH值恒定為最適值。在不同酶解時間(30～360 min)記錄堿液消耗量,并根據pH-stat法計算酶解產物的DH[14]。酶解至終點時,將酶解液置于沸水浴中加熱滅酶15 min。冷卻至室溫后在8 000×g下離心15 min后取上清液,調節(jié)pH值至7.0后冷凍干燥,研磨過40目篩,然后置于密封干燥容器中保藏備用。樣品命名由底物蛋白和蛋白酶組成。例如7SH-蛋白酶K是指經蛋白酶K酶解改性后制備的7S酶解產物。

1.3.5 蛋白質溶解性的測定

將蛋白樣品分散到去離子水中配制成10 g/L的分散液,常溫下攪拌2 h。采用1 mol/L HCl溶液和1 mol/L NaOH溶液調節(jié)樣品分散液pH穩(wěn)定至目標pH(3.0～7.0),然后在8 000×g下離心15 min后取上清液。上清液中蛋白含量采用Lowry法[15]測定,以牛血清蛋白為標準物做標準曲線。蛋白質的溶解度(protein solubility,PS)表示為上清液蛋白濃度占總蛋白濃度的百分比。

1.3.6 SDS-PAGE

采用Bio-rad公司的預制膠進行電泳實驗,該產品濃縮膠質量分數(shù)為4%,分離膠為質量分數(shù)4%～15%的梯度膠。將樣品溶解于樣品緩沖液(0.062 5 mol/L Tris-HCl buffer (pH=6.8),20 g/L十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulphate, SDS-PAGE),5%(體積分數(shù))巰基乙醇,25%(體積分數(shù))甘油和0.1 g/L 溴酚藍)中配制成質量濃度為10 mg/mL的分散液。95 ℃下水浴加熱5 min,離心后(8 000×g,15 min)取上清液。樣品上樣量為10 μL。凝膠電泳在恒壓下進行,在濃縮膠中電壓為60 V,進入分離膠后增至150 V。凝膠染色及脫色后,在凝膠成像系統(tǒng)中進行成像處理,采用Quantity-One軟件對電泳圖譜進行分析。標準蛋白樣品分子質量范圍14.4～97.4 kDa。

1.3.7 蛋白溶液Zeta電位的測定

1.3.8 酶解改性7S球蛋白在酸性果汁中的穩(wěn)定性測試

將市售酸橙汁(pH 3.86)分成若干份,加入酶解改性后的7S樣品,添加量為50 g/L,然后在室溫下攪拌2 h。蛋白果汁中加入疊氮鈉(0.2 g/L)抑制微生物生長,并置于4 ℃冰箱中靜置貯藏24 h。貯藏后,采用Turbiscan MA2000穩(wěn)定性分析儀測定蛋白果汁樣品的背散射光(backscattering coefficient, BS)曲線,用于評估蛋白果汁的穩(wěn)定性。測試過程中,光源檢測器從樣品瓶底部掃描至樣品瓶頂部,掃描范圍為0～45 mm,測定溫度為25 ℃。

1.3.9 數(shù)據統(tǒng)計分析

試驗結果都是3次測定的平均值,采用Duncan新復極差檢驗結果平均值間的顯著性差異(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 大豆7S球蛋白的主要成分及亞基組成

本論文以脫脂豆粕為原料,采用等電點沉淀法制備大豆7S球蛋白,然后采用硫酸銨沉淀法(鹽析)對產物進行純化,7S產品的得率為12.4%,主要成分含量(質量分數(shù))為:蛋白93.1%,水分5.7%,灰分0.9%,脂肪0.02%。采用SDS-PAGE分析該7S產品的亞基組成,結果見圖1。通過與文獻報道的大豆蛋白組分和7S亞基組成[16]進行比較,發(fā)現(xiàn)本文采用的脫脂豆粕原料(條帶1)含有7S球蛋白(α′-7S、α-7S,β-7S)和11S球蛋白(A1-A5-11S,B-11S),而所制備的7S產品只含有7S球蛋白和少量雜蛋白(主要為α與β亞基之間的蛋白電泳條帶)。通過對蛋白電泳條帶的光密度進行計算分析,得出該產品中7S球蛋白的純度為85.3%,其中α′亞基占15.2%,α亞基占48.4%,β亞基占21.7%。

M-蛋白標準品;1-脫脂豆粕原料;2-對照7S;3-7SH-蛋白酶K;4-7SH- 胃蛋白酶;5-7SH-嗜熱菌蛋白酶;6-7SH-胰凝乳蛋白酶;7-7SH-胰蛋白酶圖1 大豆7S球蛋白及其酶解產物的SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE profiles of soy 7S globulin and 7S hydrolysates prepared with various proteases

2.2 目標肽庫的建立和優(yōu)勢蛋白酶的選擇

本研究利用PeptideCutter軟件對7S進行模擬酶切,然后將生成肽段的氨基酸序列導入Compute pI/Mw在線分析軟件,得到肽段的pI。根據蛋白質的等電點與溶解特性的關系,在模擬酶切肽段中選擇pI>pH 6.0或pI胃蛋白酶(47.2)>嗜熱菌蛋白酶(43.1)>胰凝乳蛋白酶(30.7)>胰蛋白酶(22.0)。進一步統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn),5種優(yōu)勢蛋白酶建立的目標肽庫中,pIpH 6.0的目標多肽數(shù)量。這可能是因為7S酶解后肽鍵斷裂,所生成的小肽表面電荷分布發(fā)生變化,而7S中酸性氨基酸含量高于堿性氨基酸含量[12],因此模擬酶切后生成肽段中也含有較多的酸性氨基酸,從而使其等電點偏酸性。此外,蛋白酶的酶切位點對7S酶解產物的等電點也有重要影響。如胰蛋白酶主要識別酶切P1位是賴氨酸和精氨酸(二者均為堿性氨基酸)的肽鍵。由于末端氨基酸對肽段等電點影響較大[5],因此胰蛋白酶生成的肽庫中含有較多的pI>pH 6.0的目標多肽。

表2 不同蛋白酶對7S球蛋白模擬酶切所得目標多肽數(shù)量Table 2 The quantities of target peptides produced by in silico enzymatic analysis of 7S globulin using various proteases

2.3 不同蛋白酶對大豆7S球蛋白的酶解特性

將上述5種優(yōu)勢蛋白酶分別在各自最優(yōu)酶解條件下(表3)對7S進行酶解,酶解產物DH隨酶解時間的變化如圖2所示。在酶解反應0～180 min內,5種7S酶解產物的DH不斷增加,然后隨著酶解時間推移趨于平緩,并在反應300 min后DH不再出現(xiàn)顯著變化(P>0.05)。蛋白酶K、胃蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶制備的7S酶解產物的實際DH分別達到了27.3%、24.8%、19.6%、13.8%和10.5%。SDS-PAGE分析結果(圖1)發(fā)現(xiàn),上述5種優(yōu)勢酶可將7S中α′、α和β亞基完全降解,7S酶解產物主要由分子質量<3 000 Da的小分子肽組成。這一發(fā)現(xiàn)與模擬酶切預測結果基本一致,表明5種優(yōu)勢蛋白酶對7S的酶解程度都較高。另一方面,實驗測定的7S酶解產物的DH普遍低于模擬酶切預測的DH,這可能是由于7S球蛋白空間結構的影響,使部分酶切位點被掩蔽,難以與蛋白酶結合發(fā)生水解作用[6,15]。酶解過程中的產物抑制效應也會影響蛋白酶解反應效率,從而導致7S酶解產物實際水解程度較低[5,17]。

表3 不同蛋白酶對7S模擬酶切所得DH與實驗測定DH對比Table 3 Comparison of in silico predicted DH and experimental determined DH of 7S hydrolysates prepared using various proteases

2.4 不同蛋白酶制備的7S酶解產物的蛋白溶解性

如圖3所示,對照7S的PS-pH關系類似一條U型曲線:在pH 7.0時其PS值最高為79.6%;pH 4.5～5.0是7S的等電點區(qū)域,PS值最低,僅為6.1～6.8%;在pH 3.0～4.5(大部分酸性飲料的pH值),7S的PS值從6.8%(pH 4.5)上升至55.2%(pH 3.0)。酶解改性后,5種7S酶解產物在pH 7.0的PS值都提高到90%左右。與對照7S球蛋白相比,7S酶解產物主要由小分子肽組成,含有的極性基團數(shù)量較多,親水性更強,且肽鏈長度縮短,分子柔順性更好,因此更易于與水分子發(fā)生水合作用而具有更好的溶解特性[5-6]。隨著pH降低,所有7S酶解產物的PS值在酸性條件下也有所下降,但降低的程度明顯小于對照7S。據文獻報道,與大分子蛋白不同,小分子肽水合作用較強,即使在其等電點區(qū)域靜電排斥作用較弱時,也不易發(fā)生聚集沉淀,因此具有較好的酸溶特性[18]。除胰蛋白酶制備的7S酶解產物的最小PS值(39.4%)仍出現(xiàn)在7S的等電點區(qū)域(pH 4.5～5.0),其他4種7S酶解產物的最小PS值都出現(xiàn)在更低的pH條件。其中7SH-嗜熱菌蛋白酶和7SH-胰凝乳蛋白酶的最小PS值都在pH 4.0,分別為46.2%和33.7%;7SH-胃蛋白酶的最小PS值在pH 3.0,為65.9%;7SH-蛋白酶K的PS值在pH 3.0～5.0時沒有顯著差異,約為81%,為所有7S酶解產物中最高。上述結果表明模擬酶切篩選出的5種優(yōu)勢蛋白酶都可不同程度提高7S在pH 3.0～4.5下的酸溶特性,其中蛋白酶K表現(xiàn)最佳。酶解改性7S酸溶特性的提高有利于改善其在酸性飲料中穩(wěn)定性,從而開發(fā)出營養(yǎng)和口感俱佳的酸性蛋白飲料。

圖3 對照7S球蛋白及其酶解產物的溶解度-pH 曲線(pH 3.0～7.0)Fig.3 Protein solubility profiles of control 7S and its hydrolysates as a function of pH 3.0-7.0

將模擬酶切分析預測結果與實驗測定結果相對照可以發(fā)現(xiàn),蛋白酶K、胃蛋白酶和嗜熱菌蛋白酶不僅在模擬酶切中得到較多的目標肽段,而且它們所制備的7S酶解產物的實際酸溶特性也較高。另一方面,胰凝乳蛋白酶在模擬酶切分析中得到的目標多肽數(shù)量比胰蛋白酶多,但是7SH-胰凝乳蛋白酶的酸溶特性低于7SH-胰蛋白酶。這可能是因為這兩種蛋白酶模擬酶切所得目標肽段數(shù)量相差不大,而7S的酶解過程比較復雜,導致預測結果不夠準確。綜上所述,雖然由于7S酶解過程的復雜性,基于PeptideCutter模擬酶切的預測結果與實際情況有所差別,但對于預測酶解產物酸溶特性、篩選優(yōu)勢水解用酶仍然具有很好的指導作用。

2.5 不同蛋白酶制備的7S酶解產物的Zeta電位

蛋白溶解特性與其表面電荷量密切相關。7S及其酶解產物的Zeta電位-pH關系如圖4所示。對照7S的Zeta電位從30.7 mV(pH 2.0)降低至-36.2 mV(pH 7.0),在pH 4.75處Zeta電位為零,為對照7S的等電點。將圖3與圖4對照分析可以發(fā)現(xiàn)在7S等電點區(qū)域,由于蛋白分子表面凈電荷最少、Zeta電位最小,無法提供足夠的靜電排斥效應,蛋白分子間會通過疏水相互作用等次級相互作用力形成聚集物,導致其PS很低僅為6.1%;而pH值偏離等電點區(qū)域,蛋白分子表面電荷增多、Zeta電位增大,蛋白分子間的靜電排斥作用抑制蛋白-蛋白聚集,宏觀上表現(xiàn)為蛋白質的溶解度增加[19]。酶解改性對7S的Zeta電位-pH關系有重要影響,且依賴于蛋白酶的種類。5種7S酶解產物的Zeta電位-pH曲線的斜率與對照7S相比明顯增大,即隨著pH的變化,Zeta電位(絕對值)變化幅度增大。這可能是因為7S酶解成小分子肽后,帶電基團(如—NH2+、—COO-)數(shù)量增加,使7S酶解產物表面電荷量和Zeta電位增大[18]。5種酶解產物的等電點都向酸性方向發(fā)生了偏移,這與Compute pI/Mw軟件的預測結果基本一致。然而值得注意的是,除7SH-蛋白酶K外,其余4種7S酶解產物的等電點基本位于pH 3.0～4.5,而且其PS在等電點區(qū)域仍明顯降低,因此不適于在酸性飲料中應用。與之相對照,7SH-蛋白酶K等電點位于pH 2.61,使其在pH 3.0～4.5帶負電荷且具有較高的Zeta電位(絕對值),可提供較強的靜電排斥效應,從而保持良好的溶解性。

圖4 對照7S球蛋白及其酶解產物的Zeta電位-pH關系圖Fig.4 Zeta potential profiles of control 7S and its hydrolysates as a function of pH 1.0-7.0

2.6 酶解改性7S球蛋白對果汁飲料穩(wěn)定性的影響

Turbiscan通過測定飲料樣品BS系數(shù)的分布和變化,可檢測肉眼難以觀察到的相分離、絮凝、沉淀等現(xiàn)象,從而評估飲料的穩(wěn)定性[20]。圖5-a為靜置貯藏24 h后不同蛋白果汁樣品的BS圖譜,0 mm處為樣品瓶底部,50 mm處為樣品瓶頂部;圖5-b為不同蛋白果汁樣品的實物圖。本實驗所采用的酸橙汁(pH 3.86)在外觀上呈均勻液狀,其BS系數(shù)在測定高度內沒有明顯波動,說明該果汁中物質分布均勻。將對照7S添加到酸橙汁后,樣品出現(xiàn)了肉眼可見的相分離現(xiàn)象。該樣品的BS曲線底部有1個凸起峰,意味該區(qū)域反射光增強,溶液中出現(xiàn)沉淀;中間曲線波動較多,表明溶液中有結塊或絮凝現(xiàn)象;頂部曲線有1個較大凸起峰,表明絮凝物漂浮在樣品頂部[20-21]。由此可見,將7S直接添加到酸橙汁中會引起絮凝沉淀,嚴重影響飲料的外觀和穩(wěn)定性。與之相對照,將7SH-蛋白酶K添加到酸橙汁后,樣品在外觀上沒有出現(xiàn)明顯的相分離,其BS曲線底部和中部的波動較小,表明由蛋白引起的絮凝沉淀現(xiàn)象明顯減弱;但在BS曲線上部出現(xiàn)1個凸起峰。推測其原因,可能是由于酸橙汁中果肉、果膠等物質通常帶有負電荷[2],與7SH-蛋白酶K中少量帶正電荷的酶解多肽結合,導致形成了絮狀漂浮物。然而7SH-蛋白酶K的pI(pH 2.61)與7S相比向酸性方向偏移,其所含的大部分酶解多肽在酸橙汁中(pH 3.86)都帶負電荷且具有較高Zeta電位(絕對值),從而使體系中多肽與多肽之間、多肽與果肉(果膠)之間都因靜電排斥作用而不易發(fā)生聚集。上述結果表明7S經蛋白酶K酶解改性后酸溶特性提高,在酸橙汁中不易引起絮凝沉淀,使蛋白果汁體系的穩(wěn)定性明顯改善。蛋白酶K的酶切位點廣泛、水解作用較強且穩(wěn)定性高,在食品工業(yè)中常被用于降解蛋白生產小分子肽[22]。因此該酶制備的7S酶解產物在酸性飲料中有應用前景。

注:a-BS圖譜;b-實物圖圖5 添加了不同蛋白樣品酸橙汁的Turbiscan BS圖譜和實物圖Fig.5 BS spectra and visual appearance of orange juices added with different protein samples

3 結論與討論

利用生物信息學和計算機科學的進步,本文以完整氨基酸序列已知的大豆7S球蛋白為底物蛋白,選用39種酶切位點已知的蛋白酶在PeptideCutter軟件中對7S進行模擬酶切,以生成的目標肽段(pI>pH 6.0或pI

a)實驗驗證表明,模擬酶切篩選出的5種優(yōu)勢蛋白酶(蛋白酶K、胃蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶)對7S的酶解程度都較高,都可不同程度提高7S在pH 3.0～4.5下的PS,其中蛋白酶K表現(xiàn)最佳,這說明基于模擬酶切分析預測7S酶解產物的酸溶特性對于篩選優(yōu)勢水解用酶具有很好的指導作用;但由于7S酶解過程的復雜性,模擬酶切預測的DH偏高,且當不同蛋白酶模擬酶切所得目標肽段數(shù)量相差不大時,預測結果不夠準確。

b)蛋白酶K可將7S中α′、α和β亞基完全降解成小分子肽(分子質量<3 000 Da),所得7S酶解產物帶電基團數(shù)量增多、水合作用增強,且等電點與對照7S(pI=pH 4.75)相比向酸性方向偏移(pI=pH 2.61),使其在pH 3.0～4.5具有較高的Zeta電位(絕對值),可提供較強的靜電排斥效應,可能是其酸溶特性提高的主要原因。

c)7S經蛋白酶K酶解改性后酸溶特性顯著提高,在酸橙汁中不易引起絮凝沉淀,使蛋白果汁體系的穩(wěn)定性明顯改善。

綜上所述,基于計算機模擬酶切指導7S球蛋白酶解改性,不僅大大提高了水解用酶的篩選效率,而且成功制備了具有優(yōu)異酸溶特性的7S酶解產物,在酸性飲料中有應用前景。