青海瑪多地區藏族學齡肥胖兒童糞便非靶向代謝組學分析※

艾麗孜熱·艾尼瓦爾,馬 燕,2,閆 馨,吳子怡,杜文琪#

(1.青海大學醫學部公共衛生系,西寧 810001;2.青海大學高原醫學研究中心,西寧 810001)

肥胖是目前威脅人類健康的疾病之一,它可導致相關并發癥,如胰島素抵抗(Insulin resistance,IR)、非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver diseases,NAFLD)和2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)等[1,2]。在全球范圍內,肥胖的患病率呈上升趨勢[3]。目前我國最新的流行病學調查顯示學齡兒童肥胖的患病率存在地理差異,高海拔地區肥胖的患病率明顯低于平原地區,但在高海拔地區肥胖的發生率較高。因此,明確不同地域肥胖的發生機制,有助于預防和控制我國學齡兒童超重和肥胖現狀。故本研究采用液相色譜-質譜聯用(LC-MS)技術對青海瑪多地區藏族兒童的糞代謝物進行非靶向代謝組學檢測,為高海拔地區藏族兒童肥胖發生機制研究提供研究思路。

1 對象與方法

1.1 對象

選取青海省瑪多縣(海拔4 300 m)7～12歲藏族兒童作為研究對象。按照相關診斷標準[4]將研究對象分為肥胖組和正常體質量組;通過分層整群抽樣法選擇12名藏族肥胖兒童(HOB:High-altitude obesity),并匹配12名正常體質量藏族兒童(HN:High altitude normal)。采用病例-對照研究法,分別采集兩組研究對象的糞便樣品作為檢測樣本。所納入的兒童均為寄宿生,有相同的膳食結構。納入的研究對象在糞便采集前食用2周的標準飲食。兩組研究對象的年齡和身高無明顯差異,體質量和身體質量指數(BMI)在兩組間存在顯著性差異(P<0.01),詳見表 1。

表1 兩組研究對象一般情況

兒童監護人同意參加本研究并簽署相關知情同意書。本實驗所涉及的人群研究獲青海大學醫學院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑選擇

質譜儀(Q ExactiveTMHF,Thermo Fisher)、色譜儀(Vanquish UHPLC,Thermo Fisher)、低溫離心機(D3024R,Scilogex);甲醇(A456-4,Thermo Fisher)、甲酸(A117-50,Thermo Fisher)、醋酸銨(A114-50,Thermo Fisher)。

1.2.2 樣本采集與制備

使用一次性糞便采樣盒收集新鮮糞便200 mg放入3 mL保存液中混勻,置-80℃冰箱保存。樣品制備:(1)取100 μL樣本置EP管中,加入400 μL 80%甲醇水溶液;(2)渦旋振蕩,靜置(冰浴)5 min后離心(15 000 g,4℃,20 min);(3)取一定量的上清加超純水稀釋至甲醇含量為53%;(4)離心(15 000 g,4℃,20 min)后收集上清,應用 LC-MS 技術進行分析[5,6]。用兩組樣本提取液等量混合配制QC樣本進行質量控制。

1.2.3 色譜柱及質譜條件設定

色譜柱為Hypesil Gold column色譜柱(C18,100 mm×2.1 mm,1.9 μm,Thermo Fisher)。正離子檢測模式下,流動相A:甲醇,流動相B:0.1%甲酸水溶液;負離子檢測模式下,流動相A:甲醇,流動相B:5 mM醋酸銨水溶液(pH 9.0)。梯度洗脫:0～1.5 min,2% A;1.5～3.0 min,2%～85% A;3～10 min,85%～100% A;10.0～10.1 min,100%～2% A;10.1～12.0 min,2% A。柱溫:40℃;流速:0.2 mL/min。質譜條件:噴霧電壓為3.5 KV;鞘氣流速為35 psi;輔助氣流速為10 L/min;離子傳輸管溫度為320℃;離子導入射頻電平為60;輔助氣加熱器溫度為350℃;一級分辨率為60 000;二級分辨率為15 000;掃描范圍為100～1500。二級掃描為數據依賴性掃描(DDA,data dependent scans)。

1.2.4 數據處理及統計分析

將數據(.raw)文件導入搜庫軟件(Compound Discoverer 3.1,簡稱CD 3.1)進行預處理及代謝物鑒定。采用公共數據庫(KEGG、HMDB和LIPID Maps數據庫)對鑒定的代謝物進行注釋。使用SIMCA14.1軟件進行PCA、OPLS-DA分析,得到每個代謝物的VIP值。用MetaboAnalyst5.0進行獨立樣本t檢驗來判斷統計學顯著性,并計算代謝物在兩組間的FC值。篩選差異代謝物的默認標準為VIP>1、P<0.05且FC≥2或FC≤0.5[7,8]。應用KEGG數據庫對差異代謝物進行通路富集分析。

2 結果

2.1 青海瑪多地區藏族肥胖兒童糞便代謝輪廓分析

圖1(聚類熱圖)直觀展現了所有樣本的聚集性,表明組內樣本較聚集。通過PCA、OPLS-DA分析法,在整體水平上對代謝物的組間差異進行可視化分析,各組樣本代謝物在組內的分布是均勻的,在組間的分布存在差異。

圖1 正離子模式(左圖)和負離子模式(右圖)糞便樣本的層次聚類

OPLS-DA模型顯示,左圖:R2Y=0.981,R2X=0.278,Q2=0.820;右圖:R2Y=0.964,R2X=0.292,Q2=0.838。R2>Q2,說明模型不存在過擬合。代謝物在正負離子模式下都有一定的差異,提示糞代謝樣本存在代謝差異。圖2、圖3顯示,樣本存在離群情況,這可能與樣本量及糞便質量等因素相關。

圖2 正負離子模式下PCA得分圖

圖3 正負離子模式下OPLSDA得分圖

2.2 差異代謝物篩選

通過KEGG、HMDB、Lipid Maps數據庫對代謝物進行定性、定量分析。從數量上看,兩組樣本(HN、HOB)在正離子模式下篩選出927個代謝產物,在負離子模式下篩選出554個代謝產物。HN與HOB組在正離子模式下篩選出差異代謝物20個,其中5個代謝物上調、15個代謝物下調;在負離子模式下篩選出差異代謝物14個,其中11個代謝物上調、3個代謝物下調。見表2。

表2 正負離子模式下差異代謝物及上下調個數

表3 正負離子模式FC值>2的顯著差異代謝物

2.3 相關代謝途徑富集分析

圖4 差異代謝物富集通路

表4 顯著富集通路

3 討論

本研究兩組研究對象的PCA及OPLS-DA結果顯示,兩組樣本組內分布均勻,組間存在一定差異。結果顯示,大部分化合物以脂質分子為主,其脂質分子占比呈現增高趨勢,結論與大部分的肥胖研究結果一致[9]。具體哪一類脂質分子起到關鍵性的生物標志物作用需要進一步研究闡明。

根據FC值對差異代謝物進一步篩選,貢獻較大的代謝產物有6個脂質化合物、2個有機酸類化合物、4個苯環及類苯環化合物,它們的占比均表現為上調趨勢,其中α-酮戊二酸、檸檬酸作為三羧酸循環中的關鍵中間產物,與糖、脂肪分解及能量產生密切相關[10]。

KEGG通路富集分析結果顯示,葉酸碳庫代謝,檸檬酸鹽循環代謝,乙醛酸和二羧酸代謝,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路顯著富集(P<0.05)。檸檬酸循環代謝物被認為是細胞代謝的主要副產物,對核苷酸、脂質和蛋白質等大分子的生物合成很重要[11]。檸檬酸鹽循環的分析機制:通過丙酮酸脫羧酶將丙酮酸轉化為線粒體OAA和谷氨酰胺,谷氨酰胺轉化為谷氨酸,隨后轉化為α-酮戊二酸。當α-酮戊二酸水平下降時,檸檬酸鹽從線粒體輸入到細胞質中進行脂質合成。本研究中,α-酮戊二酸含量上升,影響了脂質從頭合成機制。另外一些檸檬酸鹽循環中間體的產生可以通過谷氨酰胺依賴性還原羧化的過程來維持,在該途徑中,通過NADPH依賴性異檸檬酸脫氫酶2(IDH2)和烏頭酸酶(ACO)催化兩個后續反應,從谷氨酰胺衍生的α-酮戊二酸產生檸檬酸鹽[12]。還有研究表明,α-酮戊二酸、富馬酸、草酰乙酸、檸檬酸、蘋果酸等作為三羧酸循環中的關鍵中間產物,與糖、脂肪分解及能量產生密切相關[10]。其中α-酮戊二酸是決定三羧酸循環總體速率的關鍵分子[13]。三羧酸循環和氨基酸代謝存在一定的交互關系,三羧酸循環中間產物如草酰乙酸、α-酮戊二酸分別是天冬氨酸和谷氨酸的前體。丙酮酸在胰腺導管腺癌中與葡萄糖和谷氨酰胺衍生的碳競爭,為三羧酸循環提供燃料[14]。谷氨酸被谷氨酸脫氫酶或谷草轉氨酶轉化為三羧酸循環中間物α-酮戊二酸[15]。谷氨酸是氨基酸能量代謝途徑的一種底物,可經由谷氨酰胺途徑在谷氨酰胺酶的作用下生成,并能通過生成α-酮戊二酸進入三羧酸循環,獨立于葡萄糖為三羧酸循環供能[16]。本研究的代謝通路也涉及檸檬酸循環代謝,乙醛酸、二羧酸代謝,丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝,是通過影響脂質從頭合成,影響三羧酸循環的中間產物,來改變能量代謝。這可能與青海瑪多地區學齡藏族兒童長期的飲食結構密切相關,藏族家庭遵循民族傳統的生活方式和飲食習慣,每天主要攝入高脂肪、高碳水、低膳食纖維類食物,故能量攝入較其他地區多[17]。因此,我們假設瑪多地區學齡兒童肥胖發生機制也與能量代謝相關的通路密切相關。

本研究存在一定的局限性:樣本較局限;由于非靶向代謝組學無偏向性,故發現的差異代謝物存在一定偏差。因此,在后續研究中應進一步增加樣本量,并進行靶向代謝組學研究。

綜上所述,本研究通過非靶向代謝組學方法,對青海瑪多地區不同體質量的肥胖藏族兒童的糞代謝水平進行了分析,獲得了3種富集于檸檬酸鹽循環代謝,乙醛酸、二羧酸代謝,丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝的差異代謝物葉酸、檸檬酸、α-酮戊二酸,為梳理肥胖的發病機制提供了新的思路。