不同精粗比對牦牛糞便菌群結構的影響

聶洪辛，李毓敏，龐凱悅，柴沙駝，4，申迪，曾子銘，廖揚，王迅，薛斌，劉書杰，王書祥，4*，楊英魁，4*

（1. 青海大學畜牧獸醫科學院，青海 西寧 810016；2. 青海省高原放牧家畜動物營養與飼料科學重點實驗室，青海 西寧 810016；3. 青海省牦牛工程技術研究中心，青海 西寧 810016；4. 農業農村部青藏高原放牧牦牛藏羊動物營養與飼草料重點實驗室，青海 西寧 810016）

牦牛被稱作“高原之舟”，是青藏高原特有牛種［1］。我國現有牦牛1400 萬頭左右，約占世界牦?？倲档?5%以上，主要分布在青海、西藏、甘肅等高海拔地區，其中青海490 萬頭左右，約占全國牦?？倲档?0%，居全國首位［2-4］。目前牦牛的飼養方式仍以長年放牧為主，致使牦牛對營養物質攝入不足，而通過調整飼糧中精粗比可以滿足牦牛的營養需要［5］。在飼糧精粗比正常情況下，腸道內的菌群可以和宿主及外部環境建立動態的生態平衡，但當飼糧中精料過高或過低時［6-7］，則可能導致腸道菌群發生紊亂［8-9］。腸道菌群能夠抵抗外源致病因子的入侵，協助宿主免疫系統消滅外病原微生物，在維持腸道健康方面發揮著重要作用。健康的反芻動物腸道菌群中多以厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、變形菌門為優勢菌門，而優勢菌屬的差異較大［10］。反芻動物的腸道菌群大多集中在結腸，對糞便菌群和結腸內容物菌群的結構比較后發現，糞便菌群與腸道菌群有許多相似之處［11-13］，所以糞便菌群狀況可以間接地反映出腸道菌群的基本情況。因此，本試驗擬采用16S rDNA 高通量測序，研究不同精粗比飼糧對牦牛糞便中微生物菌群結構的影響，旨在為牦牛的合理飼養提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計與飼養管理

試驗于2019 年9-12 月在青海省貴南縣老扎西養殖基地進行。選取24 頭體重相近、健康的3 歲公牦牛隨機分成2 組，分別飼喂低精粗比飼糧（35∶65， C35組）和高精粗比飼糧（65∶35， C65組），每組3 個重復。預試期15 d，正試期90 d，共計105 d。參考我國肉牛飼養標準（NY/T815-2004）進行試驗飼糧設計［14］，8：00 和17：00 進行飼喂，試驗期間所有牦牛自由飲水。試驗飼糧組成及營養成分占比見表1。

表1 試驗飼糧組成及營養水平Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets

1.2 樣品采集

在飼養試驗結束后從兩組中各隨機抽取6 頭牦牛收集糞便。用直腸糞便提取法收集糞便樣品置于2 mL 凍存管并暫存于液氮中，帶回實驗室-80 ℃保存待測。

1.3 DNA 提取、測序及分析

由北京奧維森基因科技有限公司對提取的樣品進行16S rDNA 高通量測序。采用十六烷基三甲基溴化銨法（cetyl trimethyl ammonium bromide， CTAB）［15］，又稱西曲溴銨法，從糞便樣本中提取DNA。使用條形碼特異引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′）和806R（5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′）來擴增16S rRNA 基因的不同區域（16S V3-V4）。使用TruSeq DNA PCR-Free Libraray Preparation Kit 建庫試劑盒（美國Illumina 公司）進行文庫構建，并經過Qubit 和PCR（qPCR）定量和檢驗合格后，使用Illumina NovaSeq 6000 進行上機測序。測序平臺得到的原始數據利用Trimmomatic v0.36 軟件、Pear v0.9.6 軟件進行質控和過濾，把相似性大于97%的優質序列篩選出來，計算操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU），最后對OTU 聚類、物種分類、多樣性指數和群落結構進行統計分析。

1.4 數據處理

采用SPSS 27.0 軟件進行單因素方差分析（oneway ANOVA），同時用LSD 法進行差異顯著性比較，P＜0.05 為差異顯著，P＞0.05 為差異不顯著，結果均以平均值和均值標準誤差（standard error of mean，SEM）表示。

2 結果與分析

2.1 不同精粗比飼糧對牦牛糞便菌群豐富度與多樣性的影響

2 組共產生1702 個OTU，其中C35組產生254 個OTU，C65組產生175 個OTU，兩組共有的OTU 數目為1273 個，占總OTU 數目的74.79%（圖1）。隨著測序深度的增加，C35與C65組的糞便細菌稀釋曲線呈逐漸平緩的趨勢（圖2），這表明測序程度可以覆蓋樣品中大多數微生物菌群。通過Alpha 多樣性分析可知（表2），C35組的物種數、Chao1 指數與Shannon 指數顯著高于C65組（P＜0.05）。通過主坐標分析（principal coordinates analysis， PCoA）可知（圖3），C35組與C65組牦牛糞便菌群結構具有明顯差異。

圖1 OTU 韋恩圖Fig.1 OTU venn diagram

圖2 糞便細菌稀釋曲線Fig.2 Fecal bacterial dilution curve

圖3 細菌區系主坐標分析Fig.3 PCoA of bacterial flora

2.2 不同精粗比飼糧對牦牛糞便菌群組成門水平的影響

在門水平（表3）上，牦牛糞便中主要的細菌門有厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門。其中，C35組牦牛糞便中髕細菌門和藍藻菌門極顯著高于C65組（P＜0.01），放線菌門顯著高于C65組（P＜0.05）；C65組牦牛糞便中擬桿菌門、螺旋體門顯著高于C35組（P＜0.05）；其他菌門組間無顯著差異。

表3 不同精粗比對牦牛糞便菌群組成的影響Table 3 Effects of different concentrate to forage ratio on microflora composition of yak feces

2.3 不同精粗比飼糧對牦牛糞便菌群組成屬水平的影響

在屬水平上，牦牛糞便中主要的細菌屬是UCG-005（表4）。其中，C35組牦牛糞便中毛螺菌科_NK3A20群顯著高于C65組（P＜0.05）；C35組牦牛糞便中未培養的屬、瘤胃球菌屬極顯著高于C65組（P＜0.01），C65組未培養細菌屬、擬普雷沃氏菌屬、密螺旋體屬顯著高于C35組（P＜0.05）；其他菌屬組間無顯著差異。

表4 不同精粗比飼糧對牦牛糞便菌群組成的影響Table 4 Effects of different concentrate to forage ratio on bacterial community composition of yak feces

2.4 不同精粗比飼糧對牦牛糞便菌群代謝途徑及功能的影響

在KEGG2 水平上，糞便樣本中有20 個相對豐度值高的基因家族（相對豐度＞0.10%）。在這20 個基因家族中，C65組復制和修復、翻譯、核苷酸代謝、其他次生代謝物的合成、細胞生長和死亡的基因家族相對豐度極顯著高于C35組（P＜0.01）（表5）。

表5 不同精粗比飼糧對牦牛糞便菌群KEGG 二級代謝通路的影響Table 5 Effects of diets with different concentrate to forage ratios on KEGG secondary metabolic pathway of fecal bacteria in yaks

3 討論

3.1 不同精粗比飼糧對牦牛糞便細菌豐富度與多樣性的影響

16S rDNA 高通量測序技術能夠快速準確地對牦牛糞便菌群結構變化進行分析，其中Alpha 多樣性分析可以測定微生物群落的豐富度與多樣性，需要測定的指標包括Chao1 指數和Shannon 指數。Chao1 指數越大則說明菌群豐富度越高，Shannon 指數越大則說明菌群多樣性越高［16］。劉飛鴻［17］研究了不同精粗比對肥胖空懷母牛腸道菌群多樣性的影響，結果表明：低精料組母牛腸道菌群多樣性顯著高于高精料組。Pang 等［18］研究發現，隨著飼糧精粗比的提高，牦牛糞便微生物菌群的豐富度和多樣性呈顯著性降低。在本試驗中，Chao1 指數與Shannon 指數隨精料的增加而顯著降低，與上述研究結果一致，說明飼喂高精粗比飼糧（65∶35）會降低牦牛糞便菌群的豐富度與多樣性。

3.2 不同精粗比飼糧對牦牛糞便細菌結構的影響

對于反芻動物微生物細菌多樣性及結構特性，已有研究證明厚壁菌門及擬桿菌門在反芻動物瘤胃和糞便微生物中處于優勢菌門［19-21］，其原因是在反芻動物飼糧中，粗飼料占比通常達70%及以上，是瘤胃微生物的主要營養來源，而擬桿菌門與厚壁菌門在反芻動物胃腸道粗纖維的消化過程中發揮著重要作用。放線菌門或變形菌門的豐度值次于擬桿菌門與厚壁菌門［22-23］。本研究發現，C35組與C65組牦牛糞便微生物菌群中厚壁菌門的相對豐度占整個菌門的72.08%，擬桿菌門的相對豐度占整個菌門的21.44%，而放線菌門的相對豐度占整個菌門的1.97%，結果與上述一致。厚壁菌門主要參與結構性碳水化合物的降解，而擬桿菌門是非纖維物質降解過程中最重要的菌門，這兩種菌在反芻動物營養代謝中起著至關重要的作用［24-25］。本研究發現，C65組牦牛糞便中擬桿菌門顯著高于C35組，表明飼喂高精粗比飼糧促進了牦牛糞便中非纖維降解菌的增殖。本研究結果表明，C65組牦牛糞便中螺旋體門豐度顯著高于C35組，其原因為螺旋體門是產酸菌，主要以碳水化合物為營養來源，能將碳水化合物轉化為簡單的揮發性脂肪酸［26］。本研究發現，C35組牦牛糞便中髕細菌門極顯著高于C65組。但目前對該菌的作用還不了解［27］，有待進一步研究。藍藻菌門為化能自養菌，其以二氧化碳為碳源，通過氧化氮、磷等營養元素為自身提供能量，來合成有機物質［28-29］。本研究發現，C35組牦牛糞便中藍藻菌門極顯著高于C65組。而反芻動物主要以粗飼料為食，糞便富集藍藻菌門可能與飼糧組成有關。放線菌門隸屬于革蘭氏陽性菌，大多是腐生菌，可引起腸道疾?。?0］。在本研究中，C35組牦牛糞便中放線菌門的相對豐度顯著高于C65組，表明飼喂高精粗比飼糧（65∶35）可能會影響腸道健康。

反芻動物糞便中發現數量最多的細菌屬是瘤胃球菌科［31-32］。但在本試驗中，牦牛糞便中的細菌是以UCG-005 屬為主，這與Caporaso 等［31］和Meale 等［32］的結果有差異，可能是由于牦牛品種的特殊性、飼糧精粗比、飼養環境不同導致。本研究發現，C35組牦牛糞便中瘤胃球菌屬的豐度極顯著高于C65組。而反芻動物胃腸道中的瘤胃球菌屬通過分解宿主消化系統的纖維素來獲取營養，瘤胃球菌屬與纖維素酶和半纖維素酶［33-34］通過協同作用將飼糧中的纖維轉化為宿主所需的營養素。結果表明，飼喂低精粗比飼糧可提高牦牛糞便中瘤胃球菌屬豐度值。毛螺菌科能夠降解飼料中的纖維素和半纖維素，并參與機體能量代謝［35-36］。本研究中，C35組牦牛糞便中毛螺菌科_NK3A20 群菌屬的豐度顯著高于C65組，表明飼糧中精飼料的提高會降低牦牛糞便中毛螺菌科的豐度值。在本試驗中，C65組牦牛糞便中密螺旋體屬顯著高于C35組。但目前對密螺旋體屬的作用尚不清楚。擬普雷沃氏菌屬會產生大量的琥珀酸及乙酸，有利于維持腸道穩態［37］。在本試驗中，C65組牦牛糞便中擬普雷沃氏菌屬顯著高于C35組，這表明飼喂高精粗比飼糧更有利于牦牛的腸道健康。

3.3 不同精粗比飼糧對牦牛糞便菌群代謝途徑及功能的影響

通過PICRUSt 軟件可以預測微生物菌群的代謝通路，對牦牛糞便微生物菌群進行KEGG 通路的功能性注釋后可以得出，功能通路主要富集于碳水化合物代謝、輔助因子和維生素代謝、氨基酸代謝、萜類和多酮類代謝、復制和修復、能量代謝，這些通路對反芻動物胃腸道微生物群落的生長繁殖起到了重要作用［38］。能量是飼料的重要組成部分，碳水化合物是牦牛的主要能量來源［39］，氨基酸對牦牛體內的生理生化功能起調節作用，可促進其生長，改善生產性能［40］，并且氨基酸代謝與飼糧組成緊密相關［41］。由此可以看出，在牦牛的生長過程中，碳水化合物代謝與氨基酸代謝尤為重要。核苷酸代謝多數以輔酶或輔助因子形式存在，可以參與動植物的能量代謝［42］。本試驗發現，C65組核苷酸代謝、復制和修復、翻譯、其他次生代謝物的合成、細胞生長和死亡的基因家族相對豐度極顯著高于C35組。本研究推測，飼糧中精粗比為65∶35 有助于牦牛能量代謝通路的上調。

4 結論

通過研究不同精粗比飼糧對牦牛糞便微生物菌群結構的影響得出，飼糧中精粗比會影響牦牛糞便菌群的多樣性與豐富度。且飼喂精粗比為65∶35 的飼糧可以促進牦牛糞便中非纖維降解菌的增殖，提高擬普雷沃氏菌屬的豐度值，但抑制毛螺菌科的生長。