益生菌對雞葡萄球菌性關(guān)節(jié)炎的預(yù)防效果研究

宋 翔，謝全喜，谷 巍

（ 山東寶來利來生物工程股份有限公司 山東省動物微生態(tài)制劑重點實驗室，山東 泰安 271000 ）

雞葡萄球菌性關(guān)節(jié)炎是由金黃色葡萄球菌（SA）引起雞的急性或慢性細菌性傳染病，該病發(fā)病無明顯季節(jié)性。SA 主要引起腱鞘、關(guān)節(jié)的黏液囊等部位的局部化膿、臍炎、眼炎，偶見細菌性心內(nèi)膜炎和腦脊髓炎、敗血癥、關(guān)節(jié)炎、皮膚壞死和骨膜炎等[1-2]。SA 感染通常引起幼雞敗血癥、中雞關(guān)節(jié)炎、成雞慢性局灶性病變，一般認為6～12周齡育成雞是發(fā)生關(guān)節(jié)炎的高峰期[3]。由于雞葡萄球菌性關(guān)節(jié)炎發(fā)病后很難痊愈，生產(chǎn)指標(biāo)顯著下降，現(xiàn)已成為困擾集約化養(yǎng)禽業(yè)的重要傳染病之一。雞葡萄球菌性關(guān)節(jié)炎若能夠及時發(fā)現(xiàn)鑒別并采取防治措施，可減少一定的經(jīng)濟損失。實際生產(chǎn)中多采用添加抗生素防治疾病，但抗生素不規(guī)范使用導(dǎo)致耐藥性問題愈發(fā)嚴重，因此尋求更為安全、環(huán)保、有效防控雞葡萄球菌性關(guān)節(jié)炎的途徑迫在眉睫。本研究建立雞葡萄球菌性關(guān)節(jié)炎模型，比較對SA 敏感的抗生素和益生菌對SA 的抑制效果，以期為雞葡萄球菌性關(guān)節(jié)炎的臨床防治及益生菌應(yīng)用于獸醫(yī)診療提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

病料來源：山東省泰安市某規(guī)模化三黃雞場2022—2023年大群多批次出現(xiàn)跛行、癱雞、關(guān)節(jié)腫等癥狀，發(fā)病雞以每天約以1‰增加，淘汰率居高不下。養(yǎng)殖戶曾針對病雞癥狀多次投藥，治療效果不明顯。本研究使用的病料為出現(xiàn)關(guān)節(jié)病變雞關(guān)節(jié)囊中的關(guān)節(jié)滲出液。

藥敏紙片共計18種，分別為多西環(huán)素、慶大霉素、林可霉素、大觀霉素、四環(huán)素、頭孢克肟、阿莫西林、恩諾沙星、卡那霉素、鏈霉素、萬古霉素、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、甲氧嘧啶、克拉霉素、美羅培南、硫酸新霉素、氨芐西林，均購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司。

益生菌共計14 株，其中植物乳桿菌4 株（BLCC2-0015、BLCC2-0355、BLCC2-0410、BLCC2-0426），鼠李糖桿菌5 株（BLCC2-0175、BLCC2-0527、BLCC2-0016、BLCC2-0182、BLCC2-0106），羅伊氏乳桿菌5株（BLCC2-0345、BLCC2-0118、BLCC2-0241、BLCC2-0275、BLCC2-0312），均由山東寶來利來生物工程股份有限公司生物工程研究院菌種資源保藏中心提供。

主要試劑：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、Baird-Parker瓊脂培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司；TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0 購自寶生物工程（大連）有限公司。免疫球蛋白G（IgG）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-10（IL-10）檢測試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 雞葡萄球菌性關(guān)節(jié)炎的鑒定

1.2.1.1 臨床癥狀及PCR鑒定測序

病禽出現(xiàn)腿部關(guān)節(jié)癥狀主要考慮雞葡萄球菌性關(guān)節(jié)炎、滑液囊支原體病或病毒性關(guān)節(jié)炎，因此主要針對SA、滑液囊支原體及禽呼腸孤病毒進行實驗室診斷鑒定。

參考文獻[4-6]設(shè)計SA、滑液囊支原體和禽呼腸孤病毒引物各一對，由濟南博尚生物工程股份有限公司合成。無菌采集病死雞的關(guān)節(jié)滲出液分別進行SA、滑液囊支原體、禽呼腸孤病毒的PCR 鑒定及測序，3 種病原PCR 引物信息見表1。

表1 3種病原PCR引物Tab.1 PCR primers for three pathogens

1.2.1.2 菌落及菌體形態(tài)特征

將關(guān)節(jié)滲出液接種于Baird-Parker 瓊脂培養(yǎng)基，置于37 ℃培養(yǎng)18 h后進行觀察。勾取典型單菌落進行涂片，革蘭氏染色后鏡檢。

1.2.1.3 生化特性

按照Raid ID 32 STREP陽性菌鑒定試條說明書，將純化培養(yǎng)的分離菌置37 ℃下培養(yǎng)24～48 h，用ATB自動化微生物生化鑒定系統(tǒng)進行生化特性鑒定。

1.2.2 具有抑制SA作用的抗生素的篩選

按K-B 法對分離純化的SA 進行藥敏試驗[7]，檢測其對18種常用抗菌藥物的敏感性，抑菌效果判斷標(biāo)準(zhǔn)參考美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會（CLSI）的標(biāo)準(zhǔn)。將培養(yǎng)的菌液濃度為108CFU/mL 的SA 稀釋至106CFU/mL，吸取20 μL至傾注的固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基上均勻涂布，等間距對稱放置7個藥敏紙片，37 ℃溫箱培養(yǎng)18 h，采用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑。每種藥敏紙片做3個重復(fù)，取其平均值。

1.2.3 具有抑制SA作用的益生菌的篩選

將培養(yǎng)的菌液濃度為108CFU/mL 的SA 稀釋至106CFU/mL，吸取100 μL 至傾注的固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基上均勻涂布，采用牛津杯法[8-9]測定14株益生菌培養(yǎng)物對SA的體外抑菌效果，分別在牛津杯內(nèi)加入200 μL 益生菌發(fā)酵液，37 ℃溫箱培養(yǎng)18 h，采用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，每株益生菌設(shè)3個重復(fù)，取其抑菌圈直徑的平均值。

1.2.4 敏感抗生素與益生菌抑制SA效果比較

1.2.4.1 雞葡萄球菌性關(guān)節(jié)炎模型構(gòu)建

借鑒斯日古楞等[10]、葉秋瑩等[11]對小鼠進行的金黃色葡萄球菌性關(guān)節(jié)炎的病理模型的構(gòu)建方法，選取20 日齡SPF雞，隨機分為2組，分別為試驗組和對照組，每組10只。試驗組每只雞左側(cè)腿部關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射1×106CFU/mL 的SA菌懸液，劑量為0.2 mL/只；對照組每只雞左側(cè)腿部關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射無菌生理鹽水，劑量為0.2 mL/只。觀察期14 d，根據(jù)各組雞的精神狀態(tài)、采食、飲水、站立與行動狀態(tài)、腿部關(guān)節(jié)剖檢等綜合判斷模型構(gòu)建是否成功。

1.2.4.2 預(yù)防效果驗證

選取13 日齡，體重相近、健康情況基本相同的SPF 雞120 只，隨機分為4 組，每組30 只。空白對照組、攻菌對照組的試驗雞正常飼喂；抗生素組在飲水中添加篩選的對SA敏感的抗生素，于18～20日齡連續(xù)飲用3 d，使用劑量參照產(chǎn)品說明進行；益生菌組在飲水中添加篩選出的益生菌培養(yǎng)物，于13～20 日齡連續(xù)飲用7 d，飲用劑量為1×109CFU/只，2 h 內(nèi)飲完。除空白對照組外的其余3 組，均在20日齡參照1.2.4.1進行SA的攻菌。連續(xù)觀察14 d。

分別在攻菌后0、7、14 d，每組隨機選擇5 只翅靜脈采血，進行血清IgG 抗體水平及IL-6、IL-10 含量的檢測；觀察期結(jié)束后各組進行安樂死，取關(guān)節(jié)腔內(nèi)的關(guān)節(jié)液進行PCR鑒定，檢測SA感染率。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進行單因素方差分析。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞葡萄球菌性關(guān)節(jié)炎的鑒定

2.1.1 臨床及剖檢癥狀

部分病雞表現(xiàn)為消瘦、精神萎靡、羽毛蓬亂，個別雞腳趾變形，呈“八字步”，嚴重者腿關(guān)節(jié)癱伏、著地。

由圖1可知，部分病雞趾關(guān)節(jié)、跗關(guān)節(jié)、腳墊等病變部位有出血、結(jié)痂；嚴重者跗關(guān)節(jié)有炎性滲出物，部分已凝固，其他臟器未見明顯異常。

圖1 腿部病變Fig.1 Leg lesions

2.1.2 PCR擴增結(jié)果（見圖2）

圖2 PCR擴增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results

由圖2 可知，細菌16S rRNA 的PCR 鑒定分離菌株用16S rRNA PCR 擴增出約1 492 bp 的PCR 目的基因條帶，而滑液囊支原體和禽呼腸孤病毒均未檢測到目的條帶。

分離菌株P(guān)CR產(chǎn)物測序結(jié)果與Gen Bank中登錄的參考株SA 的基因序列同源性為98.9%～99.9%。綜上，可初步確定致病原為SA。

2.1.3 菌落形態(tài)特征（見圖3）

圖3 Baird-Parker瓊脂培養(yǎng)基上菌落形態(tài)特征Fig.3 Morphological characteristics of colonies on Baird-Parker AGAR medium

由圖3可知，經(jīng)培養(yǎng)出現(xiàn)灰黑色、有光澤、有淺色邊緣的菌落，菌落周圍繞有不透明圈。

勾取典型單菌落與無菌采取的病變組織分別進行涂片、革蘭氏染色、鏡檢。各培養(yǎng)物涂片和病料直接涂片的形態(tài)基本一致，均為葡萄狀、數(shù)量眾多的革蘭氏陽性球菌，初步鑒定為SA。

2.1.4 生化特性鑒定

通過過氧化氫酶試驗和血漿凝固酶試驗，發(fā)現(xiàn)該菌株呈過氧化氫酶試驗陽性、血漿凝固酶試驗陽性，V-P 試驗和過氧化氫酶試驗陽性；不產(chǎn)生H2S，可分解葡萄糖、半乳糖、甘露糖、麥芽糖、蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。上述生化特點符合SA 的特性，因此，綜合臨床癥狀、剖檢變化和實驗室診斷，確診該病例主要是由SA感染引起的關(guān)節(jié)炎。

2.2 藥敏試驗結(jié)果（見表2）

表2 藥敏試驗結(jié)果Tab.2 Results of drug susceptibility test

由表2 可知，絕大多數(shù)抗生素存在嚴重的耐藥性。中敏抗生素有4 種，分別為：萬古霉素、左氧氟沙星、美羅培南、硫酸新霉素。僅篩選到2種高敏抗生素，分別為阿莫西林和甲氧嘧啶，其中阿莫西林抑菌圈直徑高達19.67 mm，因此選取抗生素阿莫西林進行后續(xù)試驗。

2.3 益生菌篩選結(jié)果（見表3）

表3 益生菌篩選結(jié)果Tab.3 Results of probiotic screening 單位：mm

由表3 可知，5 株益生菌對SA 分離株具有抑制效果，其余9 株益生菌的抑菌圈直徑為0，對SA 無抑菌性；BLCC2-0410抑菌圈直徑最高，可達19.74 mm，對SA具有較強的抑菌性，因此選擇BLCC2-0410進行后續(xù)試驗。

2.4 敏感抗生素與益生菌抑制SA感染效果比較

2.4.1 雞葡萄球菌性關(guān)節(jié)炎模型的構(gòu)建

整個觀察期內(nèi)，對照組雞飲水、采食正常、精神狀態(tài)良好。感染SA 后第7 d，試驗組大群雞表現(xiàn)喜臥或常站立、不愿走現(xiàn)象，采食、飲水不積極；第10 d，試驗組雞有輕微跛行，行動遲緩、關(guān)節(jié)腫脹不明顯，飲水量，采食量出現(xiàn)下降；第14 d，試驗組雞精神倦怠，臥地不起、嚴重者出現(xiàn)行走障礙腿部關(guān)節(jié)出現(xiàn)明顯腫脹，飲水量采食量下降明顯，部分雞消瘦嚴重，嚴重者出現(xiàn)死亡。試驗組雞剖檢后，腿部跗關(guān)節(jié)腔內(nèi)大多有微量透明膿液。因此，綜合臨床雞剖檢病變，可判定SA關(guān)節(jié)炎模型構(gòu)建成功。

2.4.2 抗生素與益生菌對雞葡萄球菌性關(guān)節(jié)炎的預(yù)防效果比較

2.4.2.1 益生菌對雞血清IgG抗體水平的影響（見表4）

表4 益生菌對雞血清IgG抗體水平的影響Tab.4 Effect of probiotics on serum IgG antibody level of chicken 單位：μg/L

由表4可知，攻菌當(dāng)天，各組雞血清IgG抗體水平差異不顯著（P＞0.05）；攻菌后第7 d，攻菌對照組、抗生素組和益生菌組雞血清IgG 抗體水平與空白對照組相比均有所下降，攻菌對照組與抗生素組雞血清IgG抗體水平顯著低于益生菌組和空白對照組（P＜0.05）；攻菌后第14 d，攻菌對照組與抗生素組雞血清IgG抗體水平顯著低于益生菌組和空白對照組（P＜0.05）。益生菌組雞血清IgG抗體水平較空白對照組略有上升，但差異不顯著（P＞0.05）。

2.4.2.2 益生菌對雞血清IL-6含量的影響（見表5）

表5 益生菌對雞血清IL-6含量的影響Tab.5 Effect of probiotics on serum IL-6 content of chicken 單位：ng/L

由表5 可知，攻菌當(dāng)天，各組雞血清IL-6 含量差異均不顯著（P＞0.05）；攻菌后第7 d，攻菌對照組、抗生素組和益生菌組雞血清IL-6含量較空白對照組均出現(xiàn)激增的情況，攻菌對照組與抗生素組雞血清IL-6含量顯著高于益生菌組和空白對照組（P＜0.05）；攻菌后第14 d，攻菌對照組、抗生素組和益生菌組雞血清IL-6含量均高于空白對照組，其中攻菌對照組與抗生素組雞血清IL-6含量顯著高于空白對照組（P＜0.05）。

2.4.2.3 益生菌對雞血清IL-10含量的影響（見表6）

表6 益生菌對雞血清IL-10含量的影響Tab.6 Effect of probiotics on serum IL-10 content of chicken 單位：ng/L

由表6可知，攻菌當(dāng)天，各組雞血清IL-10含量差異均不顯著（P＞0.05）；攻菌后第7 d，攻菌對照組、抗生素組和益生菌組雞血清IL-10 含量均顯著高于空白對照組（P＜0.05），益生菌組雞血清IL-10 含量顯著高于其余3 組（P＜0.05）；攻菌后14 d，攻菌對照組、抗生素組和益生菌組雞血清IL-10含量均高于空白對照組，其中益生菌組雞血清IL-10含量顯著高于其余3組（P＜0.05）。

2.4.2.4 益生菌對雞SA感染率的影響（見表7）

表7 益生菌對雞SA感染率的影響Tab.7 Effect of probiotics on SA infection rate in chickens

由表7 可知，空白對照組SA 感染率為0；攻菌對照組最高，達到36.67%；其次為抗生素組，達到23.33%；益生菌組SA 感染率最低，為13.33%。由此可見，益生菌對雞葡萄球菌性關(guān)節(jié)炎感染率的降低作用較抗生素高。

3 討論

雞葡萄球菌性關(guān)節(jié)炎一般可經(jīng)血源性傳播或由外傷感染引起。飼養(yǎng)管理不當(dāng)造成的皮膚破損或足墊皮膚開裂和潰瘍、接種、蚊蟲叮咬是葡萄球菌關(guān)節(jié)炎發(fā)生的常見原因。目前雞葡萄球菌性關(guān)節(jié)炎防控以投喂抗生素為主，而耐藥性可通過質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)移[12-13]，因此造成了SA 耐藥性不斷強化，對各種抗生素的敏感性越來越差。而且，使用抗生素很難治愈雞葡萄球菌性關(guān)節(jié)炎，這可能是因為關(guān)節(jié)部位為肢端，血管相對較少，且病灶局部形成無效腔、軟組織瘢痕化，從而導(dǎo)致局部供血貧乏，投喂藥物較難以進入該部位，導(dǎo)致關(guān)節(jié)腔內(nèi)很難達到有效治療濃度。而疫苗只能降低雞葡萄球菌性關(guān)節(jié)炎的流行性和發(fā)病的嚴重程度，但不能根除該病[14]，因此尋找有效預(yù)防雞葡萄球菌性關(guān)節(jié)炎的方法具有顯著重要意義。

益生菌可對一些病原微生物產(chǎn)生拮抗作用，使機體對疾病具有一定的抵抗力。彭紅艷等[14]研究發(fā)現(xiàn)，益生菌對大腸桿菌和SA 的生長均具有一定的抑制作用。王二柱等[15]研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合益生菌與金霉素配伍可抑制SA生長。鄭佳奇等[16]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌菌株對耐藥性SA 的抑制能力強。林松泉等[17]研究發(fā)現(xiàn)，益生菌植物乳桿菌、干酪乳桿菌與鼠李糖乳桿菌對大腸桿菌和雞葡萄球菌均具有明顯的抑制效果。姜林娟等[18]研究發(fā)現(xiàn)，益生菌植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、羅伊乳桿菌對白色念珠菌、福氏志賀菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、SA 的抑菌效果明顯。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)論一致。

李萬軍[19]研究發(fā)現(xiàn)，采用基礎(chǔ)日糧+0.3%益生菌飼喂大骨雞，大骨雞外周血IgG含量顯著高于對照組。劉鳳美等[20]研究表明，益生菌對提高大型肉雞的免疫器官指數(shù)具有顯著作用，肉雞血清IgG含量明顯提升。上述研究結(jié)論與本研究結(jié)果一致。雖然益生菌應(yīng)用于SA感染的研究很多，但以治療腸道性疾病為主，使用益生菌預(yù)防、治療SA感染關(guān)節(jié)部位的應(yīng)用研究較少。Vaghef-Mehrabany 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，副干酪乳桿菌能夠顯著降低類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清中炎癥因子水平，顯著增加抗炎因子的分泌，延緩類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。Alipour等[22]研究表明，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者口服補充干酪乳桿菌，疾病活躍度顯著下降，細胞因子IL-10、白細胞介素-12（IL-12）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平顯著降低。Amdekar 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，干酪乳桿菌能夠輔助吲哚美辛治療的關(guān)節(jié)炎大鼠，緩解血管翳的形成以及滑膜濕潤、骨破壞等癥狀的發(fā)展。崔鵬月等[24]試驗篩選出4株具有改善機體炎癥反應(yīng)的潛力的益生菌，其中2 株能夠顯著降低炎癥模型細胞白細胞介素-1β（IL-1β）的分泌，1株能夠顯著降低炎癥模型細胞的IL-6分泌。上述研究結(jié)論與本研究結(jié)果一致。

益生菌不產(chǎn)生耐藥性，可為解決養(yǎng)禽業(yè)耐藥性問題提供新途徑。益生菌可提高飼料的轉(zhuǎn)化率，改善動物腸道健康，降低腹瀉，也可作為一種有效的免疫增強劑，能夠增強多種免疫細胞的功能，從而使機體建立起有效的免疫屏障，清除入侵的病原菌。雖然益生菌預(yù)防葡萄球菌性關(guān)節(jié)炎的具體作用機制尚未明確，但益生菌是值得進一步研究預(yù)防葡萄球菌性關(guān)節(jié)炎的有效方法。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，益生菌可以明顯提高機體免疫力，降低感染金黃色葡萄球菌導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，對雞葡萄球菌性關(guān)節(jié)炎具有一定的預(yù)防作用。