角鯊烯環(huán)氧酶對(duì)宮頸鱗癌細(xì)胞增殖、凋亡及遷移侵襲的影響

夏娜娜,陳思穎,楊京蕊,康 敏,余敏敏

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京醫(yī)院/南京市第二醫(yī)院,江蘇 南京 210003)

宮頸癌是困擾女性的常見惡性腫瘤之一,其發(fā)病率位居我國(guó)婦科惡性腫瘤前列[1]。宮頸癌的病理分型包括鱗癌、腺癌和腺鱗癌,其中鱗癌占比達(dá)到了75%～80%[2]。當(dāng)前針對(duì)宮頸鱗癌的治療手段仍是以早期手術(shù)及中晚期放化療為主,然而對(duì)于晚期、復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的患者而言,雖經(jīng)放化療,預(yù)后仍較差。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)和基因組學(xué)的發(fā)展,腫瘤的靶向治療、免疫治療進(jìn)行的如火如荼,但目前已有的靶向藥物針對(duì)宮頸鱗癌的治療療效有限。因此,對(duì)于宮頸鱗癌的治療有待于發(fā)現(xiàn)新的更可靠的治療靶點(diǎn)。

近年來(lái),人們通過(guò)對(duì)腫瘤生物學(xué)和腫瘤代謝的深入探究,了解到膽固醇代謝重編程在腫瘤進(jìn)展中的作用,主要表現(xiàn)為膽固醇合成的上調(diào)和相關(guān)代謝產(chǎn)物的異常聚集[3]。角鯊烯環(huán)氧酶(squalene epoxidase,SQLE)主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,是膽固醇生物合成中的第二種限速酶,能夠催化角鯊烯轉(zhuǎn)化為2,3-環(huán)氧角鯊烯。研究表明,SQLE的表達(dá)與多種腫瘤如胰腺癌[4]、前列腺癌[5]和乳腺癌[6]等進(jìn)展、侵襲和轉(zhuǎn)移緊密相關(guān)。然而,SQLE在宮頸鱗癌中的調(diào)控作用還未見報(bào)道。本研究首先通過(guò)生物信息學(xué)方法分析了SQLE在宮頸鱗癌和正常宮頸組織的mRNA及蛋白表達(dá)量差異,探討了SQLE與宮頸鱗癌臨床病理學(xué)特點(diǎn)之間的關(guān)系,然后評(píng)估了高表達(dá)SQLE mRNA宮頸鱗癌患者的總生存期(overall survival,OS)和無(wú)病生存期(disease free survival,DFS),最后以宮頸鱗癌細(xì)胞Siha為對(duì)象,用小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制SQLE的表達(dá)及轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒促進(jìn)SQLE的表達(dá),觀察SQLE基因?qū)iha細(xì)胞增殖、凋亡和遷移侵襲的影響及作用機(jī)制,為宮頸鱗癌的臨床治療提供新的思路與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1生物信息學(xué)資料 GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)(gene expression profiling interactive analysis,http://gepia.cancer-pku.cn/)是一個(gè)基于癌癥基因組圖譜(TCGA)和基因型-組織表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)的基因表達(dá)分析的網(wǎng)絡(luò)工具。SQLE在宮頸鱗癌與正常宮頸組織中的基因差異表達(dá)使用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)篩選條件:Gene:SQLE, |Log2FC|≥1,P<0.05,Cancer name:CESC,同時(shí)使用此篩選條件分析SQLE的表達(dá)對(duì)宮頸鱗癌患者生存預(yù)后的影響;人類蛋白圖譜(HPA)數(shù)據(jù)庫(kù)(the human protein atlas,https://www.proteinatlas.org/) 可以在單細(xì)胞水平上實(shí)現(xiàn)下調(diào)蛋白的空間定位,并提供基因的組織學(xué)表達(dá)信息。使用HPA數(shù)據(jù)庫(kù)檢索條件:Gene:SQLE,Cancer Type:CESC,下載SQLE在宮頸鱗癌與正常宮頸組織的免疫組化染色圖片;使用UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)(http://ualcan.path.uab.edu/)檢索條件:Gene:SQLE, Cancer Type:CESC,分析SQLE的表達(dá)與臨床病理資料的相關(guān)性。

1.1.2細(xì)胞株 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC-12和人宮頸鱗癌細(xì)胞Siha購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。

1.1.3主要試劑 DMEM培養(yǎng)基(Gibco,C11995500BT);胎牛血清(Gibco,10099141);CCK-8試劑盒(美國(guó)MCE,HY-K0301);RIPA裂解液(上海碧云天,P0013B);BCA試劑盒(上海碧云天,P0010S);結(jié)晶紫染液(上海碧云天,C0121)、凋亡檢測(cè)試劑盒(南京諾唯贊生物,A211-01)、GAPDH抗體(10494-1-AP)、SQLE抗體(12544-1-AP)、Bax抗體(50599-2-IG)、Bcl-2抗體(12789-1-AP)、E-cadherin抗體(10494-1-AP)、Vimentin抗體(10494-1-AP),購(gòu)自武漢三鷹生物;PI3K(A0265)、p-PI3K(AP0854)、Akt(A11016)、p-Akt抗體(AP0140)購(gòu)自武漢愛博泰克;LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒(美國(guó)Invitrogen,11668019)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 采用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在轉(zhuǎn)染前1天消化收集Siha細(xì)胞,接種細(xì)胞至6孔板中,使轉(zhuǎn)染細(xì)胞密度達(dá)到40%～60%,根據(jù)siRNA ∶DEPC水=1OD ∶125 μL配制儲(chǔ)存液,以脂質(zhì)體 ∶siRNA儲(chǔ)存液為1 ∶1(V/V)的最優(yōu)比,按照說(shuō)明書進(jìn)行基因干擾處理。同樣細(xì)胞傳代3次達(dá)穩(wěn)定狀態(tài)后取細(xì)胞密度達(dá)到40%～60%時(shí)進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒的Siha細(xì)胞為Vector組,轉(zhuǎn)染SQLE重組質(zhì)粒的Siha細(xì)胞為SQLE組,依照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞,顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并判斷轉(zhuǎn)染效率,Western blot法驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。

1.2.2CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于濃度為5×103/孔的96孔培養(yǎng)板中,設(shè)置干擾對(duì)照組(si-NC組)、干擾處理組(si-SQLE組),過(guò)表達(dá)對(duì)照組(Vector組)及過(guò)表達(dá)處理組(SQLE組)。每組處理5個(gè)復(fù)孔,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱,分別培養(yǎng)24、48和72 h。每孔加入90 μL完全培養(yǎng)液及10 μL CCK-8,將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱避光孵育2 h,用酶標(biāo)儀檢測(cè)A450nm值。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率 細(xì)胞傳代鋪至6孔板,設(shè)置si-NC組、si-SQLE組、Vector組和SQLE組并轉(zhuǎn)染相關(guān)片段,6 h后換液,48 h后棄培養(yǎng)液,用PBS洗2次,用不含EDTA的0.25%胰酶消化,1 200 r·min-1離心5 min,得到細(xì)胞沉淀。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞,加入100 μL Binding Buffer混勻細(xì)胞,然后每組細(xì)胞加Annexin V-FITC和PI各5 μL,室溫避光放置10 min,加入400 μL 1× Binding Buffer,混勻,在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.4劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 取經(jīng)處理過(guò)的各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Siha細(xì)胞鋪至6孔板,待細(xì)胞貼壁且密度達(dá)到90%時(shí),用200 μL吸頭劃直線痕,每孔橫豎各劃3條,用PBS輕洗3次去除漂浮細(xì)胞,加入無(wú)血清培養(yǎng)基,每孔隨機(jī)選取5個(gè)視野并標(biāo)記,分別在0和24 h用顯微鏡拍照。

1.2.5Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲 將50 μL基質(zhì)膠稀釋液加入小室上層中,放入恒溫培養(yǎng)箱至基質(zhì)膠凝固。取經(jīng)處理過(guò)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Siha細(xì)胞,以每孔數(shù)為2×105個(gè)重懸200 μL不含胎牛血清的培養(yǎng)液中,置于上層小室。同時(shí),將含有20%胎牛血清的600 μL培養(yǎng)液放入下室。培養(yǎng)24 h后,去除上室細(xì)胞,用4%多聚甲醛固定下室細(xì)胞,0.1%結(jié)晶紫染色,晾干后拍照并計(jì)數(shù)。

1.2.6Western blot檢測(cè)細(xì)胞蛋白表達(dá) 向各組細(xì)胞中加RIPA裂解液提取總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度,加熱使蛋白變性。SDS-PAGE蛋白電泳,蛋白分離后,電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。先用含5%脫脂奶粉封閉1 h,再以一抗工作液(1 ∶1 000)在4 ℃孵育過(guò)夜,最后以二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1.5 h。洗膜,加入ECL化學(xué)發(fā)光劑,暗室顯影曝光。結(jié)果采用ImageJ軟件進(jìn)行分析,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7qRT-PCR法檢測(cè)SQLE mRNA表達(dá)水平 收集細(xì)胞,用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板,GAPDH為內(nèi)參,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物序列:SQLE上游引物5′-CTCCAAGTTCAGGAAAAGCCTGG-3′,下游引物5′-GAGAACTGGACTCGGGTTAGCT-3′;GAPDH上游引物5′-CTGCCAACGTGTCAGTGGTG-3′,下游引物5′-TCAGTGTAGCCCAGGATGCC-3′。

2 結(jié)果

2.1 宮頸鱗癌及正常宮頸組織SQLE mRNA的表達(dá)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果表明,SQLE在宮頸鱗癌組織中表達(dá)量明顯高于正常宮頸組織,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見Fig 1A。

2.2 HPA數(shù)據(jù)庫(kù)免疫組化結(jié)果通過(guò)HPA數(shù)據(jù)庫(kù)檢索免疫組織化學(xué)檢測(cè)標(biāo)本,獲得宮頸正常組織標(biāo)本2例,宮頸鱗癌標(biāo)本17例,宮頸腺癌標(biāo)本5例;免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果(Fig 1B)顯示,宮頸正常組織樣本中均未檢測(cè)到SQLE蛋白的表達(dá),宮頸鱗癌組織中13例SQLE蛋白表達(dá)呈陽(yáng)性,宮頸腺癌組織中4例SQLE蛋白表達(dá)呈陽(yáng)性。

Fig 1 Different expression and immunohistochemical staining

2.3 SQLE與宮頸鱗癌臨床病理特征相關(guān)性分析通過(guò)UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行SQLE基因表達(dá)與臨床病理資料相關(guān)性分析,納入306例腫瘤樣本、3例正常組織樣本。分析結(jié)果顯示在Stage分期、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等亞組中,SQLE在宮頸鱗癌中的表達(dá)均高于正常組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見Fig 2A-F。其中在宮頸鱗癌中不同年齡、Stage分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見Fig 2A-E。在宮頸鱗癌的不同Stage分期中,SQLE在Ⅳ期的表達(dá)高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期;在宮頸鱗癌的不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中,SQLE在N0組的表達(dá)低于N1組。而在宮頸鱗癌腫瘤分級(jí)中組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見Fig 2F。

Fig 2 Correlation analysis between SQLE gene expression and clinical pathological data

2.4 高表達(dá)SQLE mRNA的宮頸鱗癌患者的OS和DFS評(píng)估通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)OS和DFS結(jié)果顯示,SQLE mRNA低表達(dá)組宮頸鱗癌患者的OS較高表達(dá)組明顯延長(zhǎng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HR=1.80,P<0.05);SQLE mRNA低表達(dá)組宮頸鱗癌患者的DFS較高表達(dá)組,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HR=1.60,P>0.05),見Fig 3。

Fig 3 Relationship between expression of SQLE and OS, DFS in patients with cervical squamous cell carcinoma

2.5 SQLE在宮頸鱗癌Siha和人臍靜脈內(nèi)皮HUVEC-12細(xì)胞中的表達(dá)以人臍靜脈內(nèi)皮HUVEC-12細(xì)胞作為對(duì)照,通過(guò)qRT-PCR和Western blot法檢測(cè)SQLE在人宮頸鱗癌Siha細(xì)胞中mRNA和蛋白表達(dá)水平,見Fig 4。結(jié)果顯示,Siha細(xì)胞SQLE mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為(2.35±0.55,1.33±0.15),明顯高于HUVEC-12細(xì)胞(1.00±0.04,1.00±0.09),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

Fig 4 Differential expression of SQLE in Siha and HUVEC-12

2.6 SQLE對(duì)Siha細(xì)胞SQLE蛋白表達(dá)和細(xì)胞增殖影響轉(zhuǎn)染SQLE siRNA和過(guò)表達(dá)質(zhì)粒48 h后,用qRT-PCR及Western blot法檢測(cè)人宮頸鱗癌Siha細(xì)胞中SQLE mRNA及蛋白表達(dá),見Fig 5A-F。與si-NC組相比,si-SQLE轉(zhuǎn)染組SQLE mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯降低(1.00±0.13vs0.19±0.06,1.00±0.05vs0.45±0.07)(P<0.01,P<0.05),見Fig 5A-C;與Vector組相比,SQLE轉(zhuǎn)染組SQLE mRNA及蛋白表達(dá)量增加(1.00±0.20vs3.22±0.54,1.38±0.12vs1.00±0.08)(P均<0.05),見Fig 5D-F。CCK-8結(jié)果顯示,與si-NC組細(xì)胞生長(zhǎng)相比,作用24 h、48 h及72 h si-SQLE組Siha細(xì)胞增殖明顯抑制(0.52±0.08vs0.39±0.05,0.75±0.12vs0.56±0.10,1.13±0.10vs0.82±0.12),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05),見Fig 5G;與Vector組相比,作用24 h、48 h及72 h SQLE組Siha細(xì)胞增殖率增加(0.51±0.06vs0.72±0.08,0.65±0.09vs0.90±0.12,1.10±0.12vs1.46±0.16),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05),見Fig 5H。

2.7 SQLE對(duì)Siha細(xì)胞凋亡率的影響癌癥的發(fā)病機(jī)制可能與磷脂酰絲氨酸外化和DNA斷裂在內(nèi)的凋亡過(guò)程有關(guān),在藥物研發(fā)中靶向細(xì)胞凋亡可能是化療治療癌癥的最終過(guò)程。結(jié)果顯示,si-NC組和si-SQLE組Siha細(xì)胞的凋亡率分別為(6.10±1.10)%和(11.74±3.31)%。與si-NC組相比,干擾SQLE可促進(jìn)Siha細(xì)胞凋亡(P<0.01),見Fig 6A-B。Vector組和SQLE組Siha細(xì)胞的凋亡率分別為(7.78±1.32)%和(2.70±0.54)%。與Vector組相比,過(guò)表達(dá)SQLE可明顯抑制Siha細(xì)胞凋亡(P<0.01),見Fig 6C-D。

Fig 6 Effect of SQLE on Siha cell apoptosis

2.8 SQLE對(duì)Siha細(xì)胞遷移能力的影響細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,si-NC組和si-SQLE組Siha細(xì)胞的遷移率分別為(47.37±4.98)%和(21.05±3.24)%,與si-NC組相比,si-SQLE組細(xì)胞遷移率明顯降低(P<0.01),見Fig 7A-B。Vector組和SQLE組Siha細(xì)胞的遷移率分別為(42.86±5.90)%和(72.73±8.15)%,與Vector組相比,過(guò)表達(dá)SQLE組細(xì)胞遷移率明顯增加(P<0.01),見Fig 7C-D。

Fig 7 Effect of SQLE on migration ability of Siha

2.9 SQLE對(duì)Siha細(xì)胞侵襲能力的影響Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,si-NC組和si-SQLE組Siha細(xì)胞的侵襲數(shù)目分別為(102±11)個(gè)和(67±6)個(gè),與si-NC組相比,si-SQLE組細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯降低(P<0.01),見Fig 8A-B。Vector組和SQLE組Siha細(xì)胞的侵襲數(shù)目分別為(105±8)個(gè)和(133±12)個(gè),與Vector組相比,過(guò)表達(dá)SQLE組細(xì)胞侵襲數(shù)目增加(P<0.05),見Fig 8C-D。

Fig 8 Effect of SQLE on invasion ability of Siha

2.10 SQLE對(duì)Siha細(xì)胞凋亡及侵襲遷移相關(guān)蛋白的影響結(jié)果顯示,si-NC組和si-SQLE組Siha細(xì)胞中E-cadherin、Vimentin、Bcl-2和Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為(1.20±0.14vs2.10±0.27)、(1.88±0.17vs1.02±0.08)、(1.72±0.15vs1.00±0.12)和(1.29±0.12vs2.02±0.16)。可知與si-NC組相比,si-SQLE組Vimentin和Bcl-2蛋白水平明顯降低(P均<0.01),E-cadherin和Bax蛋白水平升高(P<0.01,P<0.05),見Fig 9A-B。Vector組和SQLE組Siha細(xì)胞中E-cadherin、Vimentin、Bcl-2和Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為(1.51±0.16vs1.00±0.06)、(1.05±0.14vs1.56±0.25)、(1.03±0.18vs1.59±0.19)和(1.44±0.15vs1.05±0.10)。與Vector組相比,過(guò)表達(dá)SQLE組Vimentin和Bcl-2蛋白水平明顯升高(P均<0.05),E-cadherin和Bax蛋白水平明顯降低(P均<0.05),見Fig 9C-D。

Fig 9 Effect of SQLE on expression of E-cadherin, Vimentin, Bcl-2 and Bax proteins in Siha

2.11 SQLE對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)影響PI3K/Akt信號(hào)途徑廣泛存在于各種血管細(xì)胞中,在細(xì)胞增殖、遷移和抗凋亡中起著重要作用。結(jié)果顯示,si-NC組和si-SQLE組Siha細(xì)胞p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt相對(duì)表達(dá)量分別為(1.85±0.19vs1.00±0.12)和(2.76±0.24vs1.86±0.16)(P均<0.05)。與si-NC組相比,si-SQLE組總PI3K蛋白及總Akt蛋白水平均無(wú)明顯影響,但p-PI3K和p-Akt蛋白水平降低(1.90±0.16vs1.00±0.12,1.92±0.18vs1.38±0.15)(P<0.01,P<0.05),見Fig 10A-B。Vector組和SQLE組p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt相對(duì)表達(dá)量分別為(1.72±0.15vs2.36±0.22)和(1.00±0.10vs2.65±0.29)(P<0.05,P<0.01)。同樣,兩組相比,其總PI3K蛋白及總Akt蛋白水平均無(wú)明顯變化,但與Vector組相比,SQLE組p-PI3K和p-Akt蛋白水平明顯升高(1.77±0.19vs2.69±0.24,1.00±0.06vs2.69±0.20)(P<0.05,P<0.01),見Fig 10C-D。

3 討論

目前全球范圍內(nèi)宮頸癌占女性所有惡性腫瘤的第二位,僅次于乳腺癌[1]。宮頸鱗癌的病因至今尚未完全明確,該病的發(fā)生與基因、病毒感染、過(guò)早性生活等有關(guān)[2]。由于缺乏有效的輔助治療,宮頸鱗癌患者的預(yù)后較差,因此,迫切需要開發(fā)有效的靶標(biāo)生物標(biāo)志物或有前途的藥物來(lái)改善患者的預(yù)后。

SQLE位于人類染色體8q24.13上,是一種致癌基因,能夠影響膽固醇生物合成[4]。有研究顯示,膽固醇會(huì)減弱某些物質(zhì)對(duì)細(xì)胞膜的破壞作用,從而保護(hù)線粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及細(xì)胞膜的功能完整性[7]。研究表明[8],SQLE通過(guò)調(diào)節(jié)膽固醇代謝促進(jìn)多種人類癌癥的腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移。SQLE mRNA的表達(dá)與高危ER+乳腺癌明顯相關(guān),SQLE可以通過(guò)增強(qiáng)膽固醇的合成,參與維持乳腺癌干細(xì)胞的干細(xì)胞性和乳腺腫瘤的進(jìn)展[9]。膽固醇積累引起的SQLE減少通過(guò)激活β-catenin致癌途徑和p53腫瘤抑制通路失活,加重結(jié)直腸癌的進(jìn)展[10]。SQLE在肝癌組織中表達(dá)上調(diào),可以通過(guò)正向調(diào)控ERK信號(hào)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和遷移,與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[11]。在胰腺癌中,SQLE與胰腺癌細(xì)胞的放射抗性相關(guān),改變細(xì)胞周期進(jìn)展特征,誘導(dǎo)癌細(xì)胞遷移和侵襲,從而影響患者的預(yù)后[4]。以上可知,SQLE可作為許多腫瘤預(yù)后不良的主要標(biāo)志物。然而,目前SQLE基因在宮頸鱗癌中的作用還未見報(bào)道。

本研究利用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)和免疫組化證實(shí),SQLE mRNA和蛋白在宮頸鱗癌組織中高表達(dá),且SQLE mRNA高表達(dá)組宮頸鱗癌患者的OS明顯縮短,表明SQLE低表達(dá)的宮頸鱗癌患者預(yù)后可能會(huì)更好。通過(guò)UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn),在宮頸鱗癌的不同Stage分期中,SQLE在Ⅳ期的表達(dá)明顯高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期(P<0.01);在宮頸鱗癌的不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中,SQLE在N0組的表達(dá)低于N1組(P<0.01),這表明SQLE可能抑制宮頸腫瘤細(xì)胞凋亡并促進(jìn)其增殖及侵襲遷移。CCK-8實(shí)驗(yàn)證實(shí),干擾SQLE可抑制宮頸鱗癌Siha細(xì)胞增殖,過(guò)表達(dá)SQLE可促進(jìn)Siha細(xì)胞增殖(P均<0.05),說(shuō)明SQLE基因可促進(jìn)宮頸鱗癌細(xì)胞增殖,但與膽固醇的合成變化有無(wú)直接關(guān)系還需要進(jìn)一步研究。位于17pl3染色體上的TP53參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期調(diào)控、DNA修復(fù)及促進(jìn)細(xì)胞凋亡等過(guò)程,從而防止細(xì)胞轉(zhuǎn)移[12]。p53蛋白能夠調(diào)控Bcl-2和Bax的表達(dá),從而在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用。Bax主要參與細(xì)胞的內(nèi)在凋亡信號(hào)通路,激活后從細(xì)胞質(zhì)聚集于線粒體外膜,導(dǎo)致線粒體釋放細(xì)胞色素C,激活下游的caspase等蛋白,從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的過(guò)程。促凋亡蛋白Bax觸發(fā)內(nèi)在通路的激活,這是開發(fā)治療藥物的絕佳靶點(diǎn),目前正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,敲減si-SQLE組Siha細(xì)胞凋亡率明顯高于si-NC組,過(guò)表達(dá)SQLE組細(xì)胞凋亡率明顯低于Vector組(P均<0.01)。Western blot結(jié)果顯示,si-SQLE組Bcl-2/Bax比值為si-NC組的0.37倍,即兩者比值減小,可知干擾SQLE可以有效促進(jìn)Siha細(xì)胞凋亡,過(guò)表達(dá)SQLE基因結(jié)果與之相反。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化EMT是宮頸癌轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一,極化的上皮細(xì)胞通過(guò)重編程獲得間充質(zhì)細(xì)胞的特征,促使細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性和遷移能力增強(qiáng)[13]。宮頸癌組織中上皮化分子標(biāo)志物E-cadherin低表達(dá)和間質(zhì)化分子標(biāo)志物Vimentin高表達(dá)在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起到了重要的調(diào)控作用,是細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的一個(gè)特征。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,干擾SQLE可以抑制Siha細(xì)胞遷移和侵襲,過(guò)表達(dá)SQLE能夠促進(jìn)Siha細(xì)胞遷移和侵襲。類似報(bào)道是SQLE對(duì)肝癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞等侵襲遷移具有促進(jìn)作用。

PI3K/Akt作為一種重要細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,其已被證實(shí)在多種惡性腫瘤中激活,參與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲及凋亡。PI3K是一種磷脂酰肌醇激酶,可使下游的Akt蛋白活化,活化的Akt通過(guò)抑制線粒體途徑上調(diào)Bcl-2及下調(diào)Bax蛋白的表達(dá),發(fā)揮抗凋亡作用[14]。恢復(fù)癌細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路,誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡,可從根本上解決宮頸鱗癌的問(wèn)題。宮頸癌患者的不良預(yù)后與腫瘤是否浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān),其中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用尤為重要。研究顯示[15],PI3K/Akt通路激活后可降低細(xì)胞中E-cadherin的水平,并誘導(dǎo)Vimentin的表達(dá),從而誘導(dǎo)EMT轉(zhuǎn)化并促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。本研究表明,干擾SQLE可以抑制p-PI3K、p-Akt的表達(dá)水平,阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路;過(guò)表達(dá)SQLE可以增加p-PI3K、p-Akt的表達(dá)水平。提示SQLE可能通過(guò)促進(jìn)PI3K/Akt信號(hào)途徑調(diào)控Siha細(xì)胞的增殖、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程。這與之前的研究相比,其結(jié)果具有較好的一致性。

綜上所述,本研究初步探索了SQLE在宮頸鱗癌進(jìn)展中的作用。臨床研究顯示,與正常組織的mRNA和蛋白水平相比,宮頸鱗癌組織中SQLE的表達(dá)明顯上調(diào),且SQLE高表達(dá)的患者預(yù)后較差。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明,干擾SQLE抑制Siha細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及促進(jìn)其凋亡,過(guò)表達(dá)SQLE促進(jìn)Siha細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及抑制其凋亡。機(jī)制研究表明,SQLE可能通過(guò)促進(jìn)PI3K/Akt信號(hào)通路在宮頸鱗癌中發(fā)揮調(diào)控作用。所以SQLE有望成為治療宮頸鱗癌的潛在靶點(diǎn)。但本研究還未考察SQLE對(duì)宮頸鱗癌相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的作用,這也將是下一步需要研究的內(nèi)容。