原發(fā)性膽汁性膽管炎伴抑郁小鼠的肝腸損傷及腸黏膜中ZO-1的表達(dá)變化

張紫陽(yáng)，王晶

1.包頭醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014040；2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，內(nèi)蒙古包頭 014031

原發(fā)性膽汁性膽管炎（primary biliary cholangitis，PBC）曾稱“原發(fā)性膽汁性肝硬化”，是一組因自身免疫破壞肝內(nèi)膽管并形成膽汁淤積性肝病[1-2]。本病臨床表現(xiàn)因個(gè)體差異而不同，多數(shù)患者發(fā)病初期并無(wú)臨床表現(xiàn)，部分患者可出現(xiàn)疲乏、惡心、腹瀉、上腹部不適等非特異性臨床癥狀及倦怠、抑郁、記憶力下降等中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀[3]。其中，抑郁作為一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀在PBC 患者中較為常見。國(guó)內(nèi)外研究表明，腸道黏膜屏障與多種肝病的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[4]。腸道黏膜屏障主要包括生物、機(jī)械、免疫及化學(xué)屏障，其中機(jī)械屏障中閉鎖小帶蛋白1（zonula occludens protein 1，ZO-1）是腸黏膜屏障中的重要組成成分，ZO-1 在腸道中的表達(dá)情況反映腸道損傷程度[5]。另有研究發(fā)現(xiàn)，胃腸道疾病與腸–腦軸關(guān)系密不可分，1996年WOOD 提出中樞神經(jīng)系統(tǒng)及胃腸道功能可通過(guò)多種途徑進(jìn)行雙向調(diào)控，通過(guò)既往研究推測(cè)腸–腦軸的相互作用有望成為改變腸道功能的治療手段[6]。本研究通過(guò)建立PBC 伴抑郁模型初步探究腸–腦軸的相互影響及腸–肝軸的相互作用，以期為PBC 的臨床防治工作提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用24 只6 周齡雌性C57BL/6 小鼠[許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010]，體質(zhì)量（16±1）g。本研究經(jīng)內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)（倫理審批號(hào)：ZX-012）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 0.1%3,5-二乙氧基羰基-1,4-二氫-2,4,6-三甲基吡啶（3,5-diethyloxycarbonyl-1,4-dihydro-2,4,6-trimethylpyridine，DDC）[許可證號(hào)：SCXK（京）2018-0006]；鹽酸氯米帕明（clomipranine hydrochloride）化學(xué)單體（規(guī)格：500mg，CAS：17321-77-6），純度99.14%，購(gòu)自北京瀚海拓新生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要試劑 胞質(zhì)閉鎖小帶蛋白（生產(chǎn)批號(hào)：bs-23835R，生產(chǎn)單位：北京博奧森生物技術(shù)有限公司）、抗體稀釋液（生產(chǎn)批號(hào)：C01-04001，生產(chǎn)單位：北京博奧森生物技術(shù)有限公司）、即用型免疫組化UltraSensitiveTMSP 試劑（鼠/兔）檢測(cè)試劑盒（生產(chǎn)批號(hào)：KIT-9710，生產(chǎn)單位：福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）、PBS（生產(chǎn)批號(hào)：PBS-0060，生產(chǎn)單位：福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）、DAB（二氨基聯(lián)苯胺）顯色試劑盒（生產(chǎn)批號(hào)：DA1010，生產(chǎn)單位：北京索萊寶科技有限公司）、抗原修復(fù)液（生產(chǎn)批號(hào)：C1034，生產(chǎn)單位：北京索萊寶科技有限公司）。

圖1 4 組小鼠的肝組織病理學(xué)表現(xiàn)（HE 染色，×200）

圖2 4 組小鼠的腸組織病理學(xué)表現(xiàn)（HE 染色，×200）

圖3 ZO-1 在4 組小鼠的腸組織免疫組化表現(xiàn)（×400）

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組及造模 24 只小鼠正常喂養(yǎng)7d 后，隨機(jī)分為4 組：對(duì)照組、PBC 組、PBC+抑郁組、PBC+抑郁+腹腔注射氯米帕明組，每組6 只。根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)組造模需求，抑郁組小鼠在適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后采用慢性不可預(yù)知的輕度刺激方式（隨機(jī)采用搖尾、束縛、熱水浴、濕籠、冷水浴、鼠籠傾斜、禁飲、禁食）干預(yù)[7]；PBC 組小鼠于抑郁刺激1 周后同時(shí)給予含0.1%DDC 飼料飲食8 周，根據(jù)文獻(xiàn)選用腹腔注射方式給予小鼠氯米帕明干預(yù)[8-10]。腹腔注射模型組小鼠于PBC 造模第9 周時(shí)于每日同一時(shí)間給予腹腔內(nèi)注射氯米帕明7.5mg/kg 共2 周以誘導(dǎo)模型。對(duì)照組小鼠給予同劑量維持飼料、生理鹽水。造模完成后處死小鼠，處死前測(cè)量小鼠最終體質(zhì)量并分析是否存在差異以判斷造模情況，采集小鼠的肝組織及腸組織，用生理鹽水沖洗干凈，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 常規(guī)病理染色 將小鼠的肝組織和腸組織切成適當(dāng)小塊，將需觀察的組織進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋形成蠟塊，切片厚度3μm，切片經(jīng)二甲苯、梯度乙醇脫蠟脫水，先蘇木精染核、分化、反藍(lán)，最后伊紅染質(zhì)，干燥封片，置顯微鏡下拍照、觀察。

1.2.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 腸組織切成適當(dāng)小塊，將組織固化后用石蠟包埋法制成蠟塊，切片厚度為3μm，75℃烤片脫蠟、組織脫水、抗原修復(fù)，流水沖洗阻斷，放至室溫，滅活過(guò)氧化物酶及非特異染色，隨后加一抗：胞質(zhì)ZO-1（1∶100），4℃過(guò)夜，取出復(fù)溫后加入二抗并標(biāo)記二抗，使用DAB 染色至適當(dāng)，蒸餾水沖洗、復(fù)染、乙醇分化、酒精脫水，晾干，蓋玻片封片。光鏡低倍鏡下瀏覽整張切片，選擇高表達(dá)區(qū)，改用高倍鏡隨機(jī)選擇3 個(gè)及以上視野拍照，并用Image pro Plus 軟件半定量測(cè)量法計(jì)算切片累計(jì)吸光度值，用于結(jié)果判定[11]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組之間的比較采用單因素方差分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠的體質(zhì)量分析

與對(duì)照組小鼠的體質(zhì)量[（20.55±1.20）g]比較，其余各組小鼠的體質(zhì)量均明顯下降（P<0.05）；PBC+抑郁組小鼠的體質(zhì)量[（16.01±1.05）g]較PBC 組小鼠[（18.45±1.44）g]減輕（P<0.05）；PBC+抑郁+腹腔注射氯米帕明組小鼠的體質(zhì)量[（18.14±0.85）g]較PBC+抑郁組小鼠明顯升高（P<0.05）。

2.2 肝組織病理學(xué)比較

對(duì)照組小鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞放射狀排列形成肝板，肝竇內(nèi)未見充血，門靜脈區(qū)未見明顯炎性反應(yīng)，膽管結(jié)構(gòu)正常。PBC 組可見肝臟炎性細(xì)胞增多，并伴有膽管擴(kuò)張及少量膠原沉積。PBC+抑郁組可見肝小葉結(jié)構(gòu)顯著破壞，大量炎癥細(xì)胞增生、膽管增生并擴(kuò)張，膽管內(nèi)出現(xiàn)膽汁及肝臟膠原纖維沉積。PBC+抑郁+腹腔注射氯米帕明組小鼠的肝臟病理?yè)p傷較PBC+抑郁組明顯減輕，見圖1。

2.3 腸組織病理學(xué)比較

對(duì)照組小鼠的腸黏膜未見損傷，絨毛整齊，腺體結(jié)構(gòu)正常。PBC 組、PBC+抑郁組、PBC+抑郁+腹腔注射氯米帕明組小鼠的腸黏膜可見不同程度病理?yè)p害，PBC 組小鼠的腸黏膜絨毛稀疏、變細(xì)、萎縮且排列雜亂，偶可見腺體變形萎縮、上皮及固有層間隙增大、分離。PBC+抑郁組小鼠的腸黏膜結(jié)構(gòu)出現(xiàn)較嚴(yán)重病理?yè)p傷，絨毛稀疏且高度降低，并呈現(xiàn)不同程度的壞死、脫落、萎縮，排列雜亂，腺體出現(xiàn)明顯的變形萎縮，大量炎癥細(xì)胞匯聚在黏膜下層，并見上皮及固有層間隙增大，可至中度分離。PBC+抑郁+腹腔注射氯米帕明組小鼠的腸黏膜損傷較PBC+抑郁組減輕，可見腸黏膜絨毛排列雜亂，伴少量絨毛頂端脫落、上皮下間隙增大，見圖2。

2.4 腸組織免疫組織化學(xué)染色比較

光鏡顯示對(duì)照組小鼠的腸黏膜中ZO-1 均勻、連續(xù)分布在細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中，并在整張切片中表達(dá)為強(qiáng)陽(yáng)性，累計(jì)吸光度值（109.68±16.15）；PBC 組、PBC+抑郁組、PBC+抑郁+腹腔注射氯米帕明組小鼠的ZO-l 分布不均，呈淺棕色，細(xì)胞邊緣線狀信號(hào)模糊不清，ZO-1 累計(jì)吸光度值分別為（33.16±4.69）、（17.45±2.67）、（39.86±1.80）；PBC 組、PBC+抑郁組、PBC+抑郁+腹腔注射氯米帕明組小鼠的ZO-1累計(jì)吸光度值均明顯低于對(duì)照組小鼠（P<0.01）；PBC+抑郁組小鼠的ZO-1 累計(jì)吸光度值低于PBC 組小鼠（P<0.01）；PBC+抑郁+腹腔注射氯米帕明組小鼠的ZO-1 累計(jì)吸光度值高于PBC+抑郁組小鼠（P<0.01），見圖3。

3 討論

PBC 的發(fā)生、發(fā)展與腸道黏膜屏障功能關(guān)系密切已被廣泛認(rèn)可。腸道及肝臟的胚胎起源相同，這可更好地解釋兩者間相互影響共同維持機(jī)體穩(wěn)定。Marshall[12]最早提出腸–肝軸概念并被廣泛接受，強(qiáng)調(diào)腸道結(jié)構(gòu)或功能異常可影響膽汁酸進(jìn)入腸道，破壞腸道菌群正常繁殖并激活腸道免疫反應(yīng)，腸道產(chǎn)生的非正常衍生物通過(guò)血液循環(huán)或淋巴系統(tǒng)進(jìn)入遠(yuǎn)隔器官如肝臟，大量有害物質(zhì)超出肝臟的解毒處理能力，引起繼發(fā)性肝損傷和肝內(nèi)免疫系統(tǒng)的紊亂。膽汁淤積會(huì)進(jìn)一步損傷肝臟，加重膽汁淤積，影響膽汁酸的腸–肝軸循壞，造成腸道菌群紊亂，腸道細(xì)菌的異常繁殖導(dǎo)致腸黏膜屏障功能進(jìn)一步受損[13-14]。腸黏膜細(xì)胞間連接主要包括黏附型連接、緊密型連接及縫隙型連接。緊密連接蛋白中的跨膜蛋白及胞漿蛋白共同維持腸黏膜屏障功能，ZO-1 作為胞漿蛋白的代表充當(dāng)腸黏膜細(xì)胞間的骨架成分并與跨膜蛋白互相連接，使腸細(xì)胞連接形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)而更加穩(wěn)定[15-16]。本研究通過(guò)構(gòu)建膽汁淤積型肝損傷模型證實(shí)肝功能受損與腸道黏膜屏障及ZO-1的表達(dá)關(guān)系密切。正常情況下，ZO-1 均勻、連續(xù)分布在腸細(xì)胞的質(zhì)或膜中并呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，如本實(shí)驗(yàn)中的對(duì)照組。當(dāng)膽汁淤積時(shí)，腸道菌群紊亂及腸道通透性增加，致使緊密連接被破壞表現(xiàn)為腸道中ZO-1 表達(dá)下調(diào)，在切片中觀察到ZO-1 呈現(xiàn)弱陽(yáng)性且斷續(xù)、不均勻分布于腸細(xì)胞的膜及質(zhì)中。

目前的科學(xué)研究已證實(shí)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的負(fù)性情緒與胃腸道之間存在相互作用。一方面，負(fù)性情緒包括焦慮、抑郁等均可使人體發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)影響機(jī)體的腸道通透性，降低腸道黏膜屏障功能，激活腸黏膜免疫反應(yīng)并導(dǎo)致腸道菌群紊亂，引發(fā)機(jī)體炎癥發(fā)生；另一方面腸道黏膜屏障受損或腸道菌群失衡通過(guò)作用于神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及內(nèi)分泌系統(tǒng)等多種途徑影響大腦的結(jié)構(gòu)和功能導(dǎo)致行為異常[17]。研究顯示抑郁癥患者的腸道菌群構(gòu)成與健康志愿者存在明顯差異[18]。5-羥色胺作為一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)被廣泛研究，其在腸道微生物–腸–腦軸中占據(jù)重要地位[19]。PBC 患者較易并發(fā)抑郁癥狀，本實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建PBC 伴抑郁小鼠模型并采用鹽酸氯米帕明降低5-羥色胺再攝取以改善抑郁癥狀，從而改善腸道菌群失調(diào)及腸道黏膜屏障功能，進(jìn)而通過(guò)腸–肝軸的相互作用改善肝臟損傷。本研究結(jié)果顯示PBC+抑郁小鼠的肝腸病理?yè)p傷嚴(yán)重，與免疫組化檢測(cè)ZO-1 表達(dá)結(jié)果一致，PBC+抑郁+腹腔注射氯米帕明組小鼠的ZO-1表達(dá)較PBC+抑郁組小鼠明顯上調(diào)，說(shuō)明抗抑郁治療可改善腸道功能，修復(fù)腸黏膜屏障。

綜上所述，本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)膽汁淤積型肝損傷同時(shí)損傷腸道黏膜屏障，且抑郁小鼠的腸道損傷進(jìn)一步加重。改善抑郁癥狀可使腸黏膜中ZO-1 表達(dá)上調(diào)，通過(guò)改變緊密連接蛋白的表達(dá)和分布而影響腸黏膜通透性及腸道黏膜屏障功能，進(jìn)而通過(guò)腸–肝軸改善肝臟功能。本研究的局限性在于并未進(jìn)行腸道微生態(tài)及腸–腦軸的作用機(jī)制研究。