沙棘經PXR/NF-κB通路減緩免疫性肝損傷小鼠肝臟CYP2C下調

郝佩佩,曹盈瑩,鄒慧瓊,丁瑞峰,白雪峰,薛永志,

( 1.內蒙古科技大學包頭醫學院,2.內蒙古科技大學包頭醫學院基礎醫學與法醫學院,3.內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院,4.包頭市腫瘤醫院,內蒙古 包頭 014060)

乙型肝炎病毒(HBV)感染后引起機體細胞免疫應答,一方面清除HBV,一方面引起肝損傷[1]。機體發生免疫性肝損傷,引起炎癥反應,激活Kupffer細胞產生IL-1β、NF-κB等激活星狀細胞,該過程是引起肝炎肝硬化中纖維組織增生和肝細胞發生癌變的重要發生機制[2-3]。在免疫性肝損傷過程中多種代謝酶表達下調,本實驗之前偶然發現在免疫性肝損傷過程中CYP2C酶的活性下調[3],但其蛋白水平表達情況及其機制尚不清楚。CYP2C可以參與約30%的藥物代謝[4], 其表達降低會導致其參與生物轉化的藥物在體內聚集,加重肝臟負擔。因此,我們迫切需要尋找恢復CYP2C酶表達的藥物。PXR不僅在肝損傷進展和修復及向肝細胞癌轉變的過程中發揮重要作用[3-5],還可以調節肝臟中藥物代謝酶CYP2C的表達[5-6]。有人提出PXR可以與NF-κB相互抑制來減輕炎癥反應[6-7],Uehara等[8]證實, PXR可以通過抑制NF-κB的靶基因表達來保護DSS誘導的結腸炎,但其在免疫性肝損傷中CYP2C酶下調方面的作用尚不清楚。

已有研究證明沙棘可以通過抑制NF-κB減輕小鼠急性肝損傷[9]、膿毒癥誘導的肝損傷[10],本實驗室前期已證實沙棘可以改善免疫性肝損傷中CYP3A4的下調[11]。基于此我們提出沙棘可以通過調控PXR/NF-κB通路,來改善免疫性肝損傷小鼠CYP2C的下調這個假說。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 昆明種SPF級♂小鼠,體質量(18～22)g,購自斯貝福北京生物技術有限公司,動物許可證號SCXK(京)2022-0002。

1.1.2藥品與試劑 沙棘顆粒(四川美大康藥業股份有限公司,批號Z51020098);卡介苗(瑞楚生物,批號:202301)、PCN(APExBIO,批號C38841133C770)、玉米油(Solarbio,批號511H021);GAPDH、CYP2C、NF-κB p65抗體、PXR(NR1I2)抗體(武漢博士德生物公司,批號:BM3876、A02107-2、BA0610、A01133-3);ELISA試劑盒(江蘇酶免實業有限公司,批號202209)。

1.1.3主要儀器 低溫高速離心機(上海安亭科學儀器廠);凝膠成像儀(環亞生物科技);DF．D型恒壓恒流電泳儀(北京市六一儀器廠);紫外-可見光全光譜分光光度計(Gene Company Limited);37 ℃恒溫孵育箱(賽默飛世爾儀器有限公司);Multiskan FC型酶標儀(賽默飛世爾儀器有限公司)。

1.2 實驗動物分組與模型制備

1.2.1實驗動物分組 60只小鼠,隨機分為control組、BCG組、BCG+SG(50、100、200 mg·kg-1)組和BCG+PCN組,每組10只。

1.2.2動物模型制備 實驗小鼠適應性喂養1周后,除control組,其他各組均一次性尾靜脈注射BCG 125 mg·kg-1制備免疫性肝損傷小鼠模型,BCG+SG組在(第8～14天灌胃相應劑量的SG,每日2次);將PXR的小鼠特異性激動劑PCN[8]溶于玉米油中,制備成20 g·L-1,BCG+PCN組分別在第11～14天給予腹腔注射100 mg·kg-1,每日1次。

1.3 取材第15天給予小鼠斷頭取血,置于肝素化的試管中,3 500 r·min-1離心20 min后,取上清液,即為血清置于-80 ℃用于后續實驗,取部分相同部位肝臟組織浸泡于預先制備好的福爾馬林溶液中,常規HE染色;用4 ℃生理鹽水門靜脈灌流沖洗后將剩余肝臟剖出,置于-80 ℃用于后續實驗。

1.4 實驗方法

1.4.1各組小鼠肝臟形態學觀察 將小鼠肝臟置于福爾馬林溶液中固定48 h后,石蠟包埋切片,HE常規染色,于顯微鏡下進行組織病理觀察。

1.4.2小鼠血清肝功能的檢測 血清丙氨酸轉氨酶(alanine transarninase,ALT)、血清天冬氨酸轉氨酶(aspartate aminotransferase,AST)水平檢測采用ELISA試劑盒檢測。提取的血清為待測樣品,步驟嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.4.3ELISA檢測各組小鼠肝臟炎性因子TNF-α和IL-1β檢測 小鼠肝臟TNF-α和IL-1β采用ELISA試劑盒檢測。取小鼠肝臟組織0.1 g加入PBS 0.9 mL充分研磨勻漿后,在3 000 r·min-1離心20 min,取上清液,即為待測樣品。步驟嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.4.4Western blot檢測各組小鼠肝組織NF-κB p65、PXR、CYP2C蛋白表達水平 用NP-40裂解液提取小鼠肝臟總蛋白,用胞漿胞核提取試劑盒提取肝臟核蛋白。利用BCA法檢測肝臟組織蛋白的含量。按30 μg上樣于已制好的10%膠上,電泳,將蛋白質轉移至PVDF膜上,用 5%脫脂奶粉封閉1 h,放入一抗GAPDH(1 ∶2 000)、CYP2C(1 ∶200)、PXR(1 ∶500)、NF-κB p65(1 ∶100),4 ℃孵育過夜,次日敷二抗1 h,用ECL顯色液顯色,凝膠成像儀曝光、拍照,用ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值,計算目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 各組小鼠肝臟病理變化Fig 1結果顯示,control組小鼠肝索以中央靜脈為中心呈放射狀排列,肝小葉結構清晰可見,細胞質豐富,細胞核位于細胞中央。BCG模型組小鼠肝索排列紊亂,肝細胞出現大片狀壞死,肝實質與匯管區可見大量的炎癥細胞浸潤。BCG+SG組小鼠與BCG模型組比較,均出現不同程度的點狀壞死,肝實質及匯管區炎癥細胞浸潤出現不同程度的減輕,大劑量組減輕最為明顯。BCG+PCN組小鼠與BCG模型組小鼠比較肝臟組織病理均出現明顯的改善。

Fig 1 Effect of sea-buckthorn on liver pathology of mice with

2.2 各組小鼠血清轉氨酶水平的變化Fig 2結果顯示,尾靜脈注射BCG制備免疫性肝損傷小鼠模型15 d后,BCG組ALT、AST水平明顯高于control組(P<0.01),分別應用PXR小鼠特異性激動劑PCN及SG后小鼠血清轉氨酶水平明顯受到抑制(P<0.01)。

Fig 2 Effect of sea-buckthorn on serum transaminase of mice with

2.3 各組小鼠肝組織炎性因子TNF-α和IL-1β含量Fig 3結果顯示,與control組相比,BCG組TNF-α和IL-1β含量均明顯增高(P<0.01),BCG+PCN組、BCG+SG相較BCG組TNF-α和IL-1β含量均下降(P<0.01),提示SG和PCN可以改善肝損傷和肝臟炎癥。

Fig 3 Effect of sea-buckthorn on IL-1β and TNF-α content in liver of mice with BCG-induced immune-mediated

2.4 各組小鼠肝組織NF-κB p65、PXR與CYP2C蛋白水平Western blot結果表明(Fig 4),BCG組小鼠肝臟細胞的細胞核中NF-κB p65蛋白過表達,PXR、CYP2C蛋白受到抑制(P<0.01),在用PCN進行干預后與模型組對比,NF-κB p65蛋白表達有所下降且PXR和CYP2C蛋白表達增加(P<0.01),說明PXR可以抑制NF-κB p65,促進CYP2C表達。在使用SG進行干預后,呈劑量依賴性的上調PXR、CYP2C蛋白表達,下調NF-κB p65蛋白的表達,尤其是高劑量組更加明顯(P<0.01),說明SG可以通過調控PXR/NF-κB通路來改善免疫性肝損傷中CYP2C的下調。

Fig 4 Effect of sea-buckthorn on expression of PXR, NF-κB and CYP2C protein in liver of mice with BCG-induced immune-mediated liver n=10)

3 討論

本實驗采用尾靜脈注射BCG制備免疫性肝損傷模型,BCG組肝臟病理呈現肉芽腫性團塊,ALT、AST活性和肝臟中TNF-α、IL-1β含量升高可以得出造模成功,可用于后續實驗。乙肝患者肝損傷與T淋巴細胞介導的細胞免疫有關[2]。在感染HBV后Th1相關的細胞因子TNF-α在機體清除HBV和導致肝損傷方面發揮核心作用[12]。在BCG誘導的免疫性肝損傷中Th1型細胞因子TNF-α同樣發揮重要作用[13],與乙型病毒性肝炎發生肝損傷的發病機制相似,常被用來慢性乙型肝炎相關研究。

之前提到在BCG誘導的免疫性肝損傷過程中CYP2C酶活性下調。從本實驗的結果可以得到,在BCG誘導的免疫性肝損傷小鼠中肝臟CYP2C酶在蛋白水平降低。既往國內外研究多集中在其基因多態性發面,本實驗證明影響其表達的因素不僅僅局限于基因多態性這個因素,肝炎肝損傷也是影響其表達的重要因素。在應用PXR的特異性激動劑后,進一步研究證明,PXR可以抑制NF-κB p65表達來減緩免疫性肝損傷小鼠肝臟CYP2C的表達,下調其下游炎性因子TNF-α和IL-1β表達來減輕肝炎、肝損傷,與之前提出的PXR可以通過抑制NF-κB p65來減輕炎癥一致[7]。PXR是一種配體依賴的轉錄因子,不僅可以調節藥物代謝和異常情況下葡糖糖、膽汁酸的代謝,還在炎癥、癌癥等疾病方面發揮重要作用[7]。正常狀態下PXR無生物活性,當與配體結合后與RXR結合形成異二聚體,調控靶基因的表達[6,14]。PXR在免疫性肝損傷中不僅可以減輕肝損傷,還對CYP2C的下調發揮重要作用。SG是由沙棘和葡萄糖組成,可以用于研究沙棘方面的實驗,其已用于臨床,主要治療止咳祛痰、消食化滯、活血散瘀,但其對免疫性肝損傷方面研究較少。本實驗在應用沙棘對免疫性肝損傷小鼠進行干預后,PXR、NF-κB p65和CYP2C蛋白的表達均有所恢復,且肝臟病理顯示炎癥減輕,血清轉氨酶下降。證明SG可以通過調控PXR/NF-κB通路,來減緩免疫性肝損傷小鼠中CYP2C的下調和減輕肝損傷,為免疫性肝損傷中代謝酶的下調提供新的思路。

之前有學者提出,CYP2C參與代謝的產物類花生酸有抗炎作用[15],還可能與肝細胞癌(HCC)的發生、預后有關,其表達降低促進HCC的發生和發展[4]。本實驗采用BCG誘導免疫性肝損傷模型,而免疫性肝損傷是HCC的重要發生機制[16],BCG組肝實質區和匯管區有大量的炎癥細胞浸潤,當給予沙棘干預后,CYP2C的表達增加,病理結果顯示肝臟炎癥也同樣減輕。由此我們猜想CYP2C可能在肝臟炎癥消退過程中發揮著重要作用,并且還可以通過減輕免疫性肝損傷來減緩乙肝向HCC發展的進程。沙棘減輕肝炎肝損傷可能不僅僅是通過PXR/NF-κB通路下調其下游炎癥因子TNF-α和IL-1β來達到此效果,也能與其可以恢復CYP2C的表達有關。但本實驗有一定的局限性,后期我們會使用基因敲除技術來對上述猜想進行實驗驗證。

綜上所述,沙棘可以通過調控PXR/NF-κB通路,來減緩免疫性肝損傷中CYP2C的下調。