血清補體C3對原發性膽汁性膽管炎相關肝纖維化分期的診斷價值

周 輝， 牛 斌， 宓余強， 劉勇鋼， 李 萍

1 天津醫科大學第二人民醫院臨床學院， 天津 300070； 2 天津市第二人民醫院 a.肝病科， b.病理科，天津 300192

原發性膽汁性膽管炎（PBC，舊稱原發性膽汁性肝硬化）是一種慢性自身免疫性肝內膽汁淤積性疾病。盡管PBC 比較少見，但它對患者的生活質量和生存率有重大影響，且PBC 的全球患病率正呈現上升趨勢［1］。由于長期膽汁淤積，PBC 可出現進行性肝纖維化、肝硬化，最終可演變為終末期肝病。免疫學相關指標通常用于PBC 的評估，本文主要分析了血清補體C3在PBC患者中的變化及其與肝纖維化分期的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2012年1月—2022年10月于天津市第二人民醫院就診并行肝穿刺活檢的PBC 患者108 例。納入標準：（1）符合PBC 診斷和治療共識［2-3］的診斷標準；（2）進行肝穿刺活檢；（3）在肝活檢1周內行血清學檢測；（4）臨床資料完整。排除標準：（1）合并其他慢性肝病，如病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、重疊綜合征、原發性硬化性膽管炎、IgG4相關膽管炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝、藥物性肝損傷等；（2）肝移植者；（3）有惡性腫瘤史或其他終末期疾病者；（4）孕產婦；（5）患有影響血補體C3水平的相關疾病，如系統性紅斑狼瘡、銀屑病、過敏性哮喘、非典型溶血性尿毒綜合征、遺傳性補體缺陷病等。

1.2 研究方法

1.2.1 觀察指標 采用回顧性分析的方法，收集患者的一般人口學資料（年齡、性別、BMI 等）、臨床表現（乏力、納差、瘙癢等）、自身抗體指標（ANA、AMA、M2、Sp100、Gp210）、肝穿刺活檢1 周內的血清學指標（PLT、ALT、AST、GGT、ALP、CHE、Alb、TBil、DBil、

IBil）、免疫功能指標（C3、C4、IgG、IgA、IgM）、肝纖維化指標（LSM）及無創肝纖維化評分［（AST/ALT比值指數（AAR）、AST/PLT 比值指數（APRI）和肝纖維化4 因子指數（FIB-4）］。

1.2.2 組織學評估 所有患者均在局部麻醉狀態下，經超聲引導進行肝組織穿刺，標本長度為1.0～2.0 cm。用10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋、切片，進行HE 染色、Masson 三色染色和網狀纖維染色等。肝組織切片由兩名對患者臨床特征毫不知情且經驗豐富的病理學家獨立評估，采用Scheuer 評分系統［4］評估肝纖維化程度，其中≥S2 定義為顯著肝纖維化；≥S3定義為進展期肝纖維化；S4定義為肝硬化。

1.3 統計學方法 采用SPSS 26.0 軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料用xˉ±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Bonferroni法。不符合正態分布的計量資料用M（P25～P75）表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗；多組間比較采用Kruskal-WallisH秩和檢驗，進一步兩兩比較采用Bonferroni法。計數資料組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗。繪制受試者工作特征曲線（ROC 曲線）評估補體C3 對PBC 患者肝纖維化的診斷效能，ROC 曲線下面積（AUC）的比較采用Delong 法。采用Spearman 相關分析評估補體C3 與肝纖維化分期的相關性。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料 本研究共納入PBC患者108例，平均（53.6±10.4）歲。患者以女性居多87 例（80.6%），自身抗體陽性102 例（94.4%）。肝纖維化分期S0 期5 例（4.6%），S1 期41 例（38.0%），S2 期23 例（21.3%），S3期25例（23.1%）、S4期14例（13.0%）。患者的其他資料見表1。不同肝纖維化分期患者PLT、CHE、Alb、TBil、C3、IgA、LSM、AAR、APRI、FIB-4 比較，差異均具有統計學意義（P值均＜0.05）；進一步兩兩比較的結果顯示，C3、LSM 在S3 與S0/1 之間差異均具有統計學意義（P值均＜0.05），LSM 在S3 與S2 之間差異具有統計學 意 義（P＜0.05），PLT、CHE、Alb、C3、LSM、AAR、APRI、FIB-4 在S4 與S0/1 之間差異均具有統計學意義（P值均＜0.05），CHE、Alb、C3、IgA、LSM、AAR、FIB-4在S4 與S2 之間差異均具有統計學意義（P值均＜0.05），CHE、Alb、C3、AAR、FIB-4 在S4 與S3 之間差異均具有統計學意義（P值均＜0.05）（表2）。

表2 PBC患者肝纖維化分期的一般特征Table 2 General characteristics of hepatic fibrosis stage in patients with PBC

2.2 免疫功能對PBC 不同肝纖維化分期的診斷效能 免疫功能指標中C3、C4、IgG、IgA 及IgM 診斷顯著肝纖維化的AUC 分別為0.731、0.529、0.583、0.520、0.562；免疫功能指標中C3、C4、IgG、IgA 及IgM 診斷進展期肝纖維化的AUC 分別為0.832、0.591、0.609、0.602、0.503；免疫功能指標中C3、C4、IgG、IgA 及IgM診斷肝硬化的AUC分別為0.968、0.687、0.604、0.739、0.638。綜上所述，補體C3 對PBC 不同肝纖維化分期的診斷效能最佳（圖1）。

圖1 免疫功能指標與不同肝纖維化分期的ROC曲線Figure 1 ROC curves of immune function indexes and different stages of liver fibrosis

2.3 ROC曲線診斷補體C3的性能分析 ROC曲線顯示顯著肝纖維化分期（≥S2）中C3 的最佳截斷值為1.445 g/L，診斷顯著肝纖維化的敏感度為87.1%，特異度為52.2%（AUC=0.731，95%CI：0.637～0.812）（圖1a）。因此，根據C3這一截斷值水平來比較PBC患者的一般特征。高補體C3組（C3＞1.445 g/L）PLT、GGT、ALP、Alb、TBil、C4明顯高于低補體C3組（C3≤1.445 g/L）（P值均＜0.05），高補體C3 組LSM、AAR、FIB-4 和纖維化分期明顯低于低補體C3 組（P值均＜0.05）。兩組間其他參數均無顯著差異（P值均＞0.05）。

ROC曲線顯示進展期肝纖維化分期（≥S3）中C3的最佳截斷值為1.235 g/L，診斷進展期肝纖維化的敏感度為82.1%，特異度為71.0%（AUC=0.832，95%CI：0.748～0.897）（圖1b）。因此，根據C3這一截斷值水平來比較PBC 患者的一般特征。高補體C3 組（C3＞1.235 g/L）PLT、GGT、CHE、Alb、C4 明顯高于低補體C3 組（C3≤1.235 g/L）（P值均＜0.05），高補體C3組IgG、LSM、AAR、FIB-4 和纖維化分期明顯低于低補體C3 組（P值均＜0.05）。兩組間其他參數均無顯著差異（P值均＞0.05）。

ROC 曲線顯示肝硬化分期（S4）中C3 的最佳截斷值為1.005 g/L，診斷肝硬化的敏感度為100%，特異度為91.5%（AUC=0.968，95%CI：0.915～0.992）（圖1c）。因此，根據C3這一截斷值水平來比較PBC患者的一般特征。高補體C3 組（C3＞1.005 g/L）PLT、CHE、Alb 和C4 明顯高于低補體C3 組（C3≤1.005 g/L）（P值均＜0.05），高補體C3 組IgA、LSM、AAR、APRI、FIB-4 和纖維化分期明顯低于低補體C3組（P值均＜0.05）。兩組間其他參數均無顯著差異（P值均＞0.05）（表3）。

表3 不同肝纖維化分期患者補體C3 水平的一般特征Table 3 General characteristics of complement C3 levels in patients with different stages of hepatic fibrosis

2.4 補體C3與肝纖維化分期、肝硬度及三種無創肝纖維化評分的相關性 補體C3與肝纖維化分期的相關系數為-0.565（P＜0.001），即肝纖維化分期越高，補體C3的水平越低（圖2a）。LSM、AAR、APRI 及FIB-4 與補體C3 的相關系數分別為-0.439（P＜0.001）、-0.323（P=0.001）、-0.206（P=0.033）和-0.291（P=0.002）（圖2b～e）。相比于3種無創肝纖維化評分，C3與LSM的相關性更高。

圖2 補體C3與肝纖維化分期、肝硬度及3種無創肝纖維化評分的相關性Figure 2 The correlation between C3 and liver fibrosis stage， LSM， AAR score， APRI score and FIB-4 score

2.5 補體C3 水平與不同肝纖維化分期的關系 單因素Logistic 回歸分析顯示PLT、CHE、C3、LSM、AAR和FIB-4 是與顯著肝纖維化相關的危險因素；PLT、CHE、Alb、TBil、IBil、C3、LSM、AAR 和FIB-4 是進展期肝纖維化相關的危險因素；PLT、CHE、Alb、IBil、C3、C4、IgA、LSM、AAR 和FIB-4是肝硬化相關的危險因素（表4）。為了避免冗余和最大限度的提高統計能力，以P＜0.1 為界限選取在單因素Logistic 回歸中有意義的指標代入多因素Logistic 回歸進一步計算。在分別調整了不同肝纖維化分期的纖維化相關混雜因素后，模型1、2、3、4中補體C3水平均為顯著肝纖維化、進展期肝纖維化和肝硬化的獨立預測因素，而LSM 是顯著肝纖維化和進展期肝纖維化的獨立預測因素（表5）。

表4 不同肝纖維化分期指標的單因素分析Table 4 Univariate analysis of different liver fibrosis staging indicators

表5 不同肝纖維化分期調節混雜因素后指標的多因素分析Table 5 Multi-factor analysis of indicators after adjustment of confounding factors for different liver fibrosis stages

2.6 C3、LSM 及C3 聯合LSM 對不同肝纖維化分期的診斷性能 C3、LSM及C3聯合LSM診斷顯著肝纖維化AUC 分別為0.731、0.764、0.811，最佳cut-off值分別為1.445、14.050、0.632，C3 聯合LSM 診斷顯著肝纖維化的AUC 與補體C3 的相比，差異具有統計學意義（Z=2.604，P=0.009）。C3、LSM及C3聯合LSM診斷進展期肝纖維化AUC 分別為0.832、0.911、0.941，C3 聯合LSM診斷進展期肝纖維化的AUC與補體C3的相比，差異具有統計學意義（Z=3.033，P=0.002）。C3、LSM 及C3 聯合LSM 診斷肝硬化AUC 分別為0.968、0.910、0.976，C3 聯合LSM 診斷肝硬化的AUC 與補體C3 相比，差異不具有統計學意義（Z=1.050，P=0.294），C3聯合LSM診斷肝硬化的AUC與LSM相比，差異具有統計學意義（Z=2.326，P=0.020）（表6）。

表6 C3、LSM及C3聯合LSM對不同肝纖維化分期的診斷性能Table 6 Diagnostic performance of C3， LSM and C3 combined with LSM for different liver fibrosis stages

3 討論

目前，PBC 的年發病率為0.84/10 萬～2.75/10 萬，患病率為1.91/10 萬～40.2/10 萬，且PBC 的全球患病率呈不斷上升趨勢［1，5］。PBC 患者早期無明顯癥狀，主要表現為血清ALP、GGT 和AMA 的升高，部分患者會出現瘙癢、疲勞、黃疸等癥狀［6］，與本研究調查結果一致。PBC 患者的臨床預后與肝纖維化分期程度密切相關，如果沒有得到早期診斷和有效的治療，容易發展成肝硬化，甚至肝衰竭［7］。因此，尋找能有效評估肝纖維化程度的方法對PBC 的治療及病情控制具有重要意義。目前，肝活檢是評估PBC 肝纖維化分期的金標準，但其為有創操作且花費高，臨床應用受到限制。一些肝纖維化無創診斷模型，如AAR、APRI 和FIB-4 等，以及瞬時彈性成像技術對肝纖維化有較高的診斷價值，然而上述模型都需要進一步完善。有研究［8］發現肝硬化患者的Child評分與補體C3水平呈負相關。還有研究［9-10］證實血清補體C3 水平能評估慢性乙型肝炎相關分期的嚴重程度，低補體C3 水平的失代償性肝硬化患者容易發生慢加急性肝衰竭。這些研究表明補體C3 可能與肝纖維化分期相關，然而目前的研究主要關注于評估慢性乙型肝炎相關肝纖維化分期，關于PBC 患者肝纖維化程度評估的研究較少。基于此，本研究探討了血清補體C3 對PBC 患者肝纖維化程度的診斷價值。

補體是存在于正常人和動物血清及組織液中的一組經活化后具有酶活性的蛋白質。補體的激活有3種途徑：經典途徑、替代途徑和凝集素途徑［11］。生理情況下能參與機體的抗感染免疫及擴大體液免疫反應，促進組織修復。當補體系統過度激活時，也可介導炎癥反應，導致組織損傷，甚至器官衰竭。C3 是補體系統的中心分子，它的激活對于該系統執行的所有功能至關重要［12-13］。血清中存在的大部分補體蛋白是由肝臟產生和分泌的，其中C3 由肝細胞產生［14］。PBC是一種以小葉內膽管為靶點的自身免疫性肝臟疾病，其特點是超過90%的患者中存在自身抗體和高血清IgM［15］。然而，補體在PBC 中的作用只在有限數量的研究中被描述。根據本研究結果推測，補體C3 評估PBC 相關肝纖維化的可能機制有兩個方面，分別是補體的生成減少和消耗增多。補體生成減少：已有研究［16-17］表明PBC患者處于急性炎癥狀態時，肝細胞出現明顯損傷，補體蛋白的水平會比健康人群高。而持續的炎癥刺激導致膽管破壞、膽管形態異常和分泌功能障礙，出現膽汁淤積，肝細胞損傷進一步加重，容易發展成纖維化和肝硬化［18］。當肝纖維化發生時，肝細胞功能嚴重受損，補體蛋白產生減少［19］。補體的消耗增多：PBC 患者在發生肝損傷時會伴隨免疫應答反應，即生成抗原抗體復合物（IC），從而觸發補體系統的激活和補體成分的過度消耗［10］。但有研究［20］指出，PBC 患者膽管內無補體C3的沉積，這表明補體C3可能沒有通過經典途徑被激活而直接參與到PBC 患者膽管損傷的過程。這可能是因為PBC 患者膽管中IC 沉積，誘發更多的C3 與其結合，同時黏附于表達補體受體1 的紅細胞或血小板，然后運送至巨噬細胞被吞噬或清除，即免疫黏附作用導致血液循環中的補體C3水平下降。

本研究結果顯示，隨著肝纖維化程度的加重，補體C3 的水平呈下降趨勢。相關性分析也證實了這一現象，補體C3水平與肝纖維化分期呈負相關。這與以往的研究結果一致［21］。此外，補體C3 水平與LSM、AAR、APRI 及FIB-4 纖維化評分也呈負相關。ROC 曲線分析顯示，免疫功能指標中補體C3對PBC不同肝纖維化分期的診斷效能最佳。多因素Logistic 回歸分析顯示補體C3水平為顯著肝纖維化、進展期肝纖維化和肝硬化的獨立預測因素。因此，可以合理推斷補體C3水平可以在一定程度上評估PBC 患者的肝纖維化程度。此外，ROC 曲線分析顯示C3 聯合LSM 診斷PBC患者顯著肝纖維化、進展期肝纖維化的AUC與補體C3的相比，差異具有統計學意義；C3 聯合LSM 診斷PBC患者肝硬化的AUC與LSM的相比，差異具有統計學意義。這提示C3 聯合LSM 能進一步提高補體C3 或者LSM在診斷PBC患者肝纖維化分期程度時的效能。

綜上所述，補體C3 作為一種易獲取且不易受藥物因素影響的血清學指標，在評估PBC 患者肝纖維化程度方面具有重要的臨床價值，C3 聯合LSM 后診斷效能更加顯著。本研究局限性：（1）是一項單中心、小樣本、回顧性研究，患者的選擇可能出現偏差。未來應開展多中心、大樣本、前瞻性研究進一步驗證補體C3水平及C3聯合LSM對PBC患者肝纖維化程度的診斷價值。（2）目前的研究結果不能準確的判斷補體C3水平和PBC 患者肝纖維化發生的因果關系。（3）PBC目前還是一種罕見病，臨床收集的樣本量較少，尤其是肝穿刺確診的PBC 患者樣本量更少，所以統計結果可能會出現偏倚。

倫理學聲明：本研究方案于2019年12月25日經由天津市第二人民醫院倫理委員會審批，批號：［2019］58。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：周輝負責收集數據、資料分析及撰寫論文；牛斌負責收集數據和指導統計分析；宓余強負責指導文章撰寫；劉勇鋼負責病理評分；李萍負責課題設計和最后定稿。