叢枝菌根真菌與褪黑素對多年生黑麥草耐熱性的影響

衛宏健，賀文員，王越，唐明，陳輝

（華南農業大學林學與風景園林學院， 嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室， 廣東 廣州 510642）

褪黑素（N-乙酰-5-甲氧基色胺，melatonin， MT，化學式C13H16N2O2）是廣泛存在于動植物體內的吲哚類化合物，具有很強的抗氧化作用［7］。植物中褪黑素的合成主要涉及色氨酸脫羧酶（tryptophan decarboxylase， TDC）、色胺5 羥化酶（tryptamine 5-hydroxylase， T5H）、血清素N-乙酰轉移酶（serotonin N-acetyltransferase， SNAT）、咖啡酸O-甲基轉移酶（caffeic acid O-methyltransferase， COMT）和乙酰血清素甲基轉移酶（acetylserotonin methyltransferase， ASMT）［8-9］。褪黑素作用于多種植物細胞代謝和生物過程，包括生根、光合作用和脅迫耐受性［10-11］。特別是褪黑素（無論是外源施用或基因表達生物合成的內源褪黑素）作為一種有效的抗氧化劑、膜穩定劑和生物刺激劑，可改變氧化還原基因的表達或者滲透物質的水平，從而顯著提高植物對生物與非生物脅迫的耐受性［12］。外源褪黑素通過提高高羊茅（Festuca arundinacea）幼苗體內抗氧化酶活性水平和葉片的光合效率，同時降低膜滲透性、丙二醛（malonaldehyde， MDA）和過氧化氫（hydrogen peroxide， H2O2）含量，以提高高羊茅幼苗的耐熱性［13］。高溫脅迫下植物調節褪黑素合成的相關基因（如BjTDC1和BjSNAT1）的表達，以增強芥菜（Brassica juncea）的高溫耐受性［14］。因此，富含褪黑素的植物或外源施用褪黑素在改善植物生長和抗脅迫能力方面具有很高的潛力。

已知大多數陸生植物的根系能與叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi， AMF）形成共生關系［15］。前人研究發現，叢枝菌根（arbuscular mycorrhizal， AM）共生能夠提高宿主植物對干旱、鹽、高溫和低溫等非生物脅迫的抗性［16-18］。高溫脅迫下，接種AMF 通過延緩葉片的可溶性糖、可溶性蛋白質、游離脯氨酸和葉綠素質量分數的下降以提高杜鵑花（Rhododendron simsii）的耐熱性［19］。接種AM 真菌（Septoglomus deserticola和Septoglomus constrictum）可以通過降低番茄（Solanum lycopersicum）脂質過氧化水平和H2O2積累量，提高活性氧清除劑的活性，進而緩解番茄的高溫損傷［20］。Zhang 等［21］發現AM 真菌異形根孢囊霉（Rhizophagus irregularis）通過提高蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）內源褪黑素的含量，提高了對重金屬鉛（Pb）的耐受性，證明了共生微生物在植物中調節和合成褪黑素的潛力。目前關于菌根化植物在熱脅迫下調節褪黑素產生的機制，以及AM 真菌與褪黑素聯合應用對宿主植物的發育和耐熱性方面的影響尚不清楚。因此，本研究以多年生黑麥草為試驗材料，通過接種AM真菌異形根孢囊霉和澆灌外源褪黑素，探索AMF 和外源褪黑素對高溫脅迫下多年生黑麥草的生長、內源褪黑素含量及其合成基因的表達水平，抗氧化酶活性和小分子滲透物質含量的影響，為解析褪黑素對菌根化植物的非生物脅迫抗逆性機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與基質

本研究所用的多年生黑麥草種子（品種：首相Ⅲ）購買于天津百綠國際草業有限公司。多年生黑麥草種子在75%的乙醇溶液中浸泡5 min 進行表面消毒，然后用無菌蒸餾水漂洗4 次。此外，將沖洗過的種子種植在含有基質（沙子∶泥炭=1∶3，v/v）的塑料盆中（高10 cm，直徑10 cm），播種密度為20 g·m-2。基質中有機質含量5.68 g·kg-1、速效磷含量22.01 mg·kg-1、速效氮含量34.53 mg·kg-1和速效鉀含量71.23 mg·kg-1。在種植多年生黑麥草種子之前，用75%的乙醇溶液對塑料盆進行消毒，并在播種前連續3 d 在高壓滅菌鍋中（121 ℃，0.11 MPa）對基質進行消毒1 h。在最適溫度條件［25 ℃/20 ℃（晝/夜）］、60%的相對濕度、14 h/10 h（光/暗）的光周期以及650 mmol·m-2·s-1的光照強度下，將幼苗養在生長室中。為保持土壤濕潤，初始階段花盆在早上和晚上都進行了灌溉。出苗后每天給植物澆水一次，每7 d 對植物進行修剪，以保持8 cm 的冠層高度，同時每周使用半濃度的Hoagland 營養液澆灌一次，以保證足夠的營養供應。外源褪黑素（AR 級），購于上海麥克林生化科技有限公司。研究使用的叢枝菌根真菌為異形根孢囊霉（BGC BJ09，Ri）來自華南農業大學林學與風景園林學院，利用玉米（Zea mays）作為宿主植物進行擴繁后，用蔗糖梯度離心法獲得的孢子作為接種物［22］。將1 mL 含有約400 個孢子的水溶液作為孢子劑接種到14 d 苗齡的多年生黑麥草幼苗根系附近，非菌根（non-mycorrhizal，NM）處理為接種相同體積的滅菌孢子劑（在121 ℃的高壓滅菌鍋中滅菌15 min）。

1.2 試驗設計

在接種Ri 45 d 后于2022 年10 月在華南農業大學林學與風景園林學院進行盆栽試驗。選取48 盆多年生黑麥草幼苗，均分為最適溫度條件（CK）和高溫條件（high temperature，HT）兩組，每組包含4 個處理，包括：1）既不接種AM 真菌也不澆灌外源褪黑素溶液（NM-NT）；2）僅根部接種AM 真菌（AM-NT）；3）僅用褪黑素溶液灌根（NM-MT）；4）褪黑素和AM 真菌聯合處理（AM-MT）。每個處理6 個重復（6 個盆栽），最適溫度（CK）為25 ℃/20 ℃（日/夜），高溫處理（HT）為38 ℃/33 ℃（日/夜），生長室其他條件不變：60%的相對濕度、14 h/10 h（光/暗）的光周期以及650 mmol·m-2·s-1的光照強度，高溫處理共進行28 d。參考Zhang 等［23］的試驗設計，在熱脅迫處理前3 d，每天用5 mL 20 mmol·L-1褪黑素（MT）灌溉幼苗，隨后在余下的28 d 內每隔7 d 澆灌一次，對不施用褪黑素（NT）的幼苗澆灌等體積的蒸餾水。高溫處理28 d 后收樣，將地上地下部分分開，洗凈后測量鮮重后放進80 ℃烘箱內烘干至恒重，稱量并記錄其干重。其中每個處理選取4 盆植株根系來評估AM 定殖的效果，樣品的其余部分用液氮研磨成粉末，并保存在-80 ℃冰箱后進行下一步分析。

1.3 菌根定殖率的測定

每個處理隨機選取4 盆多年生黑麥草的根系，按照Koske 等［24］的方法對根系進行染色，利用放大十字交叉法［25］計算菌根定殖率。菌根定殖率（%）=侵染點數量/檢測的總交叉點數量×100。

1.4 抗氧化酶活性測定

采用氮藍四唑法測定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性［26］。采用愈創木酚法測定過氧化物酶（peroxidase， POD）活性［27］。采用紫外吸收法測定過氧化氫酶（catalase，CAT）活性［28］。采用Nakano 等［29］的方法測定抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性。參考Chen 等［30］的方法測定吡咯啉-5-羧酸還原酶（pyrroline-5-carboxylate reductase，P5CR）活性。采用深圳子科生物科技有限公司的試劑盒，測定苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）和多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性。

1.5 膜脂過氧化指標與滲透調節物質測定

參照高俊鳳［31］的方法測定根系MDA 含量和相對電導率（electrolytic leakage，EL）。采用蘇州科銘技術有限公司生產的試劑盒測定滲透調節物質含量，按照試劑盒說明進行測定并計算脯氨酸、可溶性糖、類黃酮、總酚和甜菜堿含量。

1.6 內源褪黑素含量測定

取0.1 g 根樣，液氮速凍后低溫研磨至粉末，加入900 μL PBS 緩沖液（pH=7.4）充分混合，12000 r·min-1離心15 min 后取上清液為待測樣品。使用深圳子科生物科技有限公司褪黑素酶聯免疫分析試劑盒（酶聯生物）測定褪黑素含量。

(5)成效慢.白猿通背拳需要日積月累的練習才能達到一定的效果，但反觀現在發展的比較出色的跆拳道、空手道等，其基本內容略微簡單，訓練體系較為明晰，學生學上數月，便可看出成效.但白猿通背拳的練習則要以年來計算，并且對身體協調性與力量有著極高的要求，若沒有足夠的時間練習，則很難收獲想要的成績.

1.7 基因表達分析

總RNA 采用Trizol 試劑盒參考說明書進行提取，經Nanodrop 2000 檢測濃度和純度以及用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性后，根據Fermentas cDNA synthesis 試劑盒說明書進行反轉錄合成cDNA。參考TaKara 公司的SYBR System 操作手冊，采用實時熒光定量PCR 儀（BioRad，CFX96，美國）進行PCR 擴增。每個處理設置 6 個生物學重復，每個生物學重復設置3 個技術重復?；蛱禺愋砸镄蛄袇⒖急?1 進行合成，以LpeIF4A基因為內參基因［32］。根據得到的Ct 值，利用2-ΔΔCt法，分別計算目標基因在不同處理下的相對表達量。

表1 試驗所用引物Table 1 Primers used in the study

1.8 數據分析

采用Microsoft Excel 2019 對試驗數據進行圖表分析，用 SPSS 22.0 軟件進行方差分析，用 Duncan’s 法在P＜0.05 水平下進行多重比較。采用Origin 2022 進行制圖以及主成分分析（principal component analysis，PCA）。

2 結果與分析

2.1 外源褪黑素處理對高溫脅迫下AMF 定殖率的影響

無論是否添加了外源褪黑素，熱脅迫均顯著降低了Ri 在多年生黑麥草根系的定殖率（P＜0.05）。在最適溫度和熱脅迫條件下，褪黑素處理均顯著提高了Ri 的定殖率（P＜0.05），其中最適溫度下褪黑素處理的菌根化多年生黑麥草表現出更高的定殖率（87.61%）（圖1）。

圖1 不同處理下叢枝菌根真菌在多年生黑麥草根系的定殖率Fig. 1 Colonization rate of perennial ryegrass roots by arbuscular mycorrhizal fungi under different treatments

2.2 外源褪黑素處理和AM 共生條件下多年生黑麥草內源褪黑素含量及其合成基因轉錄水平對高溫脅迫的響應

最適溫度條件下，相比于NM-NT 和AM-NT 處理，NM-MT 和AM-MT 處理的根系內源MT 含量分別顯著增加了1.12 和1.03 倍（P＜0.05）。在高溫條件下，外源褪黑素顯著提高了AM 和NM 多年生黑麥草的根系內源MT 含量（P＜0.05）（圖2A）。

圖2 不同處理下的多年生黑麥草內源褪黑素含量及其合成基因轉錄水平Fig.2 Endogenous melatonin content and transcript levels of its synthetic genes in perennial ryegrass under different treatments

高溫脅迫下，相比于AM-NT 處理，AM-MT 處理的 MT 合 成 基 因LpTDC1、LpTDC2、LpT5H、LpSNAT、LpASMT1和LpASMT3的轉錄水平顯著上升了43.84%、50.55%、21.25%、32.63%、40.25% 和44.83%（P＜0.05），而LpCOMT1的相對表達量則無顯著變化（P＞0.05）（圖2B～H）。與NM-MT 處理相比，AM-MT 處理的根系LpTDC1、LpT5H、LpSNAT、LpCOMT1、LpASMT1和LpASMT3基因相對表達量顯著增加（P＜0.05）（圖2B～H）。此外，在最適溫度條件下，AM-NT 和AM-MT 處理的根系LpTDC1、LpT5H和LpSNAT基因的轉錄水平與NM-NT 和NMMT 處理差異不顯著（P＞0.05）（圖2B，D，E）。AMMT 和NM-MT 處理的根系LpTDC2、LpCOMT1、LpASMT1和LpASMT3基因轉錄水平顯著高于（P＜0.05）AM-NT 和NM-NT 處理。

2.3 外源褪黑素處理和AM 共生條件下多年生黑麥草生長參數對高溫脅迫的響應

高溫脅迫抑制了多年生黑麥草的生長，而AM-NT、NM-MT 和AM-MT 處理均減輕了熱應激引起的生長抑制（圖3A，B）。在高溫條件下，AM-MT 處理的草坪質量、株高、地上和地下部分的鮮重和干重均顯著高于AMNT 和NM-MT 處理（P＜0.05）（圖3C 和表2）。此外，在最適溫度條件下，AM-NT 處理的草坪質量、株高、地上和地下部分的鮮重和干重與NM-MT 處理差異不顯著（P＞0.05）。

圖3 不同處理對高溫脅迫下多年生黑麥草生長和草坪質量的影響Fig.3 Effect of different treatments on growth and turf quality of perennial ryegrass under high temperature stress

表2 不同處理下的多年生黑麥草生長參數Table 2 Growth parameters of perennial ryegrass under different treatments

2.4 外源褪黑素處理和AM 共生條件下多年生黑麥草膜脂過氧化和抗氧化酶活性對高溫脅迫的響應

高溫脅迫下，與NM-NT 相比，AM-NT、NM-MT 和AM-MT 處理均顯著降低了根系MDA 含量和EL（P＜0.05），且AM-MT 的根系MDA 含量和EL 顯著低于其他處理（P＜0.05）。此外，在最適溫度條件下，NM-NT，NM-MT，AM-NT 和AM-MT 處理之間的根系MDA 含量和EL 無顯著差異（P＞0.05）（圖4A， B）。

圖4 不同處理下的多年生黑麥草膜脂過氧化指標和抗氧化酶活性Fig.4 Indicators of membrane lipid peroxidation and antioxidant enzyme activity in perennial ryegrass under different treatments

最適溫度條件下，NM-NT，NM-MT，AM-NT 和AM-MT 處理之間的根系SOD、POD 和APX 活性無顯著差異（P＞0.05）（圖4C，D 和F），而與NM-NT 和NM-MT 處理相比，AM-NT 和AM-MT 處理顯著提高了根系CAT活性（P＜0.05）（圖4E）。熱脅迫條件下，與NM-NT 相比，NM-MT，AM-NT 和AM-MT 處理均顯著提高了根系SOD、POD、CAT 和APX 的活性（P＜0.05），其中AM-MT 處理下這4 種酶的活性最高。

2.5 外源褪黑素處理和AM 共生條件下多年生黑麥草PAL 和PPO 活性及其編碼基因轉錄水平對高溫脅迫的響應

最適溫度條件下，NM-NT，NM-MT，AM-NT 和AM-MT 處理之間的PAL 和PPO 活性，以及LpPAL和LpPPO的轉錄水平無顯著差異（P＞0.05）。高溫脅迫下，與NM-NT 相比，AM-NT、NM-MT 和AM-MT 處理均顯著提高了根系PAL 活性和LpPAL基因的轉錄水平（P＜0.05），且AM-MT 處理顯著高于其他處理（P＜0.05）（圖5A，B）。與NM-NT 相比，高溫脅迫下AM-NT 和AM-MT 處理均顯著降低了根系PPO 活性和LpPPO轉錄水平（P＜0.05），其中AM-MT 處理顯著低于其他處理（P＜0.05）（圖5C，D）。

圖5 不同處理下的多年生黑麥草PAL 和PPO 活性及其編碼基因轉錄水平Fig.5 PAL and PPO activities and the transcription levels of their encoding genes in perennial ryegrass under different treatments

2.6 外源褪黑素處理和AM 共生條件下多年生黑麥草滲透調節物質對高溫脅迫的響應

在最適溫度條件下，NM-NT，NM-MT，AM-NT 和AM-MT 處理之間的根系脯氨酸含量（圖6A）、P5CR 活性（圖6B）和LpP5CS轉錄水平（圖6C）無顯著差異（P＞0.05）。高溫脅迫下，與NM-NT 相比，NM-MT 和AM-MT處理均顯著提高了（P＜0.05）根系的脯氨酸含量、P5CR 活性和LpP5CS轉錄水平（圖6A～C），但NM-MT 與AM-MT 處理之間均無顯著差異（P＞0.05），且NM-MT 處理的根系脯氨酸含量顯著低于AM-NT 處理（P＜0.05）。高溫脅迫下，NM-MT 處理的根系類黃酮含量顯著高于AM-NT 和AM-MT 處理（P＜0.05）（圖7B），而NM-MT 和AM-NT 處理下的根系可溶性糖、總酚和甜菜堿含量則無顯著差異（P＞0.05），AM-MT 處理的根系可溶性糖、總酚和甜菜堿含量均顯著高于其他處理（P＜0.05）（圖7A，C 和E）。

圖6 不同處理下的多年生黑麥草脯氨酸含量、P5CR 活性和LpP5CS 轉錄水平Fig.6 Proline content， P5CR activity and LpP5CS transcript levels in perennial ryegrass under different treatments

圖7 不同處理下的多年生黑麥草滲透調節物質含量Fig.7 Content of osmoregulatory substances in perennial ryegrass under different treatments

2.7 主成分分析

為評價高溫脅迫下不同處理對多年生黑麥草根系抗氧化系統與滲透調節物質的影響，進行了主成分分析，使用多年生黑麥草根系的抗氧化相關參數（MDA、EL、SOD、POD、CAT 和APX）和滲透調節物質相關參數（脯氨酸、總酚、類黃酮、甜菜堿和可溶性糖含量，以及PAL 和PPO 活性）的數據進行分析。每個點代表本試驗中的一種處理類型，其中兩個主成分中PC1 占比77.2%，PC2占比16.4%，PC1 顯示CK（最適溫度）處理與HT（高溫）處理明顯分開，AM-MT-HT 處理與其他處理的差異最大（圖8）。

圖8 不同處理下的多年生黑麥草抗氧化與滲透調節物質相關參數主成分分析Fig. 8 Principal component analysis of parameters related to antioxidant and osmoregulatory substances in perennial ryegrass under different treatments

3 討論

在非脅迫條件下，與擬南芥（Arabidopsis thaliana）等植物類似，多年生黑麥草含有較低和恒定量的褪黑素［33］，脅迫條件下褪黑素能夠通過植物信號轉導幫助植物應對氧化損傷，發揮其內源性抗氧化劑的作用［34］。本研究中高溫脅迫刺激了根系中褪黑素的積累，表明高溫脅迫下多年生黑麥草可能通過增加褪黑素的積累提高其抗氧化能力。AM 接種促進了高溫脅迫下褪黑素的合成，這表明AM 植物在高溫脅迫下可以產生豐富的褪黑素，以應對熱應激導致的氧化損傷。Liu 等［35］觀察到脅迫條件下真菌Trichoderma asperellum中褪黑素的積累，說明微生物在非生物脅迫條件下參與褪黑素的積累。因此，AM 真菌產生的褪黑素可能有助于熱脅迫下多年生黑麥草根部褪黑素的積累。外源施用褪黑素或過表達褪黑素生物合成基因可提高植物內源褪黑素含量，增強植物抗逆性［36］。植物體內褪黑素合成首先通過TDC 和T5H 活性將色氨酸轉化為血清素。在轉基因水稻（Oryza sativa）種子中過表達OsTDC3導致褪黑素水平比野生型（wild type， WT）增加31 倍，進而延遲轉基因水稻中暗誘導的葉片衰老［37］。SANT 催化5-羥色胺轉化為N-乙酰血清素，人類SNAT基因在轉基因水稻中的異位表達除了表現出強耐寒性外，還表現出更高的內源性褪黑素水平［38］。此外，COMT 將N-乙酰5-羥色胺甲基化為褪黑素，在轉基因水稻中過表達OsCOMT也顯著提高內源褪黑素含量，抑制OsCOMT的表達導致褪黑素水平降低［39］。ASMT 是褪黑素合成中的末端酶，在褪黑素合成過程中起限速作用［40］。Fu 等［41］發現在干旱和低溫脅迫下多年生黑麥草通過上調LpASMT1和LpASMT3基因的轉錄水平，以增加內源褪黑素的積累，進而增強耐旱性和耐寒性。本研究發現外源MT 處理導致高溫脅迫下NM 和AM 多年生黑麥草內源褪黑素含量顯著增加，與較高的褪黑素合成基因LpTDC1、LpT5H、LpSNAT、LpCOMT1、LpASMT1和LpASMT3的轉錄水平相關。因此，褪黑素生物合成基因轉錄水平的提高和內源褪黑素含量上升可提高多年生黑麥草的耐熱性。

熱脅迫顯著降低了Ri 在多年生黑麥草根系的定殖率。Wei 等［18］認為非生物脅迫下AMF 在植物根中定殖率的下降與植物的光合作用下降有關，因為光合作用下降減少了宿主植物對菌根真菌的碳分配。在對熱脅迫下生菜（Lactuca sativa）［42］和薰衣草（Lavandula angustifolia）［43］的菌根真菌定殖研究中也發現了類似的結果。褪黑素處理和AM 接種提高了高溫脅迫下多年生黑麥草的株高，地上和地下部分鮮重和干重，這是因為AM 共生和褪黑素都能保護宿主植物的光合系統，提高在高溫脅迫下的光合速率，從而增加生物量，改善宿主植物對AMF 的碳分配并提高定殖率。

一般來說，在合適的生長條件下，植物細胞中的ROS 水平處于動態平衡狀態，而非生物脅迫可以誘發過多的ROS 生成和膜脂過氧化，導致植物代謝功能失調［44］。細胞內MDA 的產生是過多ROS 引起細胞膜脂過氧化的結果，EL（反映膜的完整性）和MDA 水平是評估植物氧化應激水平的重要指標［45］。AM 接種和褪黑素處理均降低了EL 和MDA 水平，以保護多年生黑麥草免受氧化應激。植物活性氧清除系統大多包含抗氧化物質和抗氧化酶，包括SOD、APX 和POD，SOD 催化O2-歧化為O2和H2O2，而CAT 和POD 則分別在葉綠體和細胞質將H2O2降解為無毒害作用的水分子和氧氣，同時APX 參與抗壞血酸-谷胱甘肽（AsA-GSH）循環，催化抗壞血酸和H2O2反應，從而協助清除植物體內的H2O2［18，46］。因此，褪黑素和AM 共生對高溫耐受性的協同作用與減少氧化損傷和提高了抗氧化酶活性相關。

脯氨酸能調節氧化還原電位，保護大分子不被羥基自由基變性和清除，作為一種重要的滲透調節物質，可提高細胞的滲透調節能力，參與細胞代謝，維持膨壓，保護膜結構的完整性，以維持正常的代謝活動，從而降低非生物脅迫對植物細胞的傷害［47］。1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（1-pyrrolin-5-carboxylate synthetase， P5CS）和P5CR 是植物脯氨酸合成途徑的關鍵酶［48］。Antoniou 等［49］發現褪黑素處理可以增加脯氨酸的積累以緩解干旱對紫花苜蓿（Medicago sativa）造成的損傷。也有研究發現褪黑素處理通過上調MtP5CS基因的轉錄水平和增加P5CR 活性來增加脯氨酸含量，以提高菌根化蒺藜苜蓿的重金屬耐受性［21］。本研究結果與之相似，Ri 接種與褪黑素處理以及兩者的聯合，通過提高P5CR 活性和LpP5CS基因的轉錄水平，增加熱脅迫條件下多年生黑麥草根部脯氨酸含量，提高滲透調節能力，進而提高植物的抗逆性。PAL 是苯丙烷代謝途徑的一種關鍵酶，植物體內苯丙烷途徑的代謝產物包括多酚類、黃酮類和花青素，高溫會誘導植物體內這些保護性小分子物質的合成和積累，以緩解熱脅迫損傷［50］。Liang 等［51］認為使用褪黑素可以通過提高SOD、CAT 和POD 活性，提高抗氧化能力，并通過促進類黃酮生物合成緩解葉片衰老。褪黑素處理增強了獼猴桃（Actinidia chinensis）的PAL 活性，提高了耐寒性，表明了褪黑素在類黃酮合成中的潛在作用［52］。熱脅迫條件下PPO 通過苯酚氧化產生劇毒的醌類物質，降低膜的完整性和抗氧化活性，導致膜脂過氧化［53］。氧化和聚合會對酚類物質的特性產生不利影響，妨礙其清除ROS 的能力。接種Ri 和應用外源褪黑素降低了PPO 活性和增強了PAL 活性，表明AM 接種和應用褪黑素增加了酚類物質的代謝，提高了多年生黑麥草的高溫耐受性。在涉及AMF 接種的植物生物相互作用過程中，經常會出現PAL 活性的增加，以及酚類物質的積累。此外，上調的苯丙素途徑可能參與了宿主與AMF 之間信號傳遞，這可能是植物面對非生物脅迫的一種防御策略［54］。

可溶性總糖是草坪草細胞碳水化合物代謝中的關鍵物質，對組織、器官的構建起重要作用，有利于增強草坪草的抗逆性，含量高低一般與植物抵抗逆境的能力呈正比［55］。甜菜堿是植物面對非生物脅迫時一種常見的滲透調節物質，參與植物細胞的滲透調節，亦可作為滲透保護物質提高生物大分子結構和功能的穩定性，防止蛋白質結構受到其他物質的破壞，穩定蛋白質的四級結構，尤其是在脅迫條件下，甜菜堿可以作為一種低分子量的伴侶分子起到對酶蛋白構象的穩定作用，并使酶蛋白處于激活且有功能的狀態，增強酶的活力［56］。因此，可溶性總糖和甜菜堿含量的上升，可以有效激活多年生黑麥草的酶促防御系統，增強高溫脅迫下多年生黑麥草的抗氧化酶活性，進而提高多年生黑麥草抵御高溫脅迫的能力。AM 接種與外源褪黑素均可以通過增加酚類物質、脯氨酸和可溶性糖的含量，改善植物的滲透調節，提高多年生黑麥草的耐熱性。然而，AM 接種和褪黑素應用對脯氨酸和類黃酮積累沒有協同作用，這表明AM 真菌和褪黑素的應用對提高高溫耐受性有不同的作用。黃酮類化合物和脯氨酸的合成都受到水楊酸的調控［57-58］，褪黑素應用［59］和AM 接種［60］對水楊酸調節的相反影響可能解釋了這一結果。而水楊酸代謝是否導致AM 共生和褪黑素之間的相互作用，以及褪黑素-植物激素相互作用對AM 植物的非生物脅迫抗性的影響，還有待進一步研究。

4 結論

總而言之，高溫脅迫下褪黑素處理促進了多年生黑麥草根部的AM 共生，且AM 接種與外源褪黑素處理可以通過上調多年生黑麥草根系中褪黑素合成基因的轉錄水平，提高內源褪黑素的含量。AM 接種和褪黑素處理對多年生黑麥草的生長和高溫耐受性有協同作用，這種協同作用可能與減輕氧化損傷，調控抗氧化酶活性，以及滲透調節物質含量有關。所以，AM 接種與褪黑素處理聯合應用是幫助宿主植物應對高溫環境的潛在有效策略。