煤微生物甲烷化的石墨烯強化機制

周藝璇 ， 蘇現波,2,3,4 ， 趙偉仲 ， 王 乾,2 ， 于世耀 ， 汪露飛

(1.河南理工大學 資源環境學院, 河南 焦作 454000；2.河南理工大學 非常規天然氣研究院, 河南 焦作 454000；3.中國地質大學 資源學院, 湖北 武漢 430074；4.中原經濟區煤層(頁巖) 氣協同創新中心, 河南 焦作 454000)

在綠色高效煤層氣增產技術研發領域，相繼提出了微生物增產煤層氣(Microbially Enhanced Coalbed Methane, MECBM)[1]和煤層氣生物工程(Coalbed Gas Bioengineering, CGB)的理念[2]。其中，煤層氣生物工程是將營養液或經過選育、馴化、改良的菌種注入地下煤層，通過厭氧發酵(Anaerobic Digestion, AD)把煤的部分有機組分轉化為甲烷，從而實現微生物強化煤層氣產出的一種特殊發酵工程[3-5]。煤層氣生物工程作為一種新的煤層氣增產與碳減排技術，有著潛在的生命力。由于煤的分子結構復雜，其厭氧發酵產甲烷需要不同代謝功能微生物的協同作用[6-7]。近年來關于強化煤制生物甲烷產出的研究主要集中在3 個方面：煤層(水)本源微生物的多樣性研究[8-9]；通過發酵系統參數優化、生物馴化、生物刺激和生物強化等方法來提高生物甲烷的產出[10-14]；通過生物化學手段提高煤在厭氧發酵系統中的生物可利用度[15-16]?？梢姶龠M發酵系統中微生物的代謝活性是提高生物甲烷產氣量的有效途徑。

向發酵系統中添加導電材料不僅可以減少溫度、pH 等環境條件的變化對微生物活性的影響，還可以有效促進直接種間電子傳遞(Direct Interspecies Electron Transfer, DIET)提高甲烷產率，在強化有機物厭氧降解方面潛力巨大。2012 年，KATO 等[17]在稻田土壤富集的菌種的厭氧發酵系統中添加導電材料磁鐵礦后，發現Geobacter和Methanosaeta被富集，并且甲烷產氣量也得到了顯著的提升，證明了添加導電材料可以刺激DIET 過程產生CH4。導電性能優秀的碳材料，如生物炭、石墨、石墨烯、碳纖維布、碳納米管等已經被廣泛用于促進DIET 機制以增強厭氧發酵過程中甲烷產氣量[18-22]。人們通過向有機廢物、動物糞便和餐廚垃圾等厭氧發酵系統中添加不同性質的導電碳材料，發現可有效縮短厭氧發酵的延滯期，強化厭氧發酵效率，使得甲烷產氣量得到了明顯的提升[23-26]。將生物炭加入以污泥和餐廚垃圾為底物的厭氧發酵體系中，不僅會使整個系統的pH 緩沖能力顯著上升，還能夠減緩厭氧消化過程中的氨抑制作用，促進產甲烷過程，提升甲烷產率[27-28]。石墨烯作為一種由單層碳原子緊密排列形成的2D 蜂巢晶格結構的平面薄膜，具有優良的電子、熱力學導電性能和較強的吸附性能，這種新興材料因其獨特的物理及電化學性質引起了世界范圍內的廣泛關注[29]。在添加石墨烯的條件下，以污泥為底物的厭氧發酵體系的產甲烷效率顯著增強，并且增強了乙酸營養型產甲烷微生物的活性[30]。在連續流污泥厭氧消化系統中添加石墨烯能夠在提高甲烷產氣量的同時原位去除CO2，最終可使沼氣中甲烷體積分數提高到95%，顯著提升了厭氧消化系統產氣效果[31]。

導電碳材料介導的厭氧微生物種間互營關系的強化為進一步提高厭氧發酵效果開辟了一條新的思路，目前的研究大多運用導電材料強化一些簡單底物的降解，然而對于煤這種復雜的有機物降解過程中的機制尚不清楚，對發酵系統內功能菌群的分析以及相關群落結構和機理分析的研究鮮有報道。筆者以長焰煤為研究對象，石墨烯作為導電材料，通過對比分析添加導電材料的發酵系統和傳統厭氧發酵系統在產甲烷過程中氣相、固相、液相、菌群群落結構和產甲烷代謝路徑的差異性，揭示導電材料石墨烯對煤層生物甲烷產出的強化機制，為煤層氣增產提供新途徑。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

選取河南省義馬千秋礦長焰煤(CYM)作為實驗樣品(表1)。實驗所用石墨烯購于中科雷鳴(北京)科技有限公司，相關參數見表2。煤樣在105 ℃的烘箱中放置12 h，隨后對煤塊進行研磨和篩分，獲得0.15～0.18 mm 煤樣。厭氧發酵產氣菌源來源于實驗室長期馴化的菌群。

表1 煤樣的工業分析和元素分析Table 1 Proximate analysis and ultimate analysis of coal samples %

表2 石墨烯基本特性參數Table 2 Characteristic parameters of graphene

1.2 實驗設計

(1)石墨烯最佳添加量篩選：在5 個250 mL 發酵瓶中分別加入25 g 長焰煤，其中4 個分別加入0.2、0.4、0.6、0.8 g/L 的石墨烯作為實驗組，剩余1 個不加石墨烯的作為對照組；同時倒入富集好的產甲烷菌液250 mL，充入氬氣形成無氧環境，密封后放入25 ℃恒溫培養箱，每隔4 d 記錄產氣數據，以甲烷累計產氣量作為評價標準，確定石墨烯的最優添加量。

(2)確定石墨烯最佳添加量后，以此進行下一步實驗。采用2 個1 000 mL 錐形瓶作為厭氧發酵容器，分別加入100 g 長焰煤，其中1 個加入石墨烯作為實驗組，另一個作為對照組，接種富集6 d 的菌液，充入氬氣形成厭氧環境，密封后放入25 ℃恒溫培養箱，每隔4 d 記錄產氣數據。

(3)每隔4 d 對各個發酵系統的發酵液分別取液100 mL，對所取菌液進行液相產物分析與高通量測序。

1.3 分析檢測方法

1.3.1 發酵系統氣體分析

本研究厭氧發酵產生的氣體用GC-4000A 氣相色譜儀進行分析檢測，手動進樣，進樣量為1 mL，用注射器抽取氣袋中收集的氣體測定產氣量。

1.3.2 關鍵液相產物定量分析

標品甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、甲醇、乙醇、十五烷、十六烷、十八烷購于北京中科質檢生物技術有限公司。配置不同質量濃度(mg/L)標品混合溶液，按照液液萃取方法用二氯甲烷萃取濃縮后進行GC-MS(氣相色譜質譜聯用儀7890-5977A)測定，并建立標準變化曲線，然后再次運用同樣方法對發酵液處理測定并求出各物質的質量濃度。

1.3.3 發酵系統煤樣XPS 分析

將發酵結束后剩余發酵液倒出，用篩子過濾出煤樣，用蒸餾水反復沖洗煤樣去除煤樣上的發酵液，將處理好的煤樣放入80 ℃的烘干箱干燥24 h，取適量樣品用X 射線光電子能譜儀(Thermo Scientific Escalab 250Xi 型)進行XPS 測試。

1.3.4 高通量測序

本實驗進行的高通量測序均交付上海美吉生物醫藥科技有限公司完成，具體方法見文獻[32]。取液時將厭氧發酵瓶放在厭氧工作站內，搖勻菌液，抽取50 mL 菌液于離心管中，用封口膜密封、編號，放入干冰箱中，進行低溫冷凍郵寄。微生物功能通過PICRUSt 軟件進行預測，基于KEGG 甲烷代謝通路(Map: 00680)，挑選出預測豐度大于100 的相關物質的代謝基因，對其降解及甲烷生成途徑進行評估。

2 結果與討論

2.1 實驗結果

2.1.1 石墨烯添加量優選

添加不同質量石墨烯的發酵系統中甲烷的階段產氣量與累計產氣量(圖1、表3)表明當添加0.4 g/L石墨烯時累計甲烷產氣量最高，為4.72 mL/g，比對照組的3.89 mL/g 提高了21.3%，并且煤的階段產氣量峰值時間(16 d)相比于對照組(20 d)提前了4 d；當石墨烯添加量增加到0.6 g/L 時，相比于對照組甲烷累計產氣量提高但和添加0.4 g/L 石墨烯的發酵系統相比甲烷累計產氣量開始下降，當石墨烯添加量繼續增加到0.8 g/L 時，甲烷累計產氣量為3.63 mL/g相比于對照組下降，這可能是高質量濃度的石墨烯會沉降到微生物表面抑制了微生物的生長及繁殖并且石墨烯鋒利邊緣可將細菌的細胞膜刺破，導致細胞失活[33-34]。因此，選取0.4 g/L 石墨烯作為后續導電材料促進煤厭氧發酵實驗的添加量。

圖1 不同添加量石墨烯發酵系統中甲烷和二氧化碳階段產氣量和累計產氣量Fig.1 Stage gas production and cumulative gas production of methane and carbon dioxide in graphene digestion system with different additive levels

表3 不同石墨烯添加量發酵系統中甲烷階段產氣量和累計產氣量Table 3 Stage gas production and cumulative gas production of methane in digestion systems with different graphene additions

2.1.2 石墨烯對厭氧發酵系統甲烷產氣量的影響

確定石墨烯最佳添加量為0.4 g/L 后，據此構建一個厭氧發酵系統作為實驗組和一個不加入石墨烯的作為對照組。在整個發酵過程中，對照組的階段產氣量在第20 天時達到峰值，為1.50 mL/g；而添加石墨烯的系統在第16 天達到產氣峰值，為1.81 mL/g，比對照組提前了4 d，而且峰值產氣量也提高了20.67%(圖2(a))。對照組和添加石墨烯組中甲烷累計產氣量分別為4.48 mL/g 和5.35 mL/g(圖2(b))，添加石墨烯使得發酵系統甲烷產氣量提升19.42%(表4)。產甲烷動力學分析(修正的Gompertz 模型)表明添加石墨烯的系統中模擬最高甲烷日產氣量為0.35 mL/g，比對照組(0.31 mL/g)提高了12.9%(表5、圖3)。同時，添加石墨烯和對照組中的產甲烷遲滯期(λ)分別為7.18 d和8.20 d，說明石墨烯的添加增強了菌群對底物的適應能力調高了產甲烷效能。

圖2 添加石墨烯和對照組厭氧發酵系統中甲烷和二氧化碳階段產氣量和累計產氣量Fig.2 Stage gas production and cumulative gas production of methane and carbon dioxide in the anaerobic digestion system with graphene and the control group

圖3 添加石墨烯和對照組厭氧發酵系統中累積產甲烷曲線擬合Fig.3 Curves fitting of cumulative methane production in the graphene and control anaerobic digestion systems

表4 添加石墨烯和對照組厭氧發酵系統中甲烷階段產氣量和累計產氣量Table 4 Stage gas production and cumulative gas production of methane in the anaerobic digestion system with graphene and the control group

表5 添加石墨烯和對照組厭氧發酵系統中累積產甲烷曲線的擬合結果Table 5 Fitting results of cumulative methane production curves in the anaerobic digestion system with graphene and the control group

2.1.3 厭氧發酵前后煤表面碳元素含量及化學賦存狀態變化特征

微生物通常以附著方式對煤固體進行厭氧降解，這一過程必定會使得煤表面結構發生一定變化。由原煤、對照組與添加石墨烯的系統經過厭氧發酵殘余煤的C1s 譜圖及其分峰擬合(圖4)可以看出，芳香單元及其取代烷烴(C—C、C—H)在煤樣表面都占有絕對優勢，不同條件下經厭氧發酵產氣殘煤表面的芳香單元及其取代烷烴(C—C、C—H)相對于原煤均增加，相對含量為原煤 < 對照組 < 石墨烯(表6)。煤厭氧發酵過程中，鍵能相對較低的非規則部分從煤結構中脫落進入發酵液，從而使含氧有機碳(C—O、C=O、COO—)的總相對含量下降，導致產氣殘煤表面芳香單元及其取代烷烴(C—C、C—H)相對含量增加。其中添加石墨烯的厭氧發酵系統產氣殘煤表面的羰基碳(C=O)和羧基碳(COO—)相對于對照組明顯減少，分別下降了42.8%和49.5%。

圖4 煤樣C1s 窄掃譜圖分峰擬合Fig.4 Peak fitting of coal sample C1s narrow sweep spectrum

表6 煤樣C1s 擬合結果Table 6 Peak fitting results of C1s spectrogram from coals

2.1.4 石墨烯對厭氧發酵系統中關鍵液相物質的影響

由厭氧發酵系統產氣過程中酸類(圖5(a))、醇類(圖5(b))和烷烴類(圖5(c))的變化可知，在對照組中，丁酸大量生成的時間在第12 天左右，呈先升高后降低的變化趨勢，直至產氣結束；而添加石墨烯的系統大量生成的時間提前了6 d，從前期大量生成至產氣結束一直在降低，且下降速率高于對照組。對于甲酸、乙酸和丙酸，在對照組中呈先升高后降低又升高的變化趨勢；添加石墨烯的系統則先降低后升高(圖5(a))。在整個產氣過程中兩組發酵系統中的烷烴類物質均呈先降低后升高的變化趨勢，第6 天左右烷烴類大量生成且石墨烯組高于對照組(圖5(c))。兩組發酵系統中的醇類在整個產氣過程中一直降低，在產氣高峰期之前下降速率較快，高峰期之后下降速率減緩(圖5(b)、表7)。石墨烯的添加使得甲醇和乙醇在整個產氣過程中利用率均高于對照組。

圖5 添加石墨烯和對照組發酵系統中液相產物的定量變化趨勢Fig.5 Trends of liquid phase products in the digestion system with graphene and the control group

表7 添加石墨烯和對照組發酵系統中液相產物的標準定量(質量濃度)Table 7 Standard quantifications of liquid phase products in the digestion system with graphene addition and control mg/L

2.1.5 石墨烯對厭氧發酵系統中微生物群落結構的影響

整個厭氧發酵過程中，分別對對照組和添加石墨烯的系統發酵前期(對照組-1，石墨烯-1)、產氣高峰期(對照組-2，石墨烯-2)和產氣末期(對照組-3，石墨烯-3)的菌群進行分析可知，在細菌群落結構中，添加石墨烯后各個時期功能菌屬的豐度和多樣性明顯高于對照組(圖6(a))，石墨烯的添加有效刺激了各個時期菌群的活性。對照組和添加石墨烯的系統各個時期均主要以Paraclostridium為主，添加石墨烯的系統發酵前期、產氣高峰期和產氣末期Geobacter的豐度均高于對照組，并且該菌屬在石墨烯-2(15.6%)豐度最高，比對照組-2(7.0%)提高了122.9%；Anaerovorax和Sedimentibacter均在兩組產氣高峰期豐度最高，且添加石墨烯組高于對照組。Sphaerochaeta作為煤大分子降解中的主要功能菌屬在對照組和添加石墨烯的系統中產氣初期豐度最高，添加石墨烯組仍高于對照組(圖7(a))。在古菌群落結構中，對照組和添加石墨烯的系統各個時期均主要以參與多種代謝途徑的Methanosarcina和氫營養型的Methanoculleus為主，添加石墨烯后Methanosarcina豐度提高，且各個時期該菌屬豐度均高于對照組(圖7(b))。添加石墨烯后，各個時期菌屬的豐度高于對照組，但在產氣高峰期(石墨烯-2，21.5%)發酵系統菌群多樣性低于對照組(對照組-2，22.6%)(圖6(b))。

圖6 添加石墨烯和對照組發酵系統中細菌和古菌多樣性與豐度Fig.6 Diversity and abundance of bacteria and archaea in the digestion system with graphene and the control group

圖7 添加石墨烯和對照組發酵系統中細菌和古菌群落結構Fig.7 Community structure of bacteria and archaea in the digestion system with graphene and the control group

2.1.6 產甲烷代謝路徑分析

煤中有機質被微生物降解利用需經過多種菌群協同作用，煤中的大分子物質向小分子的轉化的水解階段尤為重要。產酸菌的酸化途徑主要包括糖酵解、單糖代謝、氨基酸代謝和丙酮酸代謝。添加石墨烯后參與糖酵解(Ko00010)、氨基酸代謝(Ko01230)和丙酮酸代謝(Ko00620)的基因豐度分別增加了42.1%、24.9%和27.1%；參與糖酵解的2-脫氫-3-脫氧葡萄糖酸醛縮酶，與氨基酸代謝有關的氨基酸還原酶和轉氨酶，以及丙酮酸代謝相關的鐵氧還蛋白氧化還原酶、乙酸激酶和磷酸轉乙酰酶與對照組相比顯著增強，使得代謝酸類等物質的菌群(Geobacter、Anaerovorax)豐度顯著升高。

在產甲烷階段，依據底物類型的不同可以將該過程分為氫營養型、乙酸營養型和甲基營養型3 類。在乙酸營養型產甲烷路徑中，添加石墨烯的系統中參與乙酸轉化的乙酸激酶(K00925, EC: 2.7.2.1)、乙酸輔酶A 連接酶(K00193, EC: 6.2.1.1)、磷酸乙酰轉移酶(K00625, EC: 2.3.1.8)、乙酰輔酶A 脫羰基酶/合成酶β 亞 基(K14138, EC: 2.3.1.169)和γδ 亞 基(K00194,EC: 2.1.1.245)相對豐度都顯著高于對照組(表8)，其中乙酰輔酶A 脫羰基酶/合成酶β 亞基和γδ 亞基作為乙酸合成途徑中的關鍵酶，添加石墨烯后分別增加了233.54%和3.32%(圖8)。

圖8 添加石墨烯和對照組厭氧發酵系統甲烷代謝路徑Fig.8 Methane metabolism pathway in the anaerobic digestion system with graphene and control group

表8 三種甲烷生成途徑相關酶基因及其相對豐度Table 8 Genes of enzymes associated with three methanogenesis pathways and their relative abundance

2.2 分析與討論

2.2.1 厭氧發酵系統中生物甲烷的生成機制

在厭氧發酵的4 d 內開始有生物甲烷生成，此時優勢菌屬為Paraclostridium、Alcaligenes和Sphaerochaeta，有研究表明Paraclostridium主要存在于厭氧發酵的水解階段，具有很強的降解能力，通過代謝短鏈、長鏈烷烴生成乙酸等物質[35]。Alcaligenes和Sphaerochaeta可代謝氨基酸產生乙醇、乙酸、乳酸、氫氣和二氧化碳，屬于產氫產乙酸菌[36]。此時液相小分子物質烷烴(十五烷、十六烷、十八烷)、揮發性脂肪酸(甲酸、乙酸、丙酸和丁酸)和醇類(甲醇、乙醇)均有一定的積累，產氣殘煤表面的羰基碳(C=O)、羧基碳(COO—)也表明煤表面的官能團被微生物降解作為小分子有機酸類等物質的組成部分。與此同時，古菌群落中的優勢菌屬為Methansarcina能夠進行多種產甲烷途徑代謝。由于在初期階段能夠為微生物利用的營養物質有限，因此甲烷產氣量較低。在第5～20 天內是甲烷產氣量進行快速增長的階段，在此階段，活躍的細菌(Sedimentibacter、Paraclostridium)通過降解煤提供了充足的底物，同時烷烴、揮發性脂肪酸和醇類的快速消耗也說明了此時厭氧發酵系統中產氫產乙酸菌(Anaerovorax)起到了良好的承上啟下作用，既消耗了水解階段的產物，同時為產甲烷菌提供了充足的營養物質，Methanosarcina豐度的增加也表明了此時生物甲烷主要以乙酸營養為主，該階段主要進行的反應見式(1)～(6)。在產氣末期的20～32 d 內，細菌群落變化較大的是Alcaligenes與Anaerovorax；古菌群落此時主要以Methanosarcina為主，同時液相小分子物質中的揮發性脂肪酸和醇類物質下降緩慢，而烷烴類物質呈小幅度上升，這表明隨著厭氧發酵的進行發酵液中可被微生物利用的營養物質越來越少，處于核心生態位的產氫產乙酸菌受環境因素的改變難以為下階段的產甲烷菌提供底物，且烷烴類物質的小幅上漲也說明了在整個厭氧發酵過程中時刻在進行煤的水解，但因參與每個階段的核心菌群很難保持代謝的連貫性，使得發酵系統中微生物活性受到抑制，產甲烷隨之停止。

2.2.2 石墨烯對生物甲烷產出的促進機制

整體來看，石墨烯的添加(0.4 g/L)有效增強了整個厭氧發酵的進行。不僅提高了產氣初期的甲烷產氣量，同時也提前了產甲烷的產氣高峰期。在發酵初期，細菌群落中添加石墨烯后Sedimentibacter豐度上升，將發酵液中烷烴類降解為乙酸。水解菌群和產氫產乙酸菌群的活性增強，前期積累的營養物質更充足，使得甲烷產氣量高于對照組。在產甲烷高峰期，添加石墨烯后Methanoculleus豐度降低而Methanosarcina豐度顯著提高，一方面參與乙酸轉化的乙酸激酶、乙酸輔酶A 連接酶、磷酸乙酰轉移酶、乙酰輔酶A 脫羰基酶/合成酶β 亞基和γδ 亞基相對豐度都顯著高于對照組，這些酶主要與Methanosarcina有關[37]，其中乙酰輔酶A 脫羰基酶/合成酶β 亞基和γδ 亞基作為乙酸合成途徑中的關鍵酶，分別增加了233.54%和3.32%，這使得Methanosarcina豐度明顯上升且主要進行乙酸營養型產甲烷，已有研究發現石墨烯具有較大的比表面積和較強的吸附性能，通過吸附固定或促進功能微生物富集等作用達到減緩或消除厭氧消化過程中抑制性物質(如NH3、NH4+-N、VFAs、酚類以及重金屬等)對厭氧消化效果的影響[38-40]，這為發酵系統中的微生物提供了良好的生長環境，提高了各類功能菌群的活性，加快了厭氧發酵進程，為產甲烷菌群提供了豐富的底物；另一方面，細菌群落中Geobacter和Methanosarcina豐度增高，研究表明這2 種菌屬能夠在厭氧發酵系統中進行直接種間電子傳遞(DIET)[41]，石墨烯的導電性比菌毛更高，可以替代c型細胞色素和導電菌毛成為電子傳遞媒介，為細胞節省能量[42]，同時實現遠距離的電子傳輸，Geobacter氧化有機物產生的電子通過石墨烯轉移到充當電子受體的Methanosarcina中用于消耗乙酸/CO2產生CH4，進一步促進了生物甲烷的生成(圖9)，這也與實驗組產甲烷高峰期早于對照組相一致。產氣殘煤表面的羰基碳(C=O)、羧基碳(COO—)在添加石墨烯后分別下降了42.8%和49.5%，說明石墨烯有效促進了微生物對煤的降解。

圖9 石墨烯對厭氧發酵系統強化機制Fig.9 Enhancement mechanism of graphene to anaerobic digestion system

3 結 論

(1)在以煤為底物的厭氧發酵系統中添加0.4 g/L的石墨烯能夠有效促進生物甲烷的產出，添加石墨烯的發酵系統中累計甲烷產氣量為5.35 mL/g，比對照組(4.48 mL/g)高出19.42%。

(2)在發酵初期，水解菌群(Paraclostridium)和產氫產乙酸菌群(Alcaligenes、Sphaerochaeta)的活性增強，前期積累了充足的營養物質。在產甲烷高峰期，添加石墨烯后Methanoculleus豐度降低而Methanosarcina豐度顯著提高，一方面乙酰輔酶A 脫羰基酶/合成酶β 亞基和γδ 亞基作為乙酸合成途徑中的關鍵酶，分別增加了233.54%和3.32%，這使得Methanosarcina豐度明顯上升且主要進行乙酸營養型產甲烷，說明添加石墨烯的系統對于發酵液中各類物質的降解速率明顯高于對照組，說明石墨烯的添加提高了菌群的活性和降解效率，加快了厭氧發酵進程，為產甲烷菌群提供了豐富的底物；

(3)細菌群落中能夠利用乙酸乙醇類物質的Geobacter和Anaerovorax豐度增高，其中豐度升高較明顯的Geobacter可能通過與石墨烯輔助的生物電連接與Methanosarcina進行DIET，這種電子傳遞方式在一定程度上加速了生物甲烷的生成。

(4)產氣殘煤表面的羰基碳(C=O)、羧基碳(COO—)在添加石墨烯后分別下降了42.8%和49.5%，說明石墨烯有效促進了微生物對煤的降解。