不同貯藏方法對桑白皮指標性成分影響研究

白 華 ，白 娟，周光姣 ，紀東漢 ，孫 敏

（1. 安徽中醫藥科學院 亳州中醫藥研究所，安徽 亳州 236800；2. 亳州職業技術學院，安徽 亳州 236800；3. 安徽省醫學科學研究院，安徽 合肥 230061；4.安徽中醫藥大學，安徽 合肥 230012）

桑白皮為?？浦参锷＃∕orus alba L.）的干燥根皮，始載于《神農本草經》[1]，具有利水消腫、宣肺平喘等作用[2]。現代藥理研究發現桑白皮含有生物堿類、香豆素類等多種化學成分，具有降血糖、降血壓、抗病毒等作用，其中桑根酮C 和DNJ（1-脫氧野尻霉素）應用最為廣泛。筆者針對不同產地桑白皮展開實地調查，發現亳州藥材市場上的桑白皮質量差異較大，較突出的原因是包裝方法與貯藏時間不同，包裝主要有蛇皮袋、聚乙烯包裝袋和真空包裝，其中真空包裝相對較少；貯藏時間有三個月、半年、一年甚至兩年以上的。因此對桑白皮貯藏方法進行研究，選擇適宜的包裝方法及貯藏時間尤為重要。故筆者收集了35 批桑白皮樣品，以桑根酮C與DNJ 為指標進行含量的測定比較[3-4]，評價不同的包裝方法及貯藏時間對桑白皮指標性成分的影響，優選出桑白皮的貯藏方法以提升桑白皮的質量，為桑白皮質量的科學評價與有效控制提供依據。

1 實驗材料

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀（安捷倫1260 型）、 電子分析天平（日本島津，AU-2200 型）、數顯恒溫水浴鍋（金壇市晶玻實驗儀器廠，HH-S2 型）、離心機（金壇市晶玻實驗儀器廠，800 型）、超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，KQ-500E 型）、數顯鼓風干燥箱（上海成順儀器儀表有限公司）、高速粉碎機（武義海納電器有限公司）、循環水式真空泵（鄭州市鞏義華玉儀器廠，SHZ-D 型）、硅膠板（青島勝海精細硅膠化工有限公司，100×100 mm）。桑根酮C 對照品（中國食品藥品檢定研究院批號160330，含量測定用，純度大于97%）、DNJ 對照品（成都普菲德生物技術有限公司批號160706）；甲醇分析純、甲醇色譜純、正丁醇、無水乙醇、乙腈、苯駢戊三酮（天津市大茂化學試劑廠）、三氯化鐵、冰乙酸、甘氨酸（江蘇強盛功能化學股份有限公司）、鹽酸、芴甲氧羰酰氯、三氯甲烷（洛陽市化學試劑廠）、娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈有限公司，600 mL）。

1.2 藥材

本次實驗所使用的藥材桑白皮全為一月末二月初分別在亳州（采集兩批）、江蘇、宿州、大別山實地采挖，經專家鑒定為?？浦参锷５母稍锔?。采挖后按照藥典的方法進行處理干燥，同一樣品分別采用蛇皮袋、聚乙烯包裝袋、真空包裝袋包裝并在同一環境下常溫分別貯藏3 個月、12 個月（采挖樣品編號、貯藏時間、產地詳見表 1）。

2 薄層色譜鑒別

2.1 桑根酮C定性鑒定

2.1.1 對照品溶液的制備精密稱取桑根酮C 對照品適量，加甲醇溶解制得濃度為0.1550 mg/mL 的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備

樣品按批粉碎，過四號篩，60 ℃ 干燥1 h 后備用。稱樣約1.0 g，精密稱定，置平底燒瓶中，加入甲醇20 mL，精密稱定，回流1 h，放冷之后稱量，并且用甲醇補足重量，充分混勻后過濾，量取續濾液10 mL，濃縮至干，殘渣用甲醇溶入2 mL 的容量瓶中搖勻即得[5-6]。

2.1.3 實驗方法

吸取供試品溶液10 μL，對照液溶液5 μL，依據《中華人民共和國藥典》2015 年版通則0502 薄層色譜法，分別點于同一硅膠G 板上，以三氯甲烷∶甲醇（5∶1）為展開劑，展開、取出、晾干，加熱吹干至顯色[7]。

2.1.4 結果

對照品與桑白皮供試品色譜在相似的位置顯現出相同藍紫色斑點，斑點明顯，結果易分辨。見圖1。

圖1 桑根酮C薄層色譜圖

2.2 DNJ定性鑒定

2.2.1 定性對照品溶液的制備精密稱取DNJ 對照品適量，加甲醇溶解制得濃度為0.7801 mg/mL 的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

樣品按批粉碎，過四號篩， 60 ℃ 干燥1 h 后備用。稱樣約1.5 g，精密稱定，置15 mL 離心管中，并加入0.05 mol/L 的鹽酸溶液10 mL，渦旋混合30 min，4000 r/min 轉離心10 min，取上清液，再將殘渣重復提取1 次，合并2 次提取液，濃縮至干，殘渣用甲醇溶入2 mL 的容量瓶中搖勻即得[8]。

2.2.3 實驗方法

吸取供試品溶液10 μL，對照液溶液5 μL，依據《中華人民共和國藥典》2015 年版通則0502 薄層色譜法，分別點于同一硅膠G 板上，以正丁醇∶冰乙酸∶水 （5∶3∶1）為展開劑，展開、取出、晾干，噴以0.2%的茚三酮溶液后略加熱吹干至顯色[9]。

2.2.4 結果

對照品與桑白皮供試品色譜在相似的位置顯現出相同黃色斑點，斑點明顯，結果易分辨，見圖2。

圖2 DNJ薄層色譜圖

3 高效液相色譜研究

3.1 桑根酮C含量測定

3.1.1 色譜條件

色譜柱：島津C18 色譜柱（250*4.6 mm，5020-39033）；以甲醇∶水（75∶25）為流動相；流速：1.0 mL/min；檢測波長：280 nm；柱溫：30 ℃。在此色譜條件下進樣10 μL 測定，色譜圖見圖3。

圖3 桑根酮 C對照品及桑白皮樣品 HPLC 圖

3.1.2 對照品溶液的制備

同桑根酮C 定性鑒定“2.1.1”項下對照品溶液的制備方法制備。

3.1.3 供試品溶液的制備

同桑根酮C 定性鑒定“2.1.2”項下供試品溶液的制備方法制備。

3.1.4 線性關系考察

分別精密吸取桑根酮C 對照品溶液 1、5、10、15、20、25 μL 依次進樣，根據“3.1.1”的色譜條件進行測定，記錄峰面積，以對照品進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸分析，得回歸方程為： Y=3698.6X+1724.1（r=0.9991），結果表明桑根酮 C 在0.1550～3.875 μg 范圍內有良好的線性關系。

3.1.5 精密度試驗

精密吸取上述桑根酮C 對照品溶液10 μL，根據“3.1.1”的色譜條件測定，重復測定6 次，記錄峰面積，結果 RSD 為0.13%，表明本法精密度良好。

3.1.6 穩定性試驗

取真空包裝貯藏3 個月的亳州1 樣品，制備供試品溶液，根據“3.1.1”的色譜條件，分別在0、4、8、12、16、20 h 進樣10 μL，測定其峰面積，結果RSD 為1.11%，表明供試品溶液在20 h 內穩定性比較良好。

3.1.7 重復性實驗

取真空包裝貯藏3 個月的亳州1 樣品6 份，分別制備供試品溶液，根據“3.1.1”的色譜條件，測定樣品中桑根酮 C 含量，結果RSD 為1.67%。

3.1.8 加樣回收實驗

精密稱取真空包裝貯藏3 個月的亳州1 樣品（桑根酮 C 含量為0.1913%）6 份，分別精密加入0.1550 mg/mL 的桑根酮C 對照品溶液6.0 mL，按“2.1.2”項下方法制備樣品溶液，依次測定含量，計算桑根酮 C 回收率，結果見表2。

表2 桑根酮C 加樣回收試驗結果（n=6）

3.1.9 樣品含量測定

取35 批樣品，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液， 在“3.1.1”色譜條件下測定樣品中桑根酮 C的含量，結果見表3。

表3 樣品中桑根酮C 的含量（n=35）

3.2 DNJ含量測定

3.2.1 色譜條件

色譜柱：島津C18 色譜柱（250*4.6 mm，5020-39033）；以乙腈∶0.1%冰醋酸水溶液（55∶45）為流動相；流速：1.0 mL/min； 檢測波長：265 nm；柱溫：30 ℃。

3.2.2 對照品溶液的制備

同DNJ 定性鑒定“2.2.1”項下對照品溶液的制備方法制備。

3.2.3 供試品溶液的制備

同DNJ 定性鑒定“2.2.2”項下供試品溶液的制備方法制備。

3.2.4 柱前衍生化處理

精密吸取各藥材供試品溶液和對照品溶液 2 mL置于20 mL 容量瓶中，依次加入 5 mL pH 為8.4 的硼酸鹽緩沖液、5 mL 10 mmol/L FMOC-CL 的乙腈溶液，立即混勻，在25 ℃恒溫水浴箱中反應 20 min，加入1 mol/L 甘氨酸2 mL 中和其余的衍生化試劑FMOC-CL，再加入 0.1% 的冰醋酸水溶液，定容至20 mL，混勻，用0.45 μm 菁頭過濾器過濾，取續濾液，即得各藥材供試品溶液和對照品溶液。取0.05 mol/L 的鹽酸溶液2 mL，依上法制備空白供試液[10-15]。 精密吸取衍生化后空白供試液、對照品溶液及桑白皮樣品溶液10 μL 測定，色譜圖見圖4。

圖4 空白對照品、衍生化對照品及桑白皮樣品 HPLC 圖

3.2.5 線性關系考察

分別精密吸取上述DNJ 對照品溶液 1、5、10、15、20、25 μL，根據“3.2.4”的方法衍生化，依次進行測定，記錄峰面積，以對照品進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸分析，得回歸方程為： Y=85.202X+51.521（r=0.9993），結果表明DNJ在0.7801 ～19.5025 μg 范圍內有良好的線性關系。

3.2.6 精密度實驗

精密吸取衍生化后的DNJ 對照品溶液10 μL，根據“3.2.1”的色譜條件測定，重復測定6 次，記錄峰面積，結果 RSD 為0.32%，表明本法精密度良好。

3.2.7 穩定性實驗

取真空包裝貯藏12 個月的亳州1 樣品，制備供試品溶液并衍生化處理，根據“3.2.1”的色譜條件，分別在0、4、8、12、16、20 h 進樣10 μL，測定其峰面積，結果RSD 為1.87%，表明供試品溶液在20 h 內穩定性良好。

3.2.8 重復性實驗

取真空包裝貯藏12 個月的亳州1 樣品6 份，分別制備供試品溶液并衍生化處理，根據“3.2.1”的色譜條件，測定樣品中DNJ 含量，結果RSD 為1.53%。

3.2.9 加樣回收實驗

精密稱取真空包裝貯藏12 個月的亳州1 樣品（DNJ 含量為0.0822%）6 份，分別精密加入0.7801 mg/mL 的DNJ 對照品溶液1.0 mL，制備供試品溶液并衍生化處理，依次測定含量，計算DNJ 回收率，結果見表4。

表4 DNJ 加樣回收試驗結果（n=6）

3.2.10 樣品含量測定

取35 批樣品，根據“3.2.3”“3.2.4”的方法制備供試品溶液并衍生化處理，分別吸取 10 μL，測定樣品中的DNJ 含量，結果見表5。（n=35）

表5 樣品中DNJ 的含量（n=35）

4 討論

（1）在薄層色譜鑒別中，通過對比各種展開劑發現，分別以三氯甲烷∶甲醇（5∶1）為展開劑，以水：冰乙酸：正丁醇∶冰乙酸∶水（5∶3∶1）作為展開劑時，桑根酮C 與DNJ 的定性鑒別展開結果與顯色結果佳，且斑點清晰易辨別。

（2）采用HPLC 測定桑根酮C、DNJ 含量時，經比較試驗發現，分別以甲醇∶水（75∶25）為流動相、波長為280 nm；以乙腈∶0.1%冰醋酸水溶液（55∶45） 為流動相、波長為265 nm 的色譜條件下，系統分離效果最好，重復性較好，結果穩定。

（3）本實驗研究發現各包裝方法中真空包裝優于聚乙烯包裝優于蛇皮袋包裝，在貯藏時間方面，總體上新鮮的桑白皮指標性成分含量最高，貯藏三個月的桑白皮的指標性成分桑根酮C 的含量較貯藏一年的為高，但也有個別情況如宿州的桑白皮真空貯藏一年后桑根酮C 的含量高于三個月的含量，可能是在包裝過程中包裝方法的嚴密性差異而出現這種情況；指標性成分DNJ 的含量貯藏三個月與貯藏一年比較，差異不明顯。

通過對不同包裝方法及及貯藏時間的桑白皮藥材的有效成分含量的測定與分析可以看出，不同包裝方法及及貯藏時間對藥材的有效成分含量均有影響。不當的貯藏方法會降低有效成分的含量，從而影響桑白皮的臨床療效。

結合實驗研究結果，新鮮的桑白皮藥材如需貯備建議采用真空包裝，貯藏時間不宜過長，一般3個月左右，最長不宜超12 個月。因真空包裝貯藏成本較高，可在此基礎上探索新的貯存方法，既能節約成本，又能保障臨床療效，為商家和用戶帶來最大便利。另桑白皮藥材質量跟產地也有一定的關系，實驗發現，亳州本地的桑白皮指標性成分含量高于江蘇與宿州等地，體現了亳桑皮作為亳州道地藥材的優勢。