基于網絡藥理學和實時熒光定量聚合酶鏈式反應法探討鬼臼毒素對胃癌的作用機制※

劉 雅,陳思嬡,龐一丹,齊佳瑞,孫靜薇,安 娟,蘇占海

(青海大學醫學部,西寧 810001)

鬼臼毒素(Podofilox)是一種鬼臼屬植物桃兒七(生長于海拔2 000～4 000米的青藏高原)的芳基萘類木脂素內酯[1],具有抗腫瘤、調節免疫等多種生物學活性,其中抗腫瘤活性最為顯著[2]。研究人員通過修飾鬼臼毒素結構,得到衍生物依托泊苷(etoposide,VP-16)和替尼泊苷(teniposide,VM-26)[3],為廣譜抗腫瘤藥物。雖然鬼臼毒素及其衍生物取得了較好的臨床療效,但作用機制不甚清楚。本研究擬通過網絡藥理學和實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)法研究鬼臼毒素對胃癌的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與細胞

鬼臼毒素(上海陶素生化有限公司,產品編號:T1121),人胃腺癌AGS細胞(武漢普諾賽生物公司)。

1.1.2 試劑與儀器

人胃癌AGS細胞專用培養基(武漢普諾賽生物公司),0.25%胰蛋白酶溶液(北京索萊寶公司),PBS(北京索萊寶公司),CCK-8試劑溶液(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司),引物(中國上海生工公司),總RNA提取試劑盒(中國北京天根生化科技有限公司),FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix(中國北京天根生化科技有限公司),SuperReal PreMix Color(中國北京天根生化科技有限公司)。

NanoDrop 2000紫外分光光度計(美國Thermo公司),實時熒光定量PCR儀(美國Roche公司)。

1.2 方法

1.2.1 網絡藥理學方法

1.2.1.1 鬼臼毒素的分子靶標確定

基于TCMSP(https://tcmsp-e.com/)、Pubchem(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、Swiss Target Prediction(http://swisstargetprediction.ch/)、Similarity ensemble approach(https://sea.bkslab.org/)、Pharmapper(http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/)數據庫[4]完成靶標預測。由于識別出的部分候選靶標未使用公認基因名,因此使用UniProt(www.uniprot.org/)、STRING數據庫(https://cn.string-db.org/)進行基因映射,獲取鬼臼毒素分子靶標名稱。

1.2.1.2 與胃癌相關的基因鑒定

應用GeneCards(http://www.gene-cards.org/)、Disgenet(https://www.disgenet.org/)數據庫鑒定與胃癌相關的基因。

1.2.1.3 韋恩圖交集靶標篩選

將使用韋恩圖在線網站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)預測得到的鬼臼毒素潛在靶標和胃癌基因取交集,再將轉錄組測序數據中的差異基因與公共數據庫來源的潛在靶標基因上傳至該網站做韋恩圖,取韋恩圖中的交集基因導入STRING數據庫。

1.2.1.4 PPI蛋白互作分析

利用公共數據庫STRING構建胃癌相關基因和鬼臼毒素相關治療靶標的相互作用網絡。各靶標間的最低交互得分是0.4。將結果保存為tsv格式后導入Cytoscape3.8.2軟件,繪制PPI網絡。

1.2.1.5 GO和KEGG富集分析

我們將核心靶標導入DAVID(https://david.ncifcrf.gov)數據庫[5]獲得由GO和KEGG分析的結果。GO富集分析包括3類:生物過程(BPs)、細胞組分(CCs)和分子功能(MFs)。利用微生信網站(http://www.bioinformatics.com.cn)繪制GO富集和KEGG信號通路富集的氣泡圖。

1.2.2 體外實驗方法

1.2.2.1 藥物配置

取鬼臼毒素藥品粉末用DMSO溶解至100 μM,再用培養基稀釋至工作濃度(12.50、6.25、3.13、1.56 nM),用微膜過濾后置-20℃冰箱保存。用前震蕩混勻。

1.2.2.2 細胞培養及分組

使用含10%胎牛血清的專用培養基(37℃,5% CO2)培養人胃腺癌細胞AGS,每2 d換液一次。待細胞密度達到80%～90%時進行傳代,分為對照組和不同藥物濃度實驗組。

1.2.2.3 細胞增殖實驗

將對數生長階段的AGS細胞以每孔5 000個細胞的密度接種于96孔板,置細胞培養箱(37℃,5% CO2)培養24 h,加藥繼續培養24 h后吸去原培養基,每孔(4個復孔)加入10 μL CCK-8溶液和100 μL完全培養基混合液,搖勻避光培養1 h。用酶標儀在450 nm波長處測光密度(OD)值,根據OD值繪制細胞增殖曲線并計算IC50值。細胞存活率(%)按下式計算:細胞存活率(%)=(給藥組的OD值-空白組的OD值)/(對照組的OD值-空白組的OD值)×100%。

1.2.2.4 qRT-PCR測定

將計算得到的IC50值設置為加藥組的藥物濃度,使用該濃度的鬼臼毒素處理AGS細胞。根據試劑盒說明,使用總RNA提取試劑盒提取藥物作用24 h的細胞總RNA。總RNA被反向轉錄成cDNA。使用Sybrgreen PCR試劑進行相對定量PCR實驗。qRT-PCR反應條件如下:95℃預變性900 s;95℃變性15 s,60℃退火/延伸20 s,共40個循環(兩步法)。相對mRNA表達水平使用2-ΔΔCt法表示。qRT-PCR 使用的引物序列信息見表1。

表1 引物序列信息

1.2.3 統計學分析方法

2 結果

2.1 網絡藥理學結果

2.1.1 潛在靶標篩選

應用TCMSP、Swiss Target Prediction、Pubchem等數據庫共篩選出120個鬼臼毒素潛在靶標。從Genecard、Disgenet數據庫共得到1 901個胃癌相關基因。分析鬼臼毒素靶標和胃癌基因的共同基因(即鬼臼毒素對胃癌作用的潛在靶標),得到120個交集基因。

我們前期從測序數據研究中共獲得了1 278個差異基因[6],將這些差異基因與從公共數據庫得到的120個預測靶標上傳到上文提到的韋恩圖在線網站繪制Venn圖(圖1),該圖顯示有15個相交靶標,分別是ISG20、HSPA5、MTHFD1、RELA、TP53、ANG、EGFR、IGF1R、MET、ALDH1A1、DHFR、JUN、BCL2L1、CCND1、VIM,鬼臼毒素和胃癌交集靶標名稱和信息見表2。

圖1 鬼臼毒素和胃癌交集靶標Venn圖

表2 鬼臼毒素潛在靶標名稱和基因信息

2.1.2 蛋白-蛋白互作PPI網絡圖構建

將鬼臼毒素的15個核心靶標導入STRING數據庫構建蛋白-蛋白互作PPI網絡圖,并應用Cytoscape 3.8.2軟件優化網絡(圖2)。隨著度值減小,節點顏色和大小由深到淺,每條邊代表活性成分與作用靶標之間的相互作用關系。

圖2 Cytoscape蛋白互作PPI網絡圖

2.1.3 GO富集分析與KEGG信號通路富集分析

使用DAVID數據庫對15個潛在靶標進行了GO富集分析和KEGG信號通路富集分析。我們將數據導入微生信網站(http://www.bioinformatics.com.cn/)繪制GO富集分析氣泡圖(圖3A-C),以P<0.05為標準篩選MF、CC、BP。結果表明,潛在靶標與23個MFs、84個BPs和17個CCs密切相關。MFs的結果顯示,這15個潛在靶標主要與各種蛋白質的結合相關。BPs的結果顯示,這15個潛在靶標主要與細胞凋亡、pri-miRNA轉錄等生物過程相關。CCs主要富集在細胞體、轉錄抑制器復合體、細胞質、微管組織(中心)、受體復合體、轉錄因子復合體、核膜、線粒體、軸突等細胞組分中。使用DAVID數據庫對15個潛在靶標進行KEGG信號通路富集分析發現,這15個潛在靶標主要富集在黑色素瘤相關通路、癌癥通路、PI3K/AKT信號通路和MAPK信號傳導通路(圖3D)等通路中。

A:MF富集分析;B:BP富集分析;C:CC富集分析;D:KEGG通路富集分析

2.2 qRT-PCR結果

2.2.1 抑制胃癌細胞的增殖

結果顯示,與對照組比較,隨著鬼臼毒素濃度增加,各加藥組的AGS細胞存活率明顯下降(P<0.05),且呈濃度依賴性,提示鬼臼毒素對AGS細胞的增殖具有顯著抑制作用。并且鬼臼毒素處理胃癌細胞AGS的IC50的濃度為11.49 nM,見表3、圖4。

鬼臼毒素(藥物濃度,nM)

表3 鬼臼毒素對AGS細胞活性的影響

2.2.2 驗證PI3K/AKT信號通路

為了研究與PI3K/AKT信號通路相關的基因,我們設計了7對引物,采用qRT-PCR實驗檢測對照組和鬼臼毒素加藥組各個基因的表達情況。以β-actin為內源性對照,使用2-ΔΔCt法定量每個樣品中mRNA的相對含量。采用t檢驗分析各組間差異。結果顯示,除CCND1外,TP53、MET、RELA、EGFR、BCL2L1、IGF1R的mRNA表達在兩組之間有差異,并且差異有顯著性(P<0.05),見表4、圖5。

Ns:not significant,*:P<0.05,**:P<0.01,***:P<0.001

表4 關鍵靶標mRNA表達水平

3 討論

本研究通過網絡藥理學分析獲得鬼臼毒素作用于胃癌的15個潛在靶標。通路富集分析顯示,鬼臼毒素可能是通過抑制PI3K/AKT信號通路相關基因的表達抑制胃癌生長。Yu HG等的研究結果提示[7],鬼臼毒素衍生物依托泊苷對胃癌細胞的抑制作用可能是通過影響PI3K/AKT信號通路實現的。Zhang Y等采用SGC7901/ADR胃癌細胞系探究了鬼臼毒素衍生物依托泊苷對胃癌的作用機制,認為它通過抑制PI3K/AKT信號通路進而抑制細胞凋亡[8]。2022年有學者采用HGC-27胃癌細胞和GES-1胃粘膜正常細胞探究鬼臼毒素衍生物12 c對胃癌細胞的影響,指出該化合物作用的靶標可能是PI3K/AKT信號通路[9]。以往的研究發現,PI3K/AKT信號通路在促進胃癌的發生發展過程中起到了關鍵的作用,并且鬼臼毒素對于胃癌細胞的生長抑制有劑量依賴效應[10,11],這與我們的分析結論一致。我們通過分析發現,潛在靶標CCND1、TP53、MET、RELA、EGFR、BCL2L1、IGF1R均富集在這條通路,qRT-PCR結果顯示,經鬼臼毒素處理后的TP53、RELA、EGFR、BCL2L1、IGF1R表達下調。然而CCND1和MET與該通路其他基因的受抑制程度不同,可能是這兩個基因在鬼臼毒素發揮作用的同時,被其他調控機制影響。以往的研究表明,PI3K/AKT信號通路被抑制可以促進細胞凋亡[12],是癌癥治療的重要靶點[13,14]。有研究顯示,凋亡相關通路PI3K/AKT/NF-κB信號通路軸在胃癌的發生發展中發揮了重要作用[13]。PI3K/AKT信號通路已在大多數腫瘤中被發現,并被用作藥物治療的靶標。TP53在許多腫瘤類型中充當腫瘤抑制劑[15],TP53可以誘導細胞生長停滯或者促使細胞凋亡[16];RELA又名NF-κB,可以通過調節上皮-間充質轉化影響腫瘤微環境的組成[17],從而改變腫瘤對化療藥物的耐藥性[18];EGFR是人體內的一類跨膜受體酪氨酸激酶,該區域的激活即磷酸化對抑制腫瘤細胞增殖、血管生成、腫瘤侵襲、腫瘤轉移及細胞凋亡的抑制有重要意義[19];BCL2L1是細胞死亡的有效抑制劑[20];IGF1R對于腫瘤的轉化和惡性細胞的存活至關重要。文獻及本研究的qRT-PCR結果提示,鬼臼毒素可能在mRNA轉錄水平抑制PI3K/AKT信號通路相關基因的表達進而影響胃癌細胞的生長。下一步,我們將通過蛋白水平的Western Blot實驗進行驗證。