基于雙重DARQ-LAMP方法同時檢測單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌

陳清瑩,劉丹,張杏果,韋錦源,鐘青萍

(廣東省食品質量安全重點實驗室,華南農業大學 食品學院,廣東 廣州,510642)

食品安全問題是世界范圍內的重大公共衛生問題,其中食源性致病菌導致的食物中毒事件在世界各地頻繁發生,嚴重影響人類健康和生命安全。單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes,LM)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,SP)是常見的食源性致病菌。傳統平板培養的檢測技術雖然結果可靠,但操作過程繁瑣,通常需要4～7 d,結果具有滯后性,不能滿足當前快速檢測的需求[1-2]。常規PCR檢測方法需變溫擴增,而且根據電泳分析PCR產物,不能定量分析,不適合高通量分析且難以實現自動化,不能滿足現場檢測的要求[3]。實時熒光PCR方法通過熒光信號對PCR反應進行實時監測,可定量檢測,但對實驗操作及環境要求較高[4]。

環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是由Notomi等提出的一種核酸體外擴增技術[5],可在65 ℃恒溫下,利用4條或6條引物和具有鏈置換特異性的BstDNA聚合酶在30～60 min將目標基因擴增109～1010倍[6],該方法特異性好、靈敏度高,已在不同檢測領域得到廣泛應用[7-9]。但多重LAMP檢測時要求反應中不能出現引物自聯和錯配的情況,這就需要精準地設計多個復合引物,使得引物設計較普通PCR技術更加困難[10]。現階段,應用于LAMP的實時檢測主要分為實時濁度法和實時熒光法,實時熒光法主要包括熒光染料法和熒光探針法[11-12]。實時濁度法由于粒徑大小不一、空間分布不均勻和焦磷酸鎂再溶解等現象,靈敏度相對較低[13]。熒光染料法中引物二聚體或者非特異擴增產物易與熒光染料結合而顯色,造成假陽性[12]。因此,上述2種方法均難以應用于多基因的同時檢測[14],而基于檢測淬滅基團釋放(detection of amplification by release of quenching,DARQ)的環介導等溫擴增技術(DARQ-LAMP)可以通過不同的熒光和淬滅基團組合實現多目的基因的檢測,具有良好的發展前景和應用潛力[15]。

編碼李斯特菌溶血素O(listeriolysin O,LLO)毒素的hly基因是單增李斯特菌致病基因組中特有的毒力基因,在單增李斯特菌檢測中具有較好的特異性[16]。金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶基因nuc在其臨床分離株中具有高度保守性,是金黃色葡萄球菌核酸鑒定中常用的特異性靶點[17]。為此,本研究針對單增李斯特菌與金黃色葡萄球菌的這2種特異性基因設計引物,建立一種雙重DARQ-LAMP方法同時檢測單增李斯特菌與金黃色葡萄球菌,能夠實現在一次LAMP反應中同時快速、準確地檢測兩種食源性致病菌,為多重LAMP檢測食源性致病菌提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

目標菌株:單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)ATCC 19115、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CGMCC 1.89,以及非目標菌株:英諾克李斯特菌(L.innocua)ATCC 33090、斯氏李斯特氏菌(L.seeligeri)ATCC 35967、伊氏利斯特菌(L.ivanovii)ATCC 19119、大腸桿菌(Escherichiacoli)ATCC 25922、屎腸球菌(Enterococcusfaecium)ATCC 29212、福氏志賀氏菌(Shigellaflexneri)ATCC 12022、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)ATCC 17802、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)CGMCC 26069、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC 9027、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)CGMCC 1.1869、馬紅球菌(Rhodococcusequi)ATCC 6939、產氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)ATCC 13048,均于實驗室保藏。

Ezup柱式細菌基因組DNA快速抽提試劑盒(B518255)、溶菌酶、BstDNA聚合酶、Taq PCR Master Mix、BstLF DNA Polymerase、10×ThermoPol緩沖液、MgCl2溶液、dNTP Mixture、滅菌雙蒸水,上海生工(生物工程)股份有限公司;Eve Green(20×水溶液),翌圣生物科技(上海)有限公司;OXOID;Baird-Parker瓊脂基礎、PALCAM瓊脂粉、腦心浸出液肉湯(brain heart infusion broth,BHI),廣東環凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Forma Class Ⅱ生物安全柜,美國Thermo公司;CFX 96TM熒光定量PCR儀,伯樂生命醫學產品(上海)有限公司;SP-02生化培養箱,廣州市綠向生物科技有限公司;TP600梯度PCR儀,日本TaKaRa儀器有限公司;NanoDrop 2000c超微量分光光度計,賽默飛世爾科技(中國)有限公司;5417R高速冷凍離心機,德國Eppendorf股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株的培養

保藏于-80 ℃的單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌分別在BHI培養基、TSB培養基中37 ℃,150 r/min活化16 h備用。

1.3.2 DNA模板的制備

采用細菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取模板DNA,具體步驟按照試劑盒說明書進行,可立即進行下一步實驗或于-20 ℃保存。

1.3.3 LAMP引物和探針的設計與合成

從GenBank數據庫獲得金黃色葡萄球菌(GenBank:DQ507380.1)、單增李斯特菌(GenBank:HM589597.1)的基因序列,基于序列信息和相關前期研究[16-19],使用LAMP引物設計工具Primer Explorer V5(https://primerexplorer.jp/e/)進行引物設計。由上海生工生物有限公司合成引物和探針,引物序列見表1。利用不同探針的標記物的不同,可形成不同的擴增曲線,具體熒光基團和淬滅基團的參數見表2。

表1 LAMP引物和探針序列Table 1 Primer and probe sequences of the LAMP

表2 熒光基團和淬滅基團的參數Table 2 The parameters of fluorescence groups and quenched groups

1.3.4 雙重DARQ-LAMP方法的建立

根據本實驗室的前期研究,優化前的雙重DARQ-LAMP反應體系(20 μL)為hlyA-F3與hlyA-B3各0.1 μmol/L,hlyA-BIP與hlyA-QPD按照一定比例加入,終濃度總和為0.4 μmol/L,hlyA-FIP為0.4 μmol/L,nuc-F3與nuc-B3各0.1 μmol/L,nuc-BIP與nuc-QPD按照滴定比例加入(設置為體系的10%),終濃度總和為0.4 μmol/L,nuc-FIP為0.4 μmol/L,Bst3.0 DNA聚合酶0.32 U/μL,10×Reation Buffer 2 μL,dNTPs 1.4 mmol/L,Mg2+8 mmol/L,金黃色葡萄球菌和單增李斯特的等體積混合DNA模板各1.6 μL,補充無菌蒸餾水至20 μL。反應條件設置為65 ℃ 1 min,共60個循環,每個循環結束時采集熒光信號;反應結束后80 ℃滅酶2 min。

分別對DAQR-LAMP反應的引物濃度比、反應溫度、dNTPs濃度以及Mg2+濃度進行優化,其他條件保持不變,進行實時DARQ-LAMP反應,通過Ct值及擴增產物熒光值確定適宜的反應條件。每個反應設置3個復孔。具體優化參數設置見表3。

表3 雙重DARQ-LAMP方法條件優化Table 3 Optimization of the reaction conditions of dual DARQ-LAMP method

1.3.5 雙重DARQ-LAMP特異性和靈敏度評價

以金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌標準菌株,以及12株非目標菌株進行雙重DARQ-LAMP反應,對該方法的特異性進行驗證。熒光擴增曲線為“S”型或類“S”型則判定為陽性,為平的直線則判定為陰性。由于引物、探針標記的熒光物質不同,可同時呈現不同標記物的不同顏色的擴增曲線。

將10倍梯度稀釋后的金黃色葡萄球菌DNA模板和單增李斯特菌DNA模板分別等體積混合,形成梯度稀釋的混合DNA模板,以ddH2O作為空白對照,進行雙重DARQ-LAMP以確定方法的靈敏度。

上述每個反應設置3個復孔,并重復2次實驗。

1.3.6 雙重DARQ-LAMP方法在樣品檢測中的應用

1.3.6.1 背景細菌對雙重DARQ-LAMP的影響

將常見的污染菌大腸桿菌作為背景細菌,按照1.3.1節的方法制備金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌以及大腸桿菌菌懸液。稱取10 g未經目標菌株污染的樣品,將高濃度非靶標細菌大腸桿菌加入有金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌2種目標菌株的混合菌液的樣品中。按照1.3.2節的方法進行DNA模板的制備。判定背景細菌對所建立的雙重實時熒光LAMP的影響。

1.3.6.2 雙重DARQ-LAMP方法在人工模擬樣品檢測中的靈敏度

取9 mL經GB 4789.10—2016和GB 4789.30—2016檢測的無金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌污染的新鮮牛奶,分別加入1 mL 10倍梯度稀釋的2種目標菌株的菌懸液制備成不同濃度的人工污染樣品,將人工污染樣品加入至90 mL生理鹽水后均質,混勻吸取1 mL勻液,按照1.3.2節的方法進行DNA模板的制備,按照1.3.5節靈敏度實驗的反應體系及條件進行檢測。

1.3.7 數據處理與統計分析

實驗平行進行3次及以上,熒光定量PCR儀中導出LAMP反應擴增曲線,利用Origins 2021(Electronic Arts Inc公司)進行圖像處理分析。

2 結果與分析

2.1 雙重DARQ-LAMP方法的建立

2.1.1 引物濃度的優化

對于多重反應,靶標數的增加將使每一靶標相應的引物的濃度顯著下降,使得擴增速度、信號強度以及檢測動態范圍也隨之下降,因此對多重引物濃度的比例進行優化是有必要的。

當nuc和hlyA引物濃度比為1∶1時,金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌擴增的Ct值分別為32、30 min,熒光閾值均為1 700左右(圖1-A),說明此濃度比例下,有良好的擴增效率和熒光閾值,且未出現明顯差異的擴增效率。將nuc和hlyA引物濃度比調整為1∶2時,單增李斯特菌Ct值減小至26 min,金黃色葡萄球菌Ct值增大至35 min(圖1-B),可能是hlyA引物濃度相對增加,使得底物模板更易與之反應。

A-nuc和hlyA引物濃度比1∶1;B-nuc和hlyA引物濃度比1∶2;C-nuc和hlyA引物濃度比1∶3;D-nuc和hlyA引物濃度比2∶1; E-nuc和hlyA引物濃度比2∶3圖1 雙重DARQ-LAMP方法反應引物濃度比的優化Fig.1 Optimization of concentration ratio of primers for dual DARQ-LAMP method注:FAM為單增李斯特菌hlyA基因的反應通道;Cy5為金黃色葡萄球菌nuc基因的反應通道;NTC為空白對照(下同)。

當nuc和hlyA引物濃度比為1∶3和2∶1時,靶基因的DARQ-LAMP反應的擴增效率出現明顯差異。引物濃度比為1∶3時,對單增李斯特菌的擴增并未產生顯著影響,但金黃色葡萄球菌擴增的Ct值為41 min,熒光值僅1 000左右(圖1-C),說明此時靶基因nuc擴增效率明顯降低。相似地,當nuc和hlyA引物濃度比為2∶1時,則金黃色葡萄球菌的擴增未發生顯著變化,而單增李斯特菌擴增的Ct值為38 min,且熒光值為1 500左右(圖1-D),說明在此引物濃度比下,靶基因hlyA擴增效率明顯降低。

若nuc和hlyA引物濃度比為2∶3,金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌Ct值分別為37、30 min(圖1-E),擴增效率與熒光閾值和引物濃度比為1∶1時類似,說明當nuc和hlyA引物濃度相當時,兩者的擴增效率最佳,故確定nuc和hlyA適宜的引物濃度比為1∶1。進一步證實了在多重反應體系中,如引物間濃度配比不合適,可能會導致體系中某一基因擴增量高,而另一基因擴增量低甚至不擴增,即“優勢擴增”現象[20]。因此,多重反應體系中合適的引物濃度配比十分重要。

2.1.2 反應溫度的優化

由圖2可知,在雙重的DARQ-LAMP反應中,反應溫度為67 ℃時單增李斯特菌無擴增反應,金黃色葡萄球菌的熒光值和擴增效率較低。在65 ℃時金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌Ct值為29 min和27 min,熒光值較高。反應溫度為63 ℃時,單增李斯特菌Ct值為23 min,金黃色葡萄球菌Ct值增大至35 min,熒光值較高。在61 ℃時金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌Ct值均為37 min,擴增效率和熒光值均明顯降低。綜合考慮檢出時間、熒光強度等因素,確定65 ℃為該反應適宜的反應溫度。這說明該雙重DARQ-LAMP體系對反應溫度的變化較為敏感,不適的溫度條件將導致體系中基因擴增量降低,甚至出現不擴增的現象。

圖2 雙重DARQ-LAMP方法反應溫度的優化Fig.2 Optimization of temperature for dual DARQ-LAMP method

2.1.3 Mg2+和dNTPs濃度的優化

如圖3-A所示,當Mg2+濃度為2 mmol/L時反應無法正常進行,可能是因為Mg2+濃度過低,無法催化BstDNA聚合酶啟動擴增反應,使體系無明顯擴增;濃度升高到4 mmol/L后,金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌Ct值為42 min和53 min;當濃度升高到6 mmol/L 時,金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌Ct值分別為35 min和29 min,此時擴增效率最高;隨著Mg2+濃度增加到8 mmol/L,擴增效率開始降低。考慮雙重DARQ-LAMP方法快速、高效的特點,確定反應的最適Mg2+濃度為6 mmol/L。說明Mg2+是該反應必需的,只有當Mg2+濃度高于4 mmol/L后反應才能正常進行,過高濃度的Mg2+又會對反應起抑制作用,這可能與Mg2+可影響BstDNA聚合酶的活性從而影響催化反應有關[21]。由圖3-B可知,在雙重DARQ-LAMP體系中,dNTPs濃度對反應的擴增效率無較大影響,主要影響熒光值的大小。當dNTPs濃度為1.8 mmol/L時,兩菌熒光值達到最大,而Ct值最小,故確定1.8 mmol/L為雙重DARQ-LAMP反應的最優dNTPs濃度。

A-Mg2+;B-dNTPs圖3 雙重DARQ-LAMP方法Mg2+以及dNTPs濃度的優化Fig.3 Optimization of Mg2+ and dNTPs concentrations for dual DARQ-LAMP method

2.2 雙重DARQ-LAMP特異性和靈敏度評價

以建立的雙重DARQ-LAMP方法對2株目標菌株和12株非目標菌株進行檢測,發現僅2株目標菌株被檢出,而其他12株非目標菌株均無擴增(圖4-A),這表明所建立的雙重DARQ-LAMP方法具有較好的特異性。由圖4-B可知,在雙重DARQ-LAMP反應中,有5個濃度的DNA混合模板出現較好擴增,故該方法對單增李斯特菌的檢測限為7.3×102copies/mL,對金黃色葡萄球菌的檢測限為2.3×102copies/mL。

A-特異性;B-靈敏度圖4 雙重DARQ-LAMP方法的特異性及靈敏度Fig.4 The specificity and sensitivity of dual DARQ-LAMP method注:Neg為陰性對照;100～10-7代表10倍梯度稀釋的金黃色葡萄球 菌和單增李斯特菌的混合DNA模板,其對應的模板濃度由大到小 分別為金黃色葡萄球菌2.3×107～2.3×100 copies/mL,單增李斯 特菌7.3×107～7.3×100 copies/mL。

2.3 雙重DARQ-LAMP方法在樣品檢測中的應用

2.3.1 背景細菌對雙重DARQ-LAMP的影響

由圖5可知,即使在背景細菌存在下,雙重DARQ-LAMP反應的檢出時間和熒光值都未受影響,背景細菌對于檢測金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的影響可以忽略不計。因此,即使在有背景細菌共存的食物基質中,我們建立的雙重DARQ-LAMP方法也可得到較好的應用。

圖5 背景細菌對雙重DARQ-LAMP方法的影響Fig.5 Effect of background bacteria on dual DARQ-LAMP method

2.3.2 雙重DARQ-LAMP方法檢測人工模擬樣品

對10倍梯度稀釋的單增李斯特菌(2.8×101～2.8×107CFU/mL)和金黃色葡萄球菌(2.4×101～2.4×107CFU/mL)進行DNA模板提取,進行雙重DARQ-LAMP反應。如圖6所示,2種細菌均有4個濃度可擴增,其中金黃色葡萄球菌檢測限為2.4×104CFU/mL,單增李斯特菌為2.8×104CFU/mL。

圖6 雙重DARQ-LAMP方法對人工模擬樣品檢測的靈敏度Fig.6 The sensitivity of dual DARQ-LAMP method for the detection of the spiked samples

3 討論與結論

近年來,環介導等溫擴增技術因其具靈敏度高、特異性強、快速檢測、成本低且不依賴精密儀器的特點,已經成為檢測困難樣品的有效分析方法,廣泛應用于致病菌的快速檢測。研究表明單重LAMP技術檢測單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的靈敏度比PCR方法高10倍[22-24]。為了進一步提高檢測效率,多重LAMP技術成為近年來的研究熱點。針對沙門氏菌invA基因、金黃色葡萄球菌nuc基因設計引物,建立雙重LAMP方法,靈敏度均達到102fg/μL,有效區分了不同菌株[25]。劉丹等[19]基于實時熒光LAMP建立雙重檢測體系,該方法對副溶血弧菌及金黃色葡萄球菌的檢測限可達到3.62×102copies/mL和1.45×104copies/mL。但多重LAMP反應中仍存在較嚴重的多套引物間相互干擾問題,難以保持較好的特異性和靈敏度。

針對熒光染料存在假陽性和特異性較低的問題,研究者嘗試利用熒光探針代替熒光染料承擔發射信號的功能,將環引物探針設計成發夾結構,當目標探針與環引物未結合到目的片段時,熒光基團和淬滅基團相互靠近,熒光基團被淬滅而不發熒光,若與目的片段結合,在內切酶作用下發夾結構被打開,熒光基團與淬滅基團分離,熒光基團被激活而發出熒光信號,提升了檢測的特異性和靈敏度[26]。若在一條內引物的5′端修飾熒光基團(或淬滅基團),并加入一條能與F1c(或B1c)部分互補且3′端修飾淬滅基團(或熒光基團)的探針,將實現多種靶基因同時檢測[27]。TANNER等[16]建立的多重DARQ-LAMP反應體系,對噬菌體λ基因組DNA和HeLa基因組DNA、大腸桿菌基因組DNA以及秀麗隱桿線蟲基因組DNA檢測時,發現該方法可穩定檢測拷貝數差異高達107倍的2種靶基因,檢測限達到10 copies/mL,并同時檢測3～4種擴增效率不同的靶標。綜上說明了DARQ-LAMP方法在食品檢測中的廣泛適用性。

本研究建立了能同時檢測單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的雙重DARQ-LAMP方法,并對反應條件進行了優化,確定單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌引物濃度比為1∶1,適宜的反應溫度為65 ℃,dNTPs和Mg2+濃度為1.8 mmol/L和6 mmol/L。通過添加熒光基團和淬滅基團,利用不同熒光通道檢測所攜帶的熒光基團,實現了在一個反應管中同時檢測單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌,提高了方法的特異性、靈敏度和檢測效率,對單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的檢測限分別為7.3×102copies/mL和2.3×102copies/mL。然而,多重PCR檢測方法對單增李斯特菌和大腸桿菌等細菌的檢測限為105～106CFU/mL,明顯高于本研究建立的雙重DARQ-LAMP方法[28]。此外,本研究測定了該方法在實際樣品中的可行性,發現背景細菌對檢測無影響,在模擬樣品檢測中對單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的檢測限分別為2.8×104CFU/mL和2.4×104CFU/mL。同類LAMP檢測方法中,一種基于芯片技術與LAMP技術聯用,可同時檢測單增李斯特菌、大腸桿菌和沙門氏菌,檢測限均為105CFU/mL[29]。免疫磁珠分離技術與LAMP技術聯用檢測牛肉中的金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門氏菌,靈敏度分別為4.4×104CFU/mL和1.2×103CFU/mL[30]。上述2種方法的檢測限與本研究的結果基本一致。在實際應用中,結合芯片技術和免疫磁珠分離可能會使檢測成本增加,但本研究建立的雙重DARQ-LAMP方法簡便,并在60 min內即可完成檢測,達到了快捷簡易的目的。

雙重DARQ-LAMP方法操作簡單方便,無需昂貴的設備,有良好的特異性和靈敏度,可實現對2種細菌的同時檢測,是一種快速、準確的實時分子檢測技術。該方法仍存在由多套引物產生的引物相互干擾、形成氣溶膠污染等問題,未來我們可以將這種反應體系與微流控技術、芯片實驗室等微型實驗室技術結合,實現檢測技術微型化、自動化,使本研究所建立的反應體系具有更強的應用潛力和發展前景。