肺栓塞相關生物標志物研究進展*

王 倩,喬瑩利 綜述,吳 凡 審校

阜外華中心血管病醫院/河南省人民醫院醫學檢驗科, 河南鄭州 450003

肺栓塞(PE)是一種常見的血栓性疾病,是靜脈血栓栓塞癥(VTE)最嚴重的臨床表現之一,也是心血管疾病死亡的主要原因之一,包括肺血栓栓塞(PTE)、脂肪栓塞綜合征、羊水栓塞、空氣栓塞、腫瘤栓塞等[1],其中,PTE是最常見的PE類型,以肺循環和呼吸功能障礙為主要臨床表現和病理生理特征。PE分為急性肺栓塞(APE)或慢性血栓栓塞性肺動脈高壓(CTEPH)。APE患者可在癥狀出現后的幾個小時內死亡,然而,由于大多數PE是無癥狀或非特異性的,臨床誤診和漏診率較高,一旦確診,患者需立即接受有效治療[2]。因此,對PE患者進行快速準確診斷和及時風險分層是有效治療的關鍵。大多數PE的常規生物標志物是從凝血-纖溶級聯反應、免疫反應、組織和器官中篩選出來的。近年來,越來越多用于PE診斷的新型生物標志物正在通過高分辨率液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)或數據獨立采集質譜(DIA-MS)進行篩選。本文綜述了PE生物標志物研究的最新進展,特別是通過新技術和新的檢測方法篩選的生物標志物。

1 心臟生物標志物

心肌肌鈣蛋白是診斷急性冠狀動脈綜合征的一種高靈敏度生物標志物,在許多急性和慢性疾病中具有較高的評估預后價值。如果肌鈣蛋白水平在APE期處于正常范圍,則表明患者預后良好[3]。近年來,許多臨床研究表明,B型利鈉肽(BNP)水平在APE期會升高,心肌肌鈣蛋白和BNP在APE的風險分層和預后評估中具有重要的應用價值[4]。在PE的發生、發展過程中,肺動脈壓和右心室壁張力的增加加快了BNP的釋放,導致血液中BNP[活性BNP和非活性N末端腦鈉肽前體(NT-proBNP)]水平不同程度增加[4]。有研究發現,BNP和NT-proBNP與APE患者右心室功能障礙的診斷相關,是患者病死率的重要預測因素[5]。因此,BNP和NT-proBNP在預測APE患者預后方面具有較高的應用價值,同時檢測血清肌鈣蛋白T(TnT)和BNP可以提高PE患者風險分層的準確率和預后價值[6]。

此外,心臟型脂肪酸結合蛋白(h-FABP)是一種存在于心肌細胞中的可溶性蛋白,參與細胞脂肪酸的運輸和代謝,在正常情況下,血液中幾乎檢測不到h-FABP。然而,當心肌細胞受損時,h-FABP被迅速釋放進入血液,但它并不會與其他脂肪酸結合蛋白(FABP)發生交叉反應,因此h-FABP是心肌損傷的一個特異性標志物[7]。在PE確診的患者中,BNP、NT-proBNP和h-FABP可以一起用于風險分層,此外,部分PE患者血清肌酸激酶和血清肌紅蛋白會升高[8]。PE也與抗心磷脂抗體免疫球蛋白(Ig)G和IgA的陽性率有關[9]。總之,BNP、NT-proBNP和h-FABP這3種心臟生物標志物與PE的發生、發展有關。

2 炎癥標志物

近年來,有研究發現中性粒細胞-淋巴細胞比率、血小板-淋巴細胞比率和淋巴細胞-單核細胞比率是與PE密切相關的新型炎癥標志物[10]。其中,中性粒細胞-淋巴細胞比率不僅可以獨立預測APE患者的住院病死率,還可以用于PE患者的臨床風險分層。紅細胞體積分布寬度(RDW)的增加也被認為是炎癥前狀態的生化標志。XING等[11]的一項Meta分析表明,RDW是評估PE患者預后的指標。

血清C-反應蛋白(CRP)是當身體受到各種炎癥因子刺激時由肝臟合成和分泌的蛋白質,其水平的快速增加可準確反映非特異性炎癥。比較不同嚴重程度PE患者溶栓前后的血清高敏CRP(hs-CRP)水平,發現hsCRP水平與PE的嚴重程度相關,尤其是大面積栓塞患者[12]。因此,hs-CRP可以作為PE風險分層和預后評估的監測生物標志物。高靈敏度心肌肌鈣蛋白T(hs-cTnT)、NT-proBNP和hs-CRP聯合應用可進一步提高PE患者的風險分層水平。

白細胞介素(IL)家族是一種重要的急性期炎癥反應調節因子,包括促炎性細胞因子(如IL-1β、IL-6和IL-8)和抗炎細胞因子(如IL-4、IL-10和IL-13),前者導致組織損傷并刺激次級炎癥介質的釋放;后者可以平衡前者的損害效應并抑制其產生。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是由脂多糖誘導的活化單核細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和內皮細胞產生的內源性細胞因子,它是急性肺損傷的早期促炎性細胞因子。WANG等[13]研究發現PE患者血漿IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α水平顯著高于健康人群,表明炎癥在PE的發生過程中起重要作用,TNF-α是預測PE肺損傷的敏感指標。IL-1β、IL-4、IL-6和hs-CRP可用于監測PE的發生、指導治療和監測療效。此外,由于快速釋放動力學,血漿和肽素能有效評估急性心血管疾病的預后,其水平可以反映PE的嚴重程度[14]。GOK等[15]研究表明,全身免疫炎癥指數是一個綜合中性粒細胞、血小板和淋巴細胞的參數,是APE的獨立預測因子,具有高靈敏度和特異度,優于其他基于炎癥的指標,然而,仍需要進行前瞻性多中心臨床試驗來驗證這一發現。

總之,炎癥標志物不僅參與PE的發病機制,而且有助于早期疾病評估、風險分層、治療指導和療效監測,但由于易受到其他因素的影響,需要結合臨床癥狀和其他相關檢查方法進行綜合分析。

3 血管生物標志物

3.1靜態生物標志物 在凝血-纖溶級聯反應中,血細胞計數分析的參數(如白細胞和血小板計數升高)已被用于PE的風險預測[16]。D-二聚體是纖維蛋白形成和降解的生物標志物,APE患者的PE發生率與D-二聚體直接相關,與纖維蛋白原水平成反比。在臨床上VTE發生概率較低的患者中,通常使用正常范圍的D-二聚體來排除深靜脈血栓(DVT)和PE。

D-二聚體水平升高與PE的發生和病死率的風險增加獨立相關,D-二聚體水平升高與不良結局的預后關系越來越受到重視。然而,使用傳統的診斷標準在特殊患者群體(如老年人、妊娠期女性、惡性腫瘤和腎功能不全者)中并不適用,在這種情況下,使用調整后的D-二聚體最佳截斷值優于固定最佳截斷值。目前,最常用的臨床決策規則為風險評分,如肺栓塞嚴重程度指數(PESI)及PESI簡化版(sPESI)評分,將D-二聚體添加到sPESI評分中可以提高其評估預后的能力,多變量風險模型可作為評估老年PE患者預后的最佳方法[17]。此外,可溶性P-選擇素是一種細胞黏附分子,是血小板和內皮活化的生物標志物,有研究證明可溶性P-選擇素是預測PE的生物標志物[18]。

血液中凝血因子的畸變也會導致PE的發生。截至目前,PE患者血液中高度公認的凝血相關因素主要包括凝血因子Ⅱ(FⅡ)、因子Ⅳ(FⅣ)、因子Ⅶ(FⅦ)、因子Ⅷ(FⅧ)、因子V Leiden(FVL)、因子Ⅹ(FⅩ)、因子(F)、凝血酶原片段1+2、抗凝血酶Ⅲ、組織因子、蛋白C和蛋白S。 DZUDOVIC等[19]提出,與疑似但排除PE的患者相比,PE患者的凝血FA亞單位抗原水平更低。有研究顯示,凝血FⅡ活性和凝血FⅩ活性可作為中國PE患者華法林治療的標志物[20]。凝血FⅣ也稱為血清游離鈣(SIC),可能是癥狀性PE的指標。嚴重新型冠狀病毒感染(COVID-19)患者的凝血FV水平升高與DVT和PE相關[21]。凝血酶-抗凝血酶Ⅲ復合物(TAT)是凝血系統激活的標志物,纖溶酶-α2-纖溶酶抑制劑復合物(PIC)指示纖溶系統的激活,血栓調節蛋白(TM)可以監測內皮細胞的功能,組織纖溶酶原激活物-抑制劑復合物(t-PAIC)是纖溶標志物,這些是靜脈血栓形成過程中的重要標志物,血栓形成前其水平可顯著升高[22]。ZHOU等[23]首次發現TAT、PIC、TM和t-PAIC結合D-二聚體和纖維蛋白降解產物(FDP)在惡性腫瘤患者VTE診斷中優于單一標志物的應用效果。

3.2動態生物標志物 除了測量某些生物標志物外,在整個過程中檢測患者的凝血特征也可以用作PE的診斷。現有的活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶原時間(PT)和凝血酶時間(TT)是廣泛可用的方法,周轉時間快,但靈敏度和特異度低。APTT測量FⅡ、FⅤ和FⅧ/FⅫ的活性,任何影響這些凝血因子的抗凝劑都可以延長APTT;PT測量FⅠ、FⅡ、FⅤ、FⅦ和FⅩ的活性,此外,廣泛用于監測華法林治療的國際標準化比值(INR)代表了PT的標準化,通過簡單計算用于調整凝血活酶制劑的不同靈敏度;TT測量血漿中凝血酶的活性。雖然上述方法反映了凝血酶初始生成的時間,但未能反映隨后的凝血活性。

粘彈性止血分析(VHA)可以更好地反映基于細胞的止血模型,能反映體內止血情況,例如血栓彈性成像(TEG)和旋轉血栓彈性測量(ROTEM)。TEG實時提供關于纖維蛋白形成、血小板活化和凝塊收縮的全局信息,由于這是一種依賴于操作人員的技術,測試過程中任何階段的錯誤都可能導致對血栓彈性圖的誤解,從而導致患者治療不善、血液制品浪費及醫院和患者的經濟負擔增加。ROTEM是由血栓彈性測量的設備改進和技術升級形成,其與TEG的原理相似[24]。

4 核糖核酸(RNAs)

4.1微小RNA(miRNA) miRNA是一類長度為21～25個核糖核苷酸的非編碼內源性單鏈RNA。miRNA的表達譜具有高特異度,在某些疾病中,尤其是血栓形成和腫瘤中,miRNA的表達水平發生顯著變化。血管內皮細胞中血管生成相關miRNA(angiomiRs)在介導和調節血管生成的過程中起主要作用,與血管疾病的變化有關,包括miRNA(miR)-210、miR-221、miR-22、miR-126-3p、miR-92a和miR-132及一些其他新發現的標志物,如miR-223、miR-145、miR-582、miR-195、miR-150、miR-21和miR-424等[25]。LIU等[26]研究表明,PE患者血漿中的miR-134水平明顯高于非PE患者。PENG等[27]研究發現,循環miR-1233對診斷早期APE具有較高靈敏度和特異度。總之,miRNA可以作為一種有效診斷PE的生物標志物。

4.2長鏈非編碼RNA(lncRNA) lncRNA是一種長度超過200個核苷酸且不具有蛋白質編碼能力的非編碼RNA。lncRNA的失調與神經退行性疾病、呼吸系統疾病和心血管疾病有關。有研究證明,許多肺纖維化患者的lncRNA表達水平顯著改變[28]。通過微陣列分析發現185個lncRNA的差異表達與慢性血栓栓塞性肺動脈高壓(CTEPH)有關,其中NR_036693、NR_027783、NR_033766和NR_001284的表達水平顯著改變[29]。有研究建立了CTEPH相關miRNA基因lncRNA網絡,用于在CTEPH患者中尋找核心基因和相關miRNA和lncRNA,結果顯示lncRNA與肺動脈高壓密切相關[30]。

4.3環狀RNA(circRNA) circRNA為共價閉合的連續環,是由反向剪接形成的具有共價連接的3′-和5′-末端的RNA。作為miRNA海綿的circRNA被認為可以調節miRNA靶基因的表達,從而促進競爭性內源性RNA反應。MIAO等[31]鑒定了351個差異表達的circRNAs,其中hsa_circ_0002062和hsa_circ_0022342可能是發生CTEPH的關鍵circRNA。MIAO等[32]的另外一項研究顯示,一些新的circRNAs,如hsa_circ_0016070和hsa_carc_0046159參與了肺動脈高壓的發展,mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA共同形成了一個與PE相關的反應。

5 蛋白質組學

由于PE的發病機制尚不清楚,通過蛋白質組學技術獲得的生物標志物對PE的早期診斷和治療效果不佳。蛋白質組學技術在PE領域被認為是一種有潛力的方法。蛋白質組學可以檢測大規模樣品的蛋白質表達水平、翻譯后修飾和蛋白質-蛋白質相互作用,從而打破了傳統單一蛋白質研究的局限性。目前,已廣泛開展了血栓、血漿或病變組織的蛋白質組學研究,并獲得了一些高性能的診斷指標[33]。蛋白質組學的3個主要技術基礎是質譜、抗體微陣列和數據庫/生物信息學。

5.1質譜 質譜在蛋白質組學檢測中的應用主要采用2種方法:自上而下(即蛋白質水平)和自下而上(即肽水平)。目前采用自下而上的檢測方法更多,即在檢測前將蛋白質片段消化成小肽。使用高性能液相色譜-質譜聯用儀(LC-MS)的自下而上蛋白質組學已經發展成為一種強大的技術,能夠在生物醫學研究、臨床診斷和生物技術的各個領域取得快速進展[34]。現在,非標記定量技術(LFQ)廣泛用于蛋白質組的定量檢測,分為2種數據采集模式,即數據依賴性采集MS(DDA-MS)和數據非依賴性系統(DIA-MS)。DDA是一種傳統的LFQ檢測,而DIA在DDA的基礎上得到了很大的改進,廣泛用于疾病標志物的大樣本篩選研究。對于DIA-MS,儀器和信息學的進一步創新將是提高靈敏度和吞吐量的關鍵[35]。

5.2抗體微陣列 抗體微陣列可以使用微陣列中高密度的抗體集合來靶向樣品中的目標蛋白,從而檢測分子水平上的相對蛋白表達譜。低豐度蛋白質的信息容易在質譜檢測中丟失,識別小分子蛋白質和寡肽的能力不足,在這種情況下,抗體微陣列技術可以以更高的靈敏度和特異度檢測低分子量和低豐度蛋白質,這彌補了質譜的技術缺陷[36]。

5.3新生物標志物的獲取方法 近年來,PE生物標志物研究主要集中在使用質譜技術分析血液樣本,如結合基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)的二維凝膠電泳,用于血液樣品的差異蛋白質組學分析和酶聯免疫吸附試驗或免疫印跡法。WATTS等[37]通過一維凝膠電泳和LC-MS/MS發現PE患者纖連蛋白前體、纖維蛋白原α、β和γ、血管性血友病因子和幾種巨球蛋白水平顯著增加,而結合珠蛋白前體蛋白減少。用于PE組和對照組血清蛋白臨床篩選的二維凝膠電泳和MALDI-TOF-MS分析的比較表明,結合珠蛋白、血紅素、α2-巨球蛋白和Igα1-鏈C區可能是PE的潛在診斷生物標志物[38]。然而,這種技術在很大程度上受限于凝膠電泳的分辨率和靈敏度,并且很容易丟失低豐度蛋白質的數據。因此,最近流行使用結合DIA-MS和抗體微陣列的深度蛋白質組學檢測方法來全面分析和比較PE確診患者和健康人員的血漿蛋白質組,以發現新的、可靠的臨床診斷標志物。HAN等[39]基于DIA-MS和抗體陣列蛋白質組學技術的一項研究發現,包括SAA1、S100A8、TNC、GSN和HRG在內的5種蛋白質水平在PE和/或高危PE中有顯著變化,可作為診斷PE和風險分層的潛在血漿生物標志物。

6 新興的生物標志物

目前高凝性疾病的實驗室檢查主要集中在激活的凝血級聯反應和纖溶系統中的生物標志物含量,然而直接檢測血液中的某些蛋白酶活性仍然具有一定的難度。有研究報道了一種基于蛋白水解的檢測方法,該方法利用可被人凝血酶原復合物(FⅡa)或纖溶酶激活的工程化原酶來檢測這2種血液因子的活性[40],該方法測定基于L-苯丙氨酸氧化酶工程酶原(proPAO,EC 1.13.12.9)的蛋白水解激活,其中在proPAO的抑制域和活性域之間設計了特異性血液蛋白酶切割位點,當與Trinder反應偶聯時,導致顯色產物的增加,可準確測定血液中FⅡa或纖溶酶的生理活性和總活性,有助于監測抗凝藥物的有效性和安全性,也有助于臨床快速篩查止血功能障礙和PE。

7 討 論

目前,診斷血栓的主要臨床檢查方法包括影像學檢查、實驗室檢查和基于病例信息和相關檢查的綜合評估量表。常用的臨床評估量表包括加拿大威爾斯評分和修訂后的日內瓦評分,這兩個評分標準簡單易懂,且所需的臨床數據容易獲得,因此適合在基層醫院推廣。PE不僅在臨床表現上沒有特異性,常規檢查如胸部X線片、心電圖、血氣分析和超聲心動圖也缺乏特異性。多層螺旋CT、放射性核素肺通氣灌注掃描和肺血管造影通常可以診斷PE,但由于成本較高,且肺血管造影術具有創傷性,所以許多基層醫院尚不具備檢查條件,因此,有必要結合生物標志物和影像學檢查,以實現更好的診斷和治療。

迄今為止,PE最常用的生物標志物包括D-二聚體、BNP和肌鈣蛋白,主要用于輔助診斷。此外,某些炎癥指標,如生長分化因子15、中性粒細胞/淋巴細胞比率、CRP和RDW,也有助于PE的預后評估。有一項研究發現,脂肪酸結合蛋白可用于PE的風險分層和預后評估[7]。

然而,現有傳統生物標志物的特異度和靈敏度仍需進一步研究證實。近年來,越來越多的新興標志物被發現,如miRNA等,對于診斷PE有較高的靈敏度和特異度。蛋白質組學技術有助于篩選PE患者血液樣本中的生物標志物,如結合MALDI-TOF的二維凝膠電泳和結合抗體微陣列的DIA-MS深層蛋白質組學,可以對不同風險分層的PE患者和健康對照人群的血漿蛋白質組進行全面分析和比較。此外,建立新方法直接檢測血液中現有生物標志物(如凝血FⅡa和血漿)的活性也很有價值。這些新方法和技術可被用于發現新的、高特異度的臨床診斷和風險分層生物標志物,并在細胞和分子水平闡明PE的發病機制,從而為PE治療和新藥開發提供新的方法和思路。目前,上述新興的標志物臨床試驗較少且不是實驗室常規檢查項目,還需大規模臨床實驗進一步驗證相關結果。總之,影像學、傳統生物標志物和新興生物標志物的聯合使用有助于更好地診斷和治療PE。