高明地區手足口病EV71的分子流行病學情況及核酸序列同源性的進化性分析

鐘劍文 陳卓儀 陳健珍 譚安琦 劉翠嫻 張 宇

廣東省佛山市高明區人民醫院檢驗科 528500

手足口病系腸道病毒引起以幼兒為主要發病群體的臨床常見傳染性疾病,其中以腸道病毒71型(EV71)和柯薩奇病毒A組16型(CA16)為最常見的病原體,此外,非EV71/CA16的腸道病毒也占一定比例[1]。既往已有學者對手足口病流行特點進行分析[2],但有關EV71的分子流行特征及基因同源性進化情況目前尚無報道。為進一步明確EV71流行的分離株基因特征及其變異趨勢,本文以高明地區手足口病陽性標本為例,調查EV71的分子流行病學,并進行核酸序列同源性進化分析,以期為手足口病的臨床早期防治提供參考。

1 資料與方法

1.1 資料來源 選擇2020年1月—2022年12月高明區人民醫院及疾控中心提供來源于1 547例手足口病患者的陽性標本共1 547份,其中2021年802份,2022年745份,包括普通病例(輕型)、重癥病例和死亡病例的糞便標本和咽拭子標準,-80℃保存。

1.2 方法

1.2.1 病毒RNA提取。采用PureLink Viral RNA/DNA Mini Kit試劑盒(美國賽默飛世爾科技公司生產),按照試劑盒說明書進行病毒RNA提取操作。將提取到的病毒RNA溶解于40μl洗脫液當中,并于-20℃保存。

1.2.2 RT-PCR檢測。將提取到的病毒RNA作為模板,進行擴增操作,選擇引物為腸道通用引物、EV71型特異性引物及柯薩奇A組16型特異性引物,采用SuperScript Ⅳ RT-PCR Kit試劑盒(美國賽默飛世爾科技公司生產)進行RT-PCR擴增,引物序列和反應條件參照《手足口病預防控制指南(2008年版)》[3]。

1.2.3 EV71病毒VP1區核苷酸序列擴增。從2021年手足口病EV71陽性樣本中隨機選取6份樣本進行RNA VP1區擴增操作,引物為(1)(2),擴增片段全長為1 042bp,SuperScript Ⅳ RT-PCR Kit試劑盒擴增反應條件為:50℃下反應35min,94℃下反應5min;95℃下反應15min;95℃下反應30s,50℃下反應25s,72℃下反應70s,共進行32個循環;72℃下反應10min。反應結束后,采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴增產物。隨后將獲得的EV71 VP1區PCR擴增產物委托佛山市瑞因基因科技有限公司進行回收測序。(1)EV71-vp1-F:5,-GCAGCCCAAAAGAACTTCAC-3(nt 2372～nt 2392);(2)EV71-vp1-R:5-AAGTCGCGAGAGCTGTCYRC-3(nt 3434～nt 3454)。

1.2.4 DNA序列測定和分析。采用DNASTAR、Mega 4.0軟件,參比GenBank數據庫中序列,進行VP1片段全部基因序列的氨基酸和核苷酸序列分析及進化分析。

2 結果

2.1 分子流行病學結果

2.1.1 2021年和2022年高明地區各月份手足口病病毒類型分布。2021年和2022年高明地區均以5—7月為手足口病高發時間,2021年5—7月EV71病毒引起的手足口病,占比分別為38.79%(64/165)、42.86%(87/203)、35.80%(63/176),2022年5—7月EV71病毒引起的手足口病,占比分別為40.00%(60/150)、41.97%(81/193)、36.14%(60/166)。EV71病毒引起的手足口病高發時間為5—7月,CA16病毒引起的手足口病高發時間為5—6月,非EV71/CA16(N)腸道病毒引起的手足口病高發時間為6—7月,EV71/CA16共感染引起的手足口病病例數較少。詳見表1、圖1。

表1 2021年和2022年高明地區各月份手足口病病毒類型分布(例)

2.1.2 2021年和2022年高明地區與佛山市其他地區手足口病病毒類型分布。結合佛山市其他4個區手足口病流行病學結果,2021年高明區、禪城區、順德區、南海區、三水區EV71病毒引起的手足口病占比分別為36.41%(292/802)、37.00%(367/992)、34.92%(242/693)、34.35%

(294/856)、36.49%(270/740),2022年高明區、禪城區、順德區、南海區、三水區EV71病毒引起的手足口病占比分別為36.11%(269/745)、38.05%(371/975)、36.48%(255/699)、36.95%(303/820)、35.61%(255/716)。詳見表2、圖2。

表2 2021年和2022年高明地區與佛山市其他地區手足口病病毒類型分布(例)

圖2 2021年(圖左)和2022年(圖右)高明地區與佛山市其他地區手足口病病毒類型分布

2.1.3 2021年和2022年高明地區各年齡段手足口病病毒類型分布。年齡方面,2021年和2022年手足口病均以≤1歲患者為主要發病群體,其中,2021年EV71、CA16、非EV71/CA16(N)、EV71/CA16共感染引起手足口病病例占比分別為36.36%(124/341)、29.62%(101/341)、32.84%(112/341)、1.17%(4/341),2021年EV71、CA16、非EV71/CA16(N)、EV71/CA16共感染引起手足口病病例占比分別為36.28%(115/317)、29.97%(95/317)、33.44%(106/317)、0.32%(1/317)。性別方面,2021年手足口病男女比例和EV71病毒引起的手足口病男女比例分別為2.073∶1和2.140∶1,2022年手足口病男女比例和EV71病毒引起的手足口病男女比例分別為2.066∶1和2.092∶1。詳見表3、圖3。

表3 2021年和2022年高明地區各年齡段手足口病病毒類型分布

圖3 2021年(圖左)和2022年(圖右)高明地區各年齡段手足口病病毒類型分布

2.1.4 病例類型分布。2021年,802例病例中普通病例790例,重癥病例10例,死亡病例2例,其中EV71病毒引起的手足口病的重癥和死亡病例占比分別為1.03%(3/292)和0.34%(1/292)。2022年,745例病例中普通病例738例,重癥病例8例,無死亡病例,其中EV71病毒引起的手足口病的重癥病例占比為0.74%(2/269)。詳見表4。

表4 2021年和2022年高明地區各病例類型手足口病病毒類型分布

2.2 EV71基因VP1編碼區基因同源性分析

圖4 高明地區6株EV71毒株與國內外代表株

2.2.1 高明地區6株毒株與9株EV71代表株VP1片段的氨基酸同源性。本研究從EV71陽性標本中隨機選擇6個樣本進行EV71 VP1基因全長序列擴增,通過序列測定獲得EV71病毒VP1區的全基因序列為891bp,未見核苷酸插入或缺失。6株EV71 VP1高明地區分離株序列與EV71原A、B、C各基因型代表株以及其他地區流行株序列進行比較,核苷酸和氨基酸同源性詳見表5、表6。

表5 2021年高明地區6株毒株與9株EV71代表株VP1片段的核苷酸同源性(%)

表6 2021年高明地區6株毒株與9株EV71代表株VP1片段的氨基酸同源性(%)

2.2.2 高明地區6株毒株EV71 VP1片段之間核苷酸和氨基酸序列同源性。6株EV71在VP1區之間核苷酸和氨基酸同源性分別為97.5%～99.6%和99.6%～100.0%。詳見表7。

表7 高明地區6株毒株EV71 VP1片段之間核苷酸和氨基酸序列同源性(%)

2.2.3 系統進化分析。基于EV71 VP1編碼基因核苷酸序列,以及Genebank數據庫,對高明地區分離出的6株EV71構建親緣進化樹。詳見圖4。

3 討論

本研究結果顯示,EV71和CA16病毒均為高明地區引起手足口病的主要病原體,EV71近2年的病例占比分別為36.41%和36.11%,后者分別為29.55%和29.93%,其中2022年EV71占比雖然較2021年有所降低,但差異不明顯;5—7月為EV71病毒引起手足口病高發時間,相比CA16和非EV71/CA16有更長的流行期;≤1歲患者為手足口病高發群體,2021年和2022年EV71病例占比分別為36.36%和36.28%,遠高于其他年齡,且近2年無明顯變化;男性為手足口病高發群體,2021年和2022年EV71病例男女比例分別為2.140∶1和2.092∶1。以上結果均充分表明,EV71依然是高明地區引起手足口病的主要病原體。本研究另一項結果顯示,非EV71/CA16的腸道病毒在手足口病致病方面也具有較重地位,與林峰等[4]的研究結果一致。本研究對近2年的手足口病病例中,重癥病例和死亡病例僅為17例和2例,而導致這一現象的原因,筆者認為,一方面可能是由于廣東省區域內手足口病的EV71流行毒力株較弱,另一方面可能與近年來廣東省對手足口病預防的重視程度逐年上升,并有EV71疫苗上市有關。但對于EV71與CA16對患者疾病嚴重程度的影響,本研究數據尚未見到顯著差異,與既往研究[5]中指出EV71相比CA16更容易引起重癥和死亡的觀點相悖,可能與本研究納入樣本數量較少有關。基因同源性分析結果顯示,基于高明地區樣本中分離出的6株EV71毒株構建的親緣進化樹,進化樹可見高明地區EV71毒株與C4亞型代表處于同一分支,說明高明地區EV71毒株屬于C4型。

EV71病毒是2021—2022年高明地區手足口病流行的主要病原體,但是近年來由非EV71/CA16病毒引起的手足口病比例也有上漲趨勢,因此,未來需要對手足口病的各類型病原體的流行趨勢均需要進行謹慎研究分析。