Sirt6與狼瘡性腎炎足細(xì)胞損傷的關(guān)系

魏玉嬌,陳超,周燕,劉南池,馬瑞霞

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院,山東 青島 266003 1 腎病科; 2 心血管內(nèi)科)

狼瘡性腎炎(LN)是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)病人最常見及最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,是影響SLE病人預(yù)后的主要因素[1]。LN以蛋白尿、鏡下血尿、進(jìn)行性腎功能損害為主要特點(diǎn),其中蛋白尿是LN的主要臨床表現(xiàn),是判斷疾病活動(dòng)性的重要指標(biāo)[2]。足細(xì)胞是腎小球?yàn)V過膜的重要組成部分,對維持腎功能具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn),足細(xì)胞損傷是LN病人蛋白尿的發(fā)病機(jī)制之一[3],其損傷程度是終末期腎病的主要預(yù)后決定因素[4]。LN病人足細(xì)胞損傷的機(jī)制仍不清楚,可能與免疫復(fù)合物沉積、補(bǔ)體激活、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡及自噬有關(guān)[5]。Sirtuins是一類進(jìn)化保守的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴性組蛋白脫乙酰化酶[6],哺乳動(dòng)物Sirtuins蛋白家族共包括7個(gè)成員(Sirt1～7)。沉默調(diào)節(jié)蛋白6(Sirt6)是Sirtuins蛋白家族中較為重要的一員,主要通過去乙?；疕3K9、H3K59抑制炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡、促進(jìn)DNA修復(fù)、調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài),參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程[7]。有研究發(fā)現(xiàn),Sirt6在糖尿病腎病(DN)中表達(dá)降低,而誘導(dǎo)Sirt6高表達(dá)可通過激活A(yù)MPK途徑維持足細(xì)胞線粒體穩(wěn)態(tài)、減少足細(xì)胞凋亡,發(fā)揮腎臟保護(hù)作用[8]。目前國內(nèi)外有關(guān)Sirt6在LN中的作用研究甚少。本研究擬探討Sirt6與LN病人足細(xì)胞損傷的關(guān)系及相關(guān)機(jī)制。

1 對象與方法

1.1 研究對象

納入研究對象為2018年1月—2020年1月于我院腎病科住院治療、診斷明確的LN病人70例,平均年齡(31.72±7.92)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):①符合2012年系統(tǒng)性紅斑狼瘡國際臨床協(xié)作組(SLICC)制定的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)[9],伴有腎臟損害的臨床表現(xiàn)(蛋白尿、血尿或腎功能不全);②年齡>18周歲;③初治且經(jīng)腎臟穿刺活檢病理確診為LN;④所有病人均有完整的病史、實(shí)驗(yàn)室檢查資料,且女性病人均未在妊娠期。所有病人均排除腎小球或腎間質(zhì)性腎炎等原發(fā)和繼發(fā)性腎臟疾病。根據(jù)SLE疾病活動(dòng)度評分(SLEDAI評分)[10]分為活動(dòng)組(≥7分)47例、非活動(dòng)組(≤7分)23例。同時(shí)選擇性別、年齡相匹配的因腎外傷行腎臟切除的病人(腎臟組織光鏡檢查證實(shí)為正常腎組織)15例作為對照組。本研究經(jīng)青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn),且全部納入對象均簽署知情同意書。

1.2 臨床資料收集

收集研究對象的臨床資料及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果,實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果包括24 h尿蛋白定量(24hUP)、血紅蛋白(HB)、血小板(PLT)、血清清蛋白(ALB)、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、膽固醇(CH)、三酰甘油(TG)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、紅細(xì)胞沉降率(ESR)、補(bǔ)體C3(C3)、補(bǔ)體C4(C4)、抗雙鏈DNA抗體(anti-dsDNA)、抗核抗體(ANA)以及腎小球?yàn)V過率估計(jì)值(eGFR,CKD-EPI法計(jì)算)。

1.3 腎臟病理檢查

病人于B超引導(dǎo)下行腎穿刺活檢術(shù),腎組織活檢標(biāo)本制成3 μm厚的石蠟包埋切片,常規(guī)行HE染色,光鏡觀察腎組織結(jié)構(gòu),電鏡觀察腎小球足細(xì)胞。LN腎臟病理分型根據(jù)2012年SLICC診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]。病理分型采用2003年國際腎臟病協(xié)會(huì)和腎臟病理學(xué)會(huì)(ISN/RPS)標(biāo)準(zhǔn)[11]。

1.4 免疫組化染色方法檢測Nephrin、Sirt6表達(dá)

腎組織活檢標(biāo)本石蠟包埋、切片,使用二甲苯、不同濃度梯度的乙醇溶液進(jìn)行脫蠟、水化,內(nèi)源性過氧化物酶封閉抗原。洗滌后分別加入單克隆兔抗人Nephrin抗體(1∶1 000,ab216341,Abcam,Cambridge,MA,USA)、Sirt6抗體(1∶1 000,ab62739,Abcam,Cambridge,MA,USA),洗滌后37 ℃下加入山羊抗兔IgG抗體(1∶200,PV9001,北京中杉金橋公司)孵育30 min,蘇木精復(fù)染、風(fēng)干,二甲苯脫色后封片,顯微鏡下觀察。Nephrin、Sirt6陽性染色均為棕色。每張切片選取10個(gè)視野,使用IPP軟件(Insilicos,Seattle,WA,USA)分別計(jì)算腎組織中Nephrin、Sirt6的陽性染色面積,取其平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 各組病人臨床資料比較

與對照組比較,LN非活動(dòng)組病人HB、PLT、ALB、C3、C4明顯降低, 24hUP、ESR、CRP升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.64～120.60,P<0.05),CH、TG、Scr、BUN差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與LN非活動(dòng)組相比,LN活動(dòng)組病人HB、ALB、C3、C4、eGFR明顯降低,而24hUP、SCr、BUN、CH、ESR明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.17～120.60,P<0.05)。見表1。

表1 各組臨床資料比較

2.2 各組腎組織光鏡、電鏡觀察結(jié)果比較

HE染色光鏡觀察顯示,LN病人腎小球體積增大,系膜區(qū)增寬,系膜細(xì)胞及系膜基質(zhì)增多,且活動(dòng)組變化更明顯(圖1)。電鏡觀察顯示,對照組腎小球足突完整、排列規(guī)則,基底膜連續(xù);LN組腎小球系膜細(xì)胞、系膜基質(zhì)明顯增生,基底膜不均勻增厚,足突彌漫融合甚至消失,且活動(dòng)組變化更明顯(圖2)。

A:對照組;B:LN非活動(dòng)組:C:LN活動(dòng)組。HE染色,放大200倍。

2.3 各組足細(xì)胞Nephrin表達(dá)水平比較

免疫組化染色顯示,對照組足細(xì)胞Nephrin表達(dá)明顯,呈連續(xù)、線性分布;LN組足細(xì)胞Nephrin表達(dá)降低,分布不均,且LN活動(dòng)組較非活動(dòng)組降低更明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=133.61,P<0.05)。見圖3、表2。

A:對照組;B:LN非活動(dòng)組:C:LN活動(dòng)組。放大400倍。

表2 各組Nephrin及Sirt6表達(dá)比較

2.4 腎組織Sirt6表達(dá)水平比較

免疫組化染色顯示,對照組Sirt6均勻分布在腎小球、腎小管及腎間質(zhì)中,且主要分布在腎小球細(xì)胞核中;LN組Sirt6表達(dá)降低,分布不均,且LN活動(dòng)組較非活動(dòng)組降低更明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=103.65,P<0.05)。見圖4、表2。

A:對照組;B:LN非活動(dòng)組:C:LN活動(dòng)組。放大400倍。

2.5 腎組織Sirt6表達(dá)與24hUP、ESR、C3、ALB等臨床指標(biāo)的相關(guān)性

Spearman相關(guān)性分析顯示,腎組織中Sirt6表達(dá)水平與24hUP(r=-0.580,P<0.01)、ESR(r=-0.559,P<0.01)呈負(fù)相關(guān),與C3(r=0.670,P<0.01)、ALB(r=0.660,P<0.01)呈正相關(guān)。見圖5。

圖5 Sirt6與臨床指標(biāo)的相關(guān)性散點(diǎn)圖

2.6 腎組織Sirt6表達(dá)與足細(xì)胞Nephrin表達(dá)及SLEDAI評分的相關(guān)性

Spearman相關(guān)性分析顯示,腎組織Sirt6表達(dá)與足細(xì)胞Nephrin表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.954,P<0.01),而與SLEDAI評分呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.666,P<0.01)。見圖6。

圖6 腎組織Sirt6與足細(xì)胞Nephrin及疾病活動(dòng)性的相關(guān)性散點(diǎn)圖

3 討 論

SLE是一種伴有全身多器官損害的自身免疫性疾病,以血清中出現(xiàn)抗核抗體(ANA)等多種自身抗體為主要特征[11]。LN是SLE最常見的器官損害之一,是判斷疾病進(jìn)展及預(yù)后的重要指標(biāo)。LN的發(fā)病機(jī)制尚不清楚,迄今為止,越來越多的研究強(qiáng)調(diào)足細(xì)胞損傷在LN發(fā)病中具有重要作用[12]。足細(xì)胞是高度分化的細(xì)胞,位于鮑曼囊內(nèi)側(cè),包裹著腎小球毛細(xì)血管。足細(xì)胞通過表達(dá)突觸素、Nephrin、Podocin和Wilms腫瘤蛋白等標(biāo)志物,在維持腎小球?yàn)V過屏障完整性及維持腎功能方面發(fā)揮重要作用[13]。本研究光鏡、電鏡觀察發(fā)現(xiàn),LN病人腎小球基底膜增厚,系膜細(xì)胞及系膜基質(zhì)增生,足突彌漫融合甚至消失;免疫組化染色顯示,足細(xì)胞Nephrin表達(dá)降低,且活動(dòng)組降低更明顯,提示LN病人存在足細(xì)胞損傷。本文結(jié)果還顯示,Nephrin表達(dá)水平與24hUP負(fù)相關(guān),提示Nephrin可能與疾病活動(dòng)性有關(guān)。LN足細(xì)胞損傷的具體機(jī)制尚未明確,可能與免疫復(fù)合物沉積、補(bǔ)體激活、淋巴細(xì)胞浸潤、細(xì)胞凋亡及自噬有關(guān)[5,14]。有研究發(fā)現(xiàn),Sirtuins蛋白家族廣泛參與足細(xì)胞穩(wěn)態(tài)及腎功能的維持[15]。

Sirt6是Sirtuins蛋白家族中最為重要的一員,其在雄性小鼠中過表達(dá)可增加小鼠壽命,是目前公認(rèn)的“長壽蛋白”[16]。Sirt6位于人類19號染色體13.3端,有兩個(gè)異構(gòu)體,分別由8個(gè)外顯子和7個(gè)外顯子編碼355和328個(gè)氨基酸長度的蛋白。Sirt6蛋白結(jié)構(gòu)由高度保守的核心催化區(qū)、N端組蛋白去乙酰化酶功能區(qū)及C端核定位信號組成。Sirt6的空間結(jié)構(gòu)包含1個(gè)由氫鍵連接的鋅指蛋白結(jié)合域及Rossman折疊區(qū)共同維持Sirt6空間構(gòu)象的穩(wěn)定性[17]。Sirt6可以通過抑制腎臟炎癥、纖維化、促進(jìn)自噬參與足細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)和腎功能的維持[9,18]。最近研究發(fā)現(xiàn),Sirt6參與DN的發(fā)生及發(fā)展過程[8,15,19],但其在LN中的作用尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn),Sirt6陽性染色均勻分布在腎小球、腎小管及腎間質(zhì)中,且主要分布在腎小球細(xì)胞核中,與LIU等[20]研究結(jié)果相一致。推測腎組織Sirt6可能在細(xì)胞核和細(xì)胞漿中穿梭,其定位主要取決于細(xì)胞類型或環(huán)境因素。

本文研究結(jié)果顯示,與對照組相比,LN病人腎組織Sirt6表達(dá)降低,且LN活動(dòng)組較非活動(dòng)組降低更明顯;Sirt6表達(dá)水平與足細(xì)胞Nephrin表達(dá)呈正相關(guān),而且Sirt6表達(dá)水平與24hUP、SLEDAI評分、ESR明顯負(fù)相關(guān),與ALB、C3正相關(guān)。提示Sirt6參與LN足細(xì)胞的損傷,其表達(dá)水平可能與疾病活動(dòng)性有關(guān)。既往研究發(fā)現(xiàn),Sirt6通過去乙?；M蛋白H3K9抑制Notch1、Notch4信號轉(zhuǎn)錄,發(fā)揮抗炎、抗凋亡及促進(jìn)自噬的作用保護(hù)足細(xì)胞[20]。還有研究指出,Sirt6通過上調(diào)Bcl-2和CD206的表達(dá)、降低Bax和CD86的表達(dá),激活巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化,保護(hù)足細(xì)胞免受高糖誘導(dǎo)的損傷[21]。因此猜測,Sirt6在LN中也可能通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化參與足細(xì)胞的損傷。今后將擴(kuò)大樣本量,進(jìn)行體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討Sirt6在LN病人足細(xì)胞損傷中的具體作用。

綜上所述,LN病人腎組織Sirt6的表達(dá)明顯降低,且與足細(xì)胞Nephrin表達(dá)正相關(guān),與疾病活動(dòng)性負(fù)相關(guān)。Sirt6在LN足細(xì)胞損傷中的發(fā)病機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。