基于小RNA 深度測序技術的苜蓿病毒病鑒定與分析

杜江，馬振男，王晨燕，張麗，王德富，牛顏冰*

（1. 山西農業大學生命科學學院，山西 太谷 030801；2. 山西農業大學草業學院，山西 太谷 030801）

紫花苜蓿（Medicago sativa）為豆科草本植物，是一種高營養成分的牧草，在農牧業生產中發揮著巨大的作用［1-2］。我國是畜牧大國，因此對于紫花苜蓿的需求量極為龐大，據統計紫花苜蓿在我國的種植面積呈現出逐年增長的趨勢［3］。伴隨著紫花苜蓿種植面積的不斷擴大，越來越多的紫花苜蓿病毒病也隨之被檢出。紫花苜蓿的病毒病害不僅嚴重影響了紫花苜蓿的產量和品質，還對紫花苜蓿產業的良性發展產生了巨大危害。

對危害紫花苜蓿的病毒病原進行調查，發現主要有苜蓿花葉病毒（alfalfa mosaic virus， AMV）、豇豆花葉病毒（cowpea mosaic virus， CPMV）、白三葉草花葉病毒（white clover mosaic virus， WCMV）、番茄花葉病毒（tomato mosaic virus， ToMV）、菜豆黃花葉病毒（bean yellow mosaic virus， BYMV）、黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus， CMV）、豌豆線條病毒（pea streak virus， PeSV）、苜蓿卷葉病毒（alfalfa leaf curl virus， ALCV）、菜豆卷葉病毒（bean leafroll virus， BLRV）和煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus， TMV）等多達47 種植物病毒［4-7］。研究發現，有些感病紫花苜蓿往往是被病毒復合侵染，如在甘肅、內蒙古、河南、陜西的紫花苜蓿上同時檢測到了AMV、苜蓿矮化病毒（alfalfa dwarf virus， ADV）和PeSV 的侵染；在甘肅不同品種的紫花苜蓿上同時檢測到了AMV 和WCMV 的侵染，并且有研究者發現病毒的侵染會顯著影響紫花苜蓿的過氧化物酶（peroxidase， POD）、多酚氧化酶（polyphenol oxidase， PPO）、苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase， PAL）的活性［6，8］。目前對于紫花苜蓿病毒病害的研究發展迅猛，但在部分重要紫花苜蓿種植區，紫花苜蓿病毒病的病原仍不清楚，限制了對該病害的研究和防治。

本研究于2021 年5 月在山西農業大學植物園（37°25′N，112°34′E）進行病害調查時，發現種植面積約為0.5 hm2的多年生紫花苜蓿有大量植株葉片有卷曲、皺縮、花葉的癥狀出現。為明確引起山西農業大學植物園內紫花苜蓿卷曲、皺縮和花葉癥狀的病毒病原，本研究采用小RNA（small RNA，sRNA）深度測序技術并結合分子生物學的方法，分離鑒定侵染山西農業大學植物園內紫花苜蓿的病毒病原，研究結果將為山西省紫花苜蓿病毒病的防治工作提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

在山西農業大學植物園內，采集有代表性的4 株具有典型病毒病癥狀的紫花苜蓿樣品，及1 株無癥狀樣品分別置于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.2 小RNA 深度測序

取等量4 株樣品混合后于2021 年5 月送至南京集思慧遠生物科技有限公司進行小RNA 的建庫及測序。利用Bwa（0.7.17-r1188）軟件和Velvet（1.1.07）軟件對小RNA 測序數據進行組裝和序列比對分析。

1.3 RNA、DNA 提取及PCR 驗證

RNA、DNA 提取及PCR 檢測于2021 年8-11 月進行。采用TRIzol（TaKaRa BIO INC）提取供試樣品總RNA，利用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa BIO INC）反轉錄合成cDNA。利用PlantZol 試劑盒（TransGen Biotech）提取樣品總DNA，提取好的RNA 和DNA 保存于-80 ℃超低溫冰箱。按照試劑盒說明書，配制含有5×gDNA Eraser Buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL，總RNA 1 μg，加RNase Free H2O 至10 μL，42 ℃保溫5 min 后，置于冰上迅速冷卻；然后向混合液中加入5×Prime Script Buffer 4 μL 的混合液，RT Primer Mix 1 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix 1 μL，加入RNase Free H2O 至20 μL，混勻后在37 ℃保溫15 min，最后85 ℃反應5 s 后得到第1 鏈cDNA。

以合成的第1 鏈cDNA 或DNA 作為模板，用表1 所示的病毒特異性引物進行PCR 擴增。PCR 反應體系如下：第1 鏈cDNA 或DNA 模板1 μL，PCR 引物（10 μmol·L-1）各2.0 μL，PrimeSTAR HS（Premix）（TaKaRa BIO INC）25 μL，最后加入RNase Free H2O 至50 μL。PCR 擴增程序：98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 0.5～3.0 min，共30 個循環。PCR 擴增產物用1 %的瓊脂糖凝膠電泳分析。將目標條帶回收后進行連接、轉化試驗，通過菌落PCR 鑒定后隨機挑選3 個陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

表1 本研究中使用的引物Table 1 Primers used in this study

表2 AMV-SX 與其他AMV 分離物的CP 基因核苷酸序列及氨基酸序列一致性Table 2 Nucleotide and amino acid sequence identities of CP gene between SX and other AMV isolates

1.4 數據分析

將上述陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，利用NCBI 中的BLAST 軟件（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.）進行同源性比對分析，利用DNAMAN 9.0 軟件和SDT version 1.2 軟件對序列進行拼接和比對分析，使用MEGA 7.0 軟件以鄰接法（Neighbor-joining）構建系統進化樹，可信度設置為1000 次自導復制驗證。采用Excel 2016 繪制柱狀圖。

2 結果與分析

2.1 紫花苜蓿樣品采集及小RNA 深度測序鑒定

采集的紫花苜蓿病害樣品葉片呈典型的花葉、皺縮、卷葉等癥狀（圖1）。紫花苜蓿樣品經小RNA 深度測序后，共獲得11037662 條原始序列（raw reads），去除raw reads 中低質量序列共獲得長度在18～28 nt 的clean reads數為7882612 條，占clean reads 的百分比為71.42%（圖2）。將獲得的contigs 過濾掉宿主基因組序列后與NCBI數據庫進行比對，共匹配到3 種植物病毒：苜蓿花葉病毒、苜蓿矮化病毒和豌豆線條病毒，共計117 條contigs 序列，其中AMV 相關序列49 條contigs，ADV 相關序列11 條contigs，PeSV 相關序列57 條contigs。所有組裝序列分別在AMV、ADV 和PeSV 的病毒基因組上標示（圖3），其中PeSV 相關序列比例最高，占49%，其他依次為AMV（42%）和ADV（9%）。在對高通量測序結果中一些較短的contigs 進行序列比對時，發現有5 條contigs 能夠比對到苜蓿卷葉病毒。

圖1 田間紫花苜蓿感病癥狀Fig.1 Symptoms of M. sativa plant in fields

圖2 sRNA 長度分布Fig.2 Small RNA length distribution

圖3 紫花苜蓿3 種病毒組裝序列在基因組中的位置和分布Fig.3 Position and distribution of 3 M. sativa viruses assembly contigs in the genome

2.2 PCR 法檢測紫花苜蓿病樣病毒

由于ADV、AMV 和PeSV 是RNA 病毒，遂以紫花苜蓿樣品RNA 反轉錄的cDNA 為模板，分別使用特異性引物 ADV-CP-F/ADV-CP-R、AMV-CP-F/AMV-CP-R 和PeSV-CP-F/PeSV-CP-R 進行PCR 擴增；而ALCV 為DNA 病毒，以紫花苜蓿樣品DNA 為模板，使用特異引物ALCV-F/ALCV-R 進行PCR 擴增。結果得到與4 種苜蓿病毒病AMV、PeSV、ALCV和ADV 大小相近的目的條帶（圖4），將回收的目的條帶進行測序。測序顯示與小RNA 結果一致，說明小RNA 測序結果具有可靠性。

圖4 感病樣品的PCR 擴增Fig.4 PCR amplification from the sample

2.3 AMV 分離物（SX）外殼蛋白系統發育進化分析

將擴增獲得的AMVCP基因序列上傳至GenBank 獲得登錄號OP748369，命名為苜蓿花葉病毒山西紫花苜蓿分離物（AMV-SX），并且將其CP基因與來自中國、阿根廷、伊朗、意大利、塞爾維亞和美國等18 個國家的AMV 外殼蛋白分離物進行氨基酸和核苷酸的相似性分析（表 2）。結果表明，AMV-SXCP基因編碼的氨基酸與其他AMVCP基因編碼的氨基酸同源性為97.25%～99.54%，氨基酸同源性最高的分離物為AMV-ACat（MW835977）；AMV-SXCP基因與其他AMVCP基因核苷酸同源性為96.85%～99.24%，核苷酸同源性最高的分離物為AMV-ACat（MW835977）。

為了進一步明確AMV-SX 外殼蛋白序列的分子進化關系，利用MEGA 7.0 軟件對AMV-SXCP基因編碼的氨基酸序列與已報道的其他AMV 分離物進行系統發育分析。本研究獲得的AMV 山西紫花苜蓿分離物 SX 與 AMV 阿根廷苜蓿分離物 ACat（MW835977）親緣關系最近，聚為一簇（圖5）；但是與我國其他地區分離物如Yuanyang-1/H2（OL706257）、See-1（MT093211）距離較遠，親緣關系較遠。

圖5 AMV-SX 外殼蛋白氨基酸系統發育分析Fig.5 Phylogenetic analysis of AMV-SX CP amino acid

2.4 ADV 分離物（SXJZ）外殼蛋白系統發育進化分析

同樣將擴增獲得的ADV 外殼蛋白序列上傳至GenBank 獲得登錄號OP957285，命名為苜蓿矮化病毒山西紫花苜蓿分離物（ADV-SXJZ），并且將CP基因與來自中國、阿根廷的27 個ADV 外殼蛋白分離物進行氨基酸相似性分析。結果表明，ADV-SXCP基因編碼的氨基酸與其他ADVCP基因編碼的氨基酸同源性為91.34%～99.43%，氨基酸同源性最高的ADV 分離物為N1（MZ221810）（圖6）。

圖6 ADV-SXJZ 外殼蛋白氨基酸相似性比對Fig.6 Pairwise amino acid sequence identity of ADV-SXJZ CP to other ADV

為了分析ADV 山西紫花苜蓿分離物（SXJZ）CP基因編碼的氨基酸與其他ADV 分離物的分子進化關系，采用MEGA 7.0 軟件進行系統發育分析（圖7）。ADV 山西紫花苜蓿分離物（SXJZ）CP基因編碼的氨基酸與中國ADV 分離物聚集在一個大的分支，并且與分離物ADV-N1（MZ221810）親緣關系最近，聚為一簇。

圖7 ADV-SXJZ 外殼蛋白氨基酸系統發育分析Fig.7 Phylogenetic analysis of ADV-SXJZ CP amino acid

2.5 ALCV 分離物（SXTG）全基因組序列一致性和系統發育分析

利用設計的背靠背引物（ALCV-F/ALCV-R）擴增獲得ALCV-SXTG 基因組全長序列，測序拼接后長度為2751 nt，這是首次在山西的紫花苜蓿樣品上擴增獲得ALCV 全基因序列。ALCV 序列上傳GenBank 獲得登錄號為OP748371。分析發現該基因組共編碼7 個開放閱讀框，分別為V4（113～403 nt），V2（118～264 nt），V3（225～677 nt），CP（523～1257 nt）、復制相關蛋白（replication-associated protein，1350～1733 nt，1870～2493 nt）、RepA（1697～2493 nt）和C3（1866～2363 nt）。對ALCVSXTG 全長基因與來自阿根廷、西班牙、伊朗、法國、意大利和中國的29 個ALCV 分離物進行核苷酸相似性比較，結果表明ALCV-SXTG 全長基因與ALCV 其他株系核苷酸同源性為75.88%～97.34%（圖8），其中與ALCV 阿根廷苜蓿分離物Colonia Dora（MG792026）的序列一致性最高，為97.34%，與ALCV 西班牙苜蓿分離物ES36（MH603849）的序列一致性最低，為75.88%。

圖8 ALCV-SXTG 核苷酸相似性比對Fig.8 Pairwise amino acid sequence identity of ALCV-SXTG to other ALCV

為了進一步明確ALCV-SXTG 的分子進化關系，利用MEGA 7.0 軟件對ALCV-SXTG 與已報道的其他ALCV 分離物進行系統發育分析（圖9）。 ALCV-SXTG 與來自中國和阿根廷的ALCV 分離物Colonia Dora （MG792026）親緣關系較近，聚為一大簇；而與法國、西班牙、伊朗的苜蓿ALCV 分離物距離較遠，親緣關系較遠。

圖9 ALCV-SXTG 基因全長系統發育分析Fig. 9 Phylogenetic analysis on genome sequence of ALCVSXTG and other reported isolates

2.6 PeSV 分離物（SXJZ）外殼蛋白系統發育進化分析

將PCR 擴增獲得的PeSV-SX 外殼蛋白序列上傳至GenBank 獲得登錄號OQ108501，命名為豌豆線條病毒山西紫花苜蓿分離物（PeSVSXJZ），并且CP基因編碼的氨基酸與其他PeSV分離物外殼蛋白編碼的氨基酸相似性達到100%。而與其他香石竹潛隱病毒屬（Carlavirus）成員相似性較低（圖10）。

圖10 PeSV-SXJZ 外殼蛋白核苷酸相似性比對Fig.10 Pairwise amino acid sequence identity of PeSV-SXJZ CP gene to other PeSV

進一步的分子進化關系顯示，山西紫花苜蓿PeSV分離物SXJZ 與已報道的其他PeSV 分離物聚集于一簇，而與其他Carlavirus成員距離較遠（圖11）。

圖11 PeSV-SXJZ 外殼蛋白氨基酸系統發育分析Fig. 11 Phylogenetic analysis of genome sequence of PeSV-SXJZ CP amino acid

3 討論

紫花苜蓿是營養價值極高的一類牧草，在畜牧業生產中有著極為重要的作用，因此了解紫花苜蓿病毒病的發生狀況及防治對策迫在眉睫。本研究通過sRNA 深度測序技術，發現山西農業大學植物園內種植的紫花苜蓿被苜蓿卷葉病毒、豌豆線條病毒、苜蓿花葉病毒和苜蓿矮化病毒4 種病毒復合侵染。這是首次在山西地區種植的紫花苜蓿樣品中檢測到上述4 種病毒的復合侵染。

AMV 是雀麥花葉病毒科（Bromoviridae）苜蓿花葉病毒屬（Alfamovirus）成員［9］。AMV 寄主廣泛，可以侵染上百種雙子葉植物，除了通過蚜蟲傳播外，還能夠以種子、花粉及汁液摩擦等方式傳播［10］。紫花苜蓿是AMV 最為常見的寄主，紫花苜蓿被其侵染后會產生葉片的皺縮、花葉甚至是嚴重矮化等癥狀［11］。Trucco 等［4］從采自阿根廷的紫花苜蓿病樣中擴增到了AMV 的全基因序列。我國也有研究人員發現甘肅張掖地區表現出黃斑花葉、葉柄扭曲及整株矮化癥狀的紫花苜蓿病原是AMV 和番茄花葉病毒［11］。本研究從采自山西農業大學植物園內感病的紫花苜蓿中同樣檢測到AMV的侵染，對外殼蛋白序列進行比對和進化分析發現，AMV 山西紫花苜蓿分離物與阿根廷紫花苜蓿分離物ACat（MW835977）親緣關系最近，但是與我國其他地區AMV 分離物親緣關系較遠，說明本研究AMV 分離物與其他地區AMV分離物來源不同，分析可能為帶病種子傳播所致。

ADV 是負義鏈RNA 病毒，為彈狀病毒科（Rhabdoviridae） 細 胞 質 彈 狀 病 毒 屬（Cytorhabdovirus）成員［12］。Bejerman 等［13］發現引起阿根廷紫花苜蓿節間縮短、葉片耳突等癥狀的病毒病原為ADV。隨后Samarfard 等［14］也從阿根廷的病樣中檢測到ADV 的侵染。熱甫卡提等［15］利用小RNA 測序技術從36 份采自新疆表現矮化、叢枝的紫花苜蓿樣品中檢測到ADV 的侵染。構建的系統進化樹顯示ADV 山西紫花苜蓿分離物SXJZ（OP957285）與同樣來自中國的ADV 紫花苜蓿分離物N1（MZ221810）、H6（MZ221816）、H2（MZ221813）、H1（MZ221812）、N2（MZ221811）、H3（MZ221814）和G（MZ221809）聚為一支，親緣關系較近。本研究是首次從山西紫花苜蓿樣品中檢測到ADV 的侵染。

苜蓿卷葉病毒是雙生病毒科（Geminiviridae）大戟潛隱病毒屬（Capulavirus）成員［16］。Guo 等［17］2019 年在河南種植的紫花苜蓿上檢測到ALCV 的侵染。Davoodi 等［16］通過系統發育分析發現，ALCV 最有可能起源于伊朗，并在中東多樣化，然后傳播到地中海盆地，之后再傳播到阿根廷。將ALCV 山西紫花苜蓿分離物SXTG（OP748371）全基因組序列進行相似性和進化分析，結果顯示SXTG（OP748371）與ALCV 阿根廷苜蓿分離物Colonia Dora（MG792026）親緣關系最近，達到97.34%，與ALCV 中國分離物和ALCV 阿根廷分離物聚集為一個大支，而與ALCV 法國、西班牙和伊朗分離物親緣關系較遠。進一步的研究表明，ALCV 侵染往往伴隨有AMV的復合侵染現象［8］。本研究利用小RNA 測序技術和RT-PCR 的方法同時在山西紫花苜蓿上檢測到AMV 和ALCV 的侵染，這與Guo 等［17］的研究結果是一致的。本研究是首次在山西紫花苜蓿上檢測到ALCV 的侵染。

PeSV 是乙型線形病毒科（Betaflexiviridae）香石竹潛隱病毒屬（Carlavirus）成員［18］。有研究發現在美國豌豆（Pisum sativum）廣泛種植區檢測到PeSV 的侵染，不僅會導致豌豆的莖和葉柄產生紫褐色條紋，還造成靜脈壞死和畸形［19］。目前已在多種豆科植物上，如紫花苜蓿、紅三葉草和蠶豆上檢測到了PeSV 的侵染［19］。PeSV 山西紫花苜蓿分離物（SXJZ）進化分析表明，本研究中擴增到的PeSV-SXJZ 與其他的PeSV 分離物聚集為一個分支，并且PeSV-SXJZ 外殼蛋白氨基酸序列與其他PeSV 分離物的外殼蛋白氨基酸序列相似性達到了100%。本研究中PeSV 是首次從山西采集的紫花苜蓿上檢測到該病毒的侵染。

紫花苜蓿病毒的復合侵染現象非常普遍，Alshahwan 等［20］在沙特阿拉伯紫花苜蓿樣品中檢測到了AMV、CMV、WCMV 和BLRV 的復合侵染。Massumi 等［21］對伊朗田間紫花苜蓿病毒病害檢測發現有AMV、BYMV、花生矮化病毒（peanut stunt virus， PSV）和BLRV 4 種不同的病毒。本研究中，利用小RNA 測序技術并結合RTPCR 的方法對采自山西農業大學植物園內的感病紫花苜蓿樣品進行病毒病原鑒定，共檢測出AMV、ADV、ALCV 和PeSV 四種病毒。這是首次在山西省內的紫花苜蓿上檢測到AMV、ALCV、ADV 和PeSV 四種病毒的復合侵染。本研究結果不僅豐富了侵染紫花苜蓿的病毒病原信息，還將會為紫花苜蓿病毒病的有效防控及抗病毒育種提供一定的理論依據。

4 結論

本研究利用小RNA 深度測序技術結合RT-PCR/PCR 的方法對采自山西農業大學植物園中表現花葉、皺縮、卷曲的紫花苜蓿樣品進行病毒病原的鑒定，發現導致樣品癥狀產生的病毒病原為AMV、PeSV、ADV 和ALCV四種病毒。本研究是首次從種植于山西的紫花苜蓿上檢測到AMV、ADV、ALCV 和PeSV 的復合侵染，該研究結果有助于深入了解侵染紫花苜蓿的病毒病分子進化，為紫花苜蓿抗病毒育種提供了一定的理論基礎。