一氧化氮與肺動脈高壓及基于一氧化氮信號通路的肺動脈高壓治療藥物研究進展

劉賽利，艾可龍，胡長平，2，3

（1.中南大學湘雅藥學院藥理學系，湖南 長沙 410078；2.長治醫學院藥學系，山西 長治 046000；3.心血管研究湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410078）

肺動脈高壓（pulmonary hypertension，PH）是一種進行性肺血管疾病，當機體受到膠原血管病、先天性心臟病、門脈高壓、艾滋病、藥物和毒素等多種因素威脅時，會導致肺血管損傷，肺血管內皮功能發生障礙［1］，血管舒張因子如一氧化氮（nitric oxide，NO）和前列腺素I2（prostaglandin I2，PGI2）產生減少，而血管收縮因子如血栓素A2（thromboxane A2，TXA2）和內皮素1（endothelin-1，ET-1）產生增多，打破肺血管舒張和收縮平衡，導致肺動脈平滑肌細胞（pulmonary artery smooth muscle cells，PASMC）的異常增殖和早期內膜增生。在PH 發展進程中，肺動脈管腔逐漸變窄，肺動脈阻力逐漸變大；在疾病進展晚期，叢狀病變和原位血栓形成使肺血管腔閉塞，右心后負荷增大導致右心肥大，之后出現右心衰竭最終導致死亡［2-3］。2018 年，世界肺動脈高壓大會調整PH 的最新診斷標準為靜息時平均肺動脈壓（mean pulmonary arterial pressure，mPAP）≥20 mmHg，肺動脈楔壓≤15 mmHg，以及肺血管阻力（pulmonary vascular resistance，PVR）＞2 WOOD單位［4］。

自1987 年發現內皮衍生松弛因子NO 后，這種無色無味的氣體在人類生理和疾病研究中占據著越來越重要的地位［5-6］。NO 是一種自分泌和旁分泌信號分子，其功能包括松弛平滑肌、抑制血小板聚集、介導中樞和自主神經傳遞、裂解腫瘤細胞、殺滅細菌和刺激激素釋放等［7-8］。本文概述NO 的來源、舒血管作用機制及其在PH 病理生理中的作用，和目前正在研究的針對PH 中NO 信號通路的靶向治療藥物，特別是納米載體藥物的研究進展。

1 NO的來源及其舒張血管作用機制

在血管壁中，NO 主要是在內皮細胞由L-精氨酸和分子氧經內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）催化合成［9］。NO 也可通過亞硝酸鹽還原生成，這種不依賴NOS 的NO形成途徑首次在缺血心肌組織中被發現，在酸性和低氧條件下更易發生，后來被證明有助于調節機體血液流動和血壓［10］。生理條件下，NO 一經產生即迅速擴散到血管平滑肌細胞中，激活可溶性鳥苷酸環化酶（soluble guanylate cyclase，sGC），催化GTP轉化為第二信使環磷酸鳥苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP），后者激活cGMP 依賴的蛋白激酶G（protein kinase G，PKG）使血管舒張，并抑制血管平滑肌細胞增殖和血小板聚集。肺血管平滑肌細胞中的磷酸二酯酶（phosphodiesterases，PDE），尤其是PDE5，通過水解將cGMP 轉化為5-GMP 使其失活，從而呈現反調節功能［11-12］。PH 時超氧陰離子產生增多，導致eNOS 關鍵輔酶因子四氫生物蝶呤氧化，使eNOS 解偶聯，NO 產生減少；且NO 會迅速與超氧陰離子反應形成過氧亞硝酸鹽（peroxynitrite anion，ONOO-），其可與組織中酪氨酸結合，產生脂質過氧化作用和細胞毒性作用，導致細胞凋亡或壞死；且可引起PKG 硝化，NO 生物利用度降低，導致血管收縮和平滑肌細胞異常增殖［13-14］。

2 靶向NO/sGC/cGMP 信號通路治療肺動脈高壓的藥物

目前針對NO/sGC/cGMP 信號通路的PH 靶向治療藥物主要有3種，分別是PDE5抑制劑、sGC 激動劑和吸入性NO。

2.1 PDE5抑制劑

迄今為止，成功增強NO/sGC/cGMP 信號通路的方法是使用PDE5抑制劑阻止細胞內cGMP水解代謝［15］。常用的PDE5抑制劑包括西地那非（sildenafil）、他達那非（tadalafil）和伐地那非（vardenafil）等。此類藥物對肺循環血管床的擴張程度遠大于體循環血管床。西地那非可抑制登山者肺血管平滑肌增殖和低氧性肺動脈壓升高，亦能降低PH 患者PVR，減輕突然停止吸入NO后的反彈性PH。在安慰劑對照試驗中，西地那非可改善PH 患者6 min步行距離，2005 年被美國FDA 批準用于治療成人PH［16］。西地那非也被用于治療新生兒、嬰兒和兒童PH 以及多種心肺疾病相關的PH［17］。由于細胞內cGMP 是由NO 與sGC 中的血紅素鐵結合促進形成的，NO 缺失可導致cGMP 缺失［10］。理論上，PDE5 抑制劑會隨著cGMP 合成減少而失效。因此，對于NO/sGC/cGMP 信號通路受損的PH 患者，其療效可能有限。

2.2 sGC激動劑

sGC 是目前唯一已知的NO 受體，可被NO 激活催化GTP 轉化為第二信使cGMP。在PH 患者肺動脈中，sGC 因NO 生物利用度降低、活性氧的產生、氧化應激引起的血紅素-鐵氧化導致的sGC 氧化以及相關的血紅素組酶的丟失而功能降低［18］。由于PDE5 抑制劑治療效果取決于基線NO 水平，而基線NO水平在PH患者中降低，因此直接作用于sGC 的治療可能比PDE5 抑制劑對NO 通路受損的PH 患者療效更好。利奧西呱（riociguat）是由拜耳公司研發的sGC 激動劑，可直接激活sGC，也能穩定NO-sGC 結合，從而上調第二信使cGMP，顯著提高PH 患者的運動耐量，改善血流動力學參數和心功能［19-21］。利奧西呱已于2013 年10 月8 日獲美國FDA批準用于治療慢性血栓栓塞性PH［22］。

2.3 吸入性NO

吸入性NO 是一種選擇性肺血管舒張劑，可在不影響心臟指數和全身血管阻力的情況下，顯著降低mPAP 和PVR，提高動脈氧水平，降低體外膜式氧合需要，可通過氣管插管、面罩持續吸入或脈沖鼻給藥［23］。對于吸入性NO 治療有效的PH 患者，突然停藥時會出現PAP 和PVR 顯著上升以及心排血量和血氧飽和度明顯下降等反跳現象，部分患者癥狀輕，經吸氧等治療后可緩解，重者可危及生命。造成這種反跳現象的原因可能與吸入NO 對內源性NO 合成減少和（或）ET-1 水平升高有關［24］。治療時應緩慢逐漸停藥，并根據血氧飽和度、血壓和患者的癥狀調整停藥速度。在持續給予NO 的過程中，NO 氧化產物二氧化氮（nitrogen dioxide，NO2）可在低濃度時積聚并引起氣道亢進，高濃度時引起肺水腫；NO 可與血紅蛋白結合生成亞硝酸血紅蛋白，繼而迅速氧化形成高鐵血紅蛋白，后者在循環中濃度過高可導致組織產生嚴重的低氧血癥［21，24］。故其應用過程需嚴格控制NO 輸送的濃度及速度，并實時監測毒性產物NO2的濃度。這需要一系列復雜的輸送及監測設備，包括氣瓶、壓力調節器、監測儀和呼吸機等設備，以及訓練有素的呼吸治療師［25-26］；成本高、需實時監測且需負擔笨重的氣體處理設備，阻礙了吸入性NO 的廣泛使用。目前，吸入性NO主要用于新生兒持續性PH及圍手術期PH的治療［21］。

3 NO供體的舒血管作用

吸入性NO 由于其輸送的復雜性，其使用幾乎僅限于PH 患者重癥監護環境。NO 供體是外源性給藥后在體內釋放NO，補充內源性NO 不足，可為PH 日常治療提供潛在可能性。代表性的NO 供體包括有機硝酸鹽、金屬亞硝基化合物、亞硝酸鹽、N-重氮鎓二酸鹽（NONOate）。

3.1 有機硝酸鹽

有機硝酸鹽，如硝酸甘油、硝酸異山梨酯和單硝酸異山梨酯，是具有硝酸酯（-O-NO2）基團的前藥，在血管平滑肌細胞中經過線粒體的乙醛脫氫酶及內質網中的細胞色素P450 酶等系統進行代謝后釋放NO［27］。該類藥物存在較高的選擇性，只有在靜脈等乙醛脫氫酶含量豐富的血管平滑肌中才能釋放NO，在大動脈中作用較差，在冠狀動脈大血管中有一定作用，但在小動脈中則基本不釋放NO。其短時間內即可快速起效，但連續用24 h 可產生耐藥性，可應用于高血壓危重癥患者的搶救［28］。

3.2 金屬亞硝基化合物

NO 是金屬離子的強配體，在金屬的配位域中占主導地位，NO 與金屬離子結合形成金屬亞硝基化合物，可作為NO 的供體。目前研究最多的金屬亞硝基化合物是硝普鈉（sodium nitroprusside，SNP）［29］。SNP 是由1 個亞鐵離子中心與5 個氰基基團和1 個亞硝基組成的無機鹽，入血后可直接降解為亞硝酸鹽，在血液中即可自發釋放NO，無需進入平滑肌細胞代謝，其作用靶點無選擇性，可引起全身性低血壓，同時釋放氰化物，故接受硝普鈉治療的患者必須監測氰化物中毒癥狀，如精神狀態改變、癲癇發作和代謝性酸中毒等。SNP 作用迅速，降壓作用強大，但半衰期很短，其效果在1～2 min內消失，目前主要應用于高血壓危重癥患者的搶救［30-31］。

3.3 亞硝酸鹽

研究表明，血漿中硝酸鹽和亞硝酸鹽水平在PH 等內皮功能障礙疾病中較低［32］；亞硝酸鹽和硝酸鹽是NO 代謝的氧化產物，亞硝酸鹽可以敏感地反映eNOS 活性的急性變化［33］。通過補充亞硝酸鹽可以還原得到NO，調節血管內皮功能。吸入霧化的亞硝酸鈉已被證明可以在脫氧血紅素的亞硝酸鹽還原酶作用下釋放NO，產生選擇性的、持續的肺血管舒張作用，改善低氧引起的動物和人類PH，其作用維持時間比吸入性NO 長，而血液高鐵血紅蛋白水平無顯著升高［34-35］。亞硝酸鹽和硝酸鹽的血管舒張作用弱于有機硝酸鹽（硝酸甘油）和金屬亞硝基化合物（硝普鈉），但不像有機硝酸鹽產生快速耐受和顯著的全身血管舒張作用［36］。

3.4 N-重氮鎓二酸鹽

NONOate 是研究最廣泛的NO 供體之一。NONOate 一般由仲胺與氣態NO 在高壓下反應合成，該方法可以合成從小分子到聚合物的各種壬酸鹽，如二乙烯三胺/NO（DETA/NO）、精胺壬酸鹽（SPER/NO）、脯氨酸壬酸鹽（PROLI/NO）、丙胺丙胺壬酸鹽（PAPA/NO）等［37］。NONOate不需要任何激活機制，在生理pH 下便可以通過水解自發釋放NO［38］。研究發現，在PH 豬模型中，經NONOates氣霧劑治療后，可改善氧合并顯著降低PVR，同時不引起顯著的全身毒性［39］。然而，這種快速的NO釋放作用時間短，且對特定器官、組織或細胞類型的選擇性有限，限制了其在臨床的潛在治療應用。

4 NO 及其供體納米遞送系統對肺動脈高壓的潛在治療作用

為實現NO 持續、受控釋放和靶點特異性，目前大量科研人員致力于開發新的載體系統遞送NO 供體，為其應用于PH的日常給藥治療提供可能。

4.1 納米粒子直接遞送NO氣體

Huang等［40］采用加壓冷凍法將NO氣體和氬氣（Ar）包封于含磷脂和膽固醇的回聲脂質體（echogenic liposomes，ELIP）中（NO/Ar-ELIP），可保護和輸送NO 到靶組織，具有氣體輸送可視化和控制治療性氣體釋放的潛力。Ar的加入可以防止NO與氧氣反應生成NO2，并可通過調節其與NO 的比例從而調節NO 的釋放速率，延長NO 在體內的釋放時間。NO/Ar-ELIP 體外釋放譜顯示，脂質體釋放NO 的速度較慢，可形成持續的釋放譜。此外，NO/Ar-ELIP 能保護NO 不受血紅蛋白等微環境清道夫的侵害，體外培養的大鼠PASMC 與NO/Ar-ELIP 孵育時，PASMC 攝取的NO 比給予游離NO 時增加7 倍，且未顯示任何毒性。NO/Ar-ELIP 具有回聲性，可增強超聲造影成像，監測NO/Ar-ELIP 在體內的遞送過程，且可通過使用高頻率超聲實現NO/Ar-ELIP 在特定組織可控釋放NO。

4.2 基于亞硝酸鹽的NO遞送系統

Mohamed 等［41］開發了一種新型水凝膠狀聚合物復合納米顆粒用于遞送NO，即以亞硝酸鹽作為NO 供體，復合水凝膠型聚合物制成NO 釋放納米顆粒（NO-releasing nanoparticles，NO-RNP）。NO-RNP 的NO 釋放動力學結果顯示，其約在120 min 達到峰值，并持續釋放8 h 以上，選擇性地靶向低氧誘導的PH 小鼠肺動脈，并產生濃度依賴性的肺血管松弛作用，對內皮細胞的活性和炎癥反應均無影響。

4.3 基于NONOate的NO遞送系統

NONOate 具有較高的NO 負載能力，每摩爾NONOate 功能化分子可以釋放2 摩爾NO。然而，NONOate 中NO 分子不受控制的自發釋放限制了其臨床應用潛力。為克服NONOate 中NO 的釋放缺陷，研究者采用了幾種策略，包括將NONOate 偶聯到大分子支架中或物理封裝到載體系統內。最近，Nahar 等［42］開發了一種長效NO 供體的肽修飾脂質體，即將DETA/NO 包封在經歸位肽修飾的脂質體中。硫酸肝素是一種參與炎癥過程的內源性物質，主要聚集在肺血管系統PH 病灶中，作為歸位肽的配體，可引導DETA/NO 歸位肽修飾的脂質體靶向肺血管并釋放NO，引起肺血管特異性舒張，在不改變體循環血管壓力的情況下可降低肺動脈壓力。該脂質體半衰期為27 h，較長的半衰期可降低持續吸入的需求，并減少PH 反彈的發生率。以上研究表明，開發NO納米遞送系統對PH的藥物治療具有重大意義。

5 結語

NO 是調節肺血管功能的關鍵信號分子，其生物利用度降低可導致PH 的發生發展。目前針對NO 通路的特異性治療藥物對PH 患者的運動能力和肺血流動力學有一定的改善作用，但由于藥物生物利用度低，靶向性差，不良反應多，患者的長期生存狀況仍不理想。NO 供體普遍存在水中穩定性差、釋放不受控、靶向性差等問題，限制了其對PH 的治療應用。因此，為實現NO 持續、受控釋放和靶點特異性，目前大量科研人員致力于開發新的載體系統遞送NO 供體。迄今為止，通過將NO 供體與功能納米材料結合作為載體，已經開發出了一些NO 釋放納米平臺，體外和體內研究均表明，與游離NO 供體相比，NO 釋放納米平臺可持續穩定地釋放NO，選擇性地靶向肺動脈，在PH 的日常給藥治療方面具有較大的應用潛力。然而，從納米療法的基礎研究向臨床試驗轉化的挑戰仍有待解決，納米載體對治療藥物的遞送仍處于早期階段，在實際應用中存在諸多不足，如納米藥物在粒徑、穩定性、溶解度、藥物釋放和無菌性方面細微變化的可控和可重復制造仍然是一個挑戰。同時，納米藥物在人體中的長期毒性和功效是否與動物模型的結果一致尚未得到證實?？傊?，需要進一步研究以優化納米材料在PH中的應用。