大豆皂苷調(diào)控miR-584-5p/HDAC1通路對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響

帥仁亞，李晴宇，范敏慧，徐煒

1.杭州市腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部，浙江杭州 310002；2.杭州市第一人民醫(yī)院吳山院區(qū)藥學(xué)部，浙江杭州 313000；3.杭州市腫瘤醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合腫瘤科，浙江杭州 310002

子宮內(nèi)膜癌（endometrial cancer，EC）近年來(lái)發(fā)病率逐年增高，對(duì)廣大女性健康造成極大威脅[1-2]。組蛋白去乙酰化酶1（histone deacetylase1，HDAC1）屬于一種致癌因子，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，在肝細(xì)胞癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜腫瘤等多種腫瘤組織及細(xì)胞中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，下調(diào)其表達(dá)可顯著抑制肝癌、乳腺癌與神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖，發(fā)揮很好的抗癌活性[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA-584?5p（microRNA-584?5p，miR-584?5p）是一種具有抑癌活性的微小RNA，在髓母細(xì)胞瘤、非小細(xì)胞肺癌和胃癌等癌組織中低表達(dá)，上調(diào)miR?584?5p 表達(dá)可顯著抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，誘導(dǎo)髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞DNA 損傷和凋亡，這表明miR-584-5p/HDAC1 通路可作為潛在的EC 治療靶點(diǎn)[5-7]。大豆皂苷具有抗癌、增強(qiáng)免疫力等藥理功效，可減輕腫瘤耐藥及血管新生，抑制癌細(xì)胞增殖并促使其凋亡，發(fā)揮較強(qiáng)的抗腫瘤作用，因而推測(cè)大豆皂苷可防治EC[8-9]。本研究通過(guò)體外培養(yǎng)EC 細(xì)胞系HEC-1-A，探討大豆皂苷調(diào)控miR-584-5p/HDAC1通路對(duì)EC 細(xì)胞增殖及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與細(xì)胞

人EC 細(xì)胞系HEC-1-A（武漢普諾賽生命科技有限公司）；大豆皂苷[純度高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）≥98%，批號(hào)：51330-27-9，上海吉至生化科技有限公司]；高效放射免疫沉淀測(cè)定（radio-immune precipitation assay，RIPA）裂解液、總RNA 提取試劑盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒、實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)主混合物（SYBR green real time PCR master mix）、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（cell counting Kit-8，CCK-8）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、膜聯(lián)蛋白-V（annexin V）-熒光素異硫氰酸酯（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）/碘化丙啶（propidine iodide，PI）凋亡檢測(cè)試劑盒、DMEM 培養(yǎng)基（含雙抗）、LipofectamineTM2000、優(yōu)級(jí)胎牛血清（北京索萊寶科技有限公司）；兔源B 淋巴細(xì)胞瘤-2 相關(guān)X 蛋白（B-cell lymphoma-2-associated X protein，Bax）抗體、兔源β-actin 抗體、兔源增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗體、兔源天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶9（cysteine-containing aspartatespecific proteases 9，caspase-9）抗體、羊抗兔二抗、兔源HDAC1 抗體（美國(guó)Abcam 公司）等。

1.2 主要儀器

全波長(zhǎng)全自動(dòng)酶標(biāo)儀（瑞士Tecan 公司，型號(hào)：M200 PRO）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司，型號(hào)：CytoFLEX）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 系統(tǒng)（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，型號(hào)：ABI 7500）；蛋白電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)伯樂(lè)公司，型號(hào)：Mini-PROTEAN Tetra、Power-pac 3000）；凝膠成像系統(tǒng)（法國(guó)威爾勃公司，型號(hào)：INFINITY 3026）等。

1.3 HEC-1-A 細(xì)胞培養(yǎng)并檢測(cè)半數(shù)抑制濃度

快速?gòu)?fù)蘇人EC 細(xì)胞系HEC-1-A，以細(xì)胞培養(yǎng)液（DMEM 培養(yǎng)基+10%優(yōu)級(jí)胎牛血清）混勻后接種培養(yǎng)，傳代后接種在96 孔板，每孔細(xì)胞約1×104個(gè)，培養(yǎng)過(guò)夜后，將大豆皂苷溶于DMEM 培養(yǎng)基中，配制為1.6mg/ml 的儲(chǔ)備液，分別以終濃度0μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、120μg/ml、160μg/ml 的大豆皂苷處理，每組濃度設(shè)6 個(gè)重復(fù)孔，并取6 個(gè)不接種細(xì)胞的培養(yǎng)孔，作空白對(duì)照（空白組）[10]。48h 后加入CCK-8，同時(shí)換新細(xì)胞培養(yǎng)液，3h 后通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度（450nm 波長(zhǎng)），計(jì)為A 值，計(jì)算細(xì)胞活力及評(píng)測(cè)半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值，細(xì)胞活力=（實(shí)驗(yàn)組A 值–空白組A 值）/（對(duì)照組A 值–空白組A 值）×100%。

1.4 細(xì)胞分組處理及樣品收集

根據(jù)1.3 中HEC-1-A 細(xì)胞IC50值，選擇100μg/ml的大豆皂苷濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取傳代HEC-1-A 細(xì)胞接種在24 孔板，隨機(jī)分為對(duì)照組、大豆皂苷組、miR-584-5p 抑制劑組、大豆皂苷+miR-584-5p 抑制劑組、大豆皂苷+miR-584-5p 抑制劑陰性對(duì)照組，大豆皂苷組、大豆皂苷+miR-584-5p 抑制劑組及大豆皂苷+miR-584-5p 抑制劑陰性對(duì)照組細(xì)胞以終濃度100μg/ml 的大豆皂苷處理，同時(shí)miR-584-5p 抑制劑組、大豆皂苷+miR-584-5p 抑制劑組、大豆皂苷+miR-584-5p 抑制劑陰性對(duì)照組參照說(shuō)明書(shū)指導(dǎo)步驟及參考文獻(xiàn)以miR-584-5p 抑制劑、miR-584-5p 抑制劑陰性對(duì)照對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，48h 后收集各組細(xì)胞，重復(fù)操作3 次，收集3 份細(xì)胞[11]。

1.5 各組細(xì)胞增殖檢測(cè)

取傳代HEC-1-A 細(xì)胞接種在96 孔板，以1.4 中的方法分組處理后，按照1.3 中CCK-8 實(shí)驗(yàn)步驟檢測(cè)出各組細(xì)胞活力。

1.6 各組細(xì)胞凋亡檢測(cè)

以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）分別重懸1.4 中收集的一份細(xì)胞，混勻計(jì)數(shù)，測(cè)出細(xì)胞密度，并調(diào)至1×106個(gè)/ml，取1ml 進(jìn)行離心，所得細(xì)胞沉淀以PBS 洗滌，再次離心，以500 μl 結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞沉淀，依次加入5μl PI、10μl annexin V-FITC 后吹打混勻，孵育（37.5℃，避光）15min，離心后，以PBS 洗滌細(xì)胞，加入300μl PBS，重懸細(xì)胞，吹打混勻，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組凋亡情況。

1.7 各組細(xì)胞miR-584-5p、HDAC1 mRNA 表達(dá)檢測(cè)

以試劑盒提取1.4 中收集的一份細(xì)胞總RNA 后做逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，獲得各組細(xì)胞模板cDNA，預(yù)先配制實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qRT-PCR）實(shí)驗(yàn)反應(yīng)預(yù)混液（ROX 染料0.4μl+上、下游引物各0.8μl+焦碳酸二乙酯處理的水6 μl+實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)主混合物10μl），加入cDNA 后混勻，上機(jī)進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增，miR-584-5p 內(nèi)參選用U6，HDAC1 內(nèi)參選用GAPDH，運(yùn)用2-ΔΔCt算法計(jì)算出miR-584-5p、HDAC1 mRNA 相對(duì)表達(dá)。各基因引物序列見(jiàn)表1。

1.8 各組細(xì)胞HDAC1 蛋白、PCNA 及caspase-9、Bax 表達(dá)檢測(cè)

以高效RIPA 裂解液提取1.4 中最后一份細(xì)胞總蛋白，并以BCA 法測(cè)量其濃度，將蛋白煮沸6min變性后每組各取20μg 總蛋白行SDS-PAGE 凝膠電泳（110V，1.5h），接著以110V 電壓濕轉(zhuǎn)1.5h，所得硝酸纖維膜置入3%牛血清白蛋白溶液中封閉（室溫，1.5h），以剪刀截下HDAC1、PCNA、caspase-9、Bax 及β-actin 蛋白條帶，采用相對(duì)應(yīng)一抗孵育（4℃，12h）后洗滌，然后采用二抗孵育（室溫，2h）后洗滌，顯色后拍照，圖像采用軟件Image J 進(jìn)行定量分析，最終得到各組目的蛋白相對(duì)表達(dá)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較行單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度大豆皂苷對(duì)HEC-1-A 細(xì)胞增殖的影響

不同濃度大豆皂苷可抑制HEC-1-A 細(xì)胞生長(zhǎng)，且在一定范圍內(nèi)隨其濃度升高作用增強(qiáng)，IC50為98.56μg/ml，見(jiàn)表2。

表2 不同濃度大豆皂苷對(duì)HEC-1-A 細(xì)胞增殖的影響（±s ，n=6）

表2 不同濃度大豆皂苷對(duì)HEC-1-A 細(xì)胞增殖的影響（±s ，n=6）

注：與0μg/ml 的大豆皂苷比較，*P<0.05

大豆皂苷濃度（μg/ml） 細(xì)胞活力（%）0 100.00±0.00 20 84.67±11.45*40 68.02±6.38*80 57.12±5.67*120 41.56±4.32*160 40.38±4.03*

2.2 各組間HEC-1-A 細(xì)胞活力的比較

與對(duì)照組[（100.00±0.00）%]相比，大豆皂苷組[（52.14±6.11）%]與大豆皂苷+miR-584-5p 抑制劑陰性對(duì)照組[（53.02±7.65）%]細(xì)胞活力降低（P<0.05）；miR-584-5p 抑制劑組[（153.23±15.34）%]細(xì)胞活力升高（P<0.05）。與大豆皂苷+miR-584-5p 抑制劑組[（97.06±5.92）%]相比，大豆皂苷組、大豆皂苷+miR-584-5p 抑制劑陰性對(duì)照組細(xì)胞活力降低（P<0.05）；miR-584-5p 抑制劑組細(xì)胞活力升高（P<0.05）。

2.3 大豆皂苷對(duì)HEC-1-A 細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組[（8.06±0.67）%]相比，大豆皂苷組[（56.48±7.91）%]與大豆皂苷+miR-584-5p 抑制劑陰性對(duì)照組[（56.03±8.14）%]細(xì)胞凋亡率升高（P<0.05）；miR-584-5p 抑制劑組[（2.35±0.33）%]細(xì)胞凋亡率降低（P<0.05）。與大豆皂苷+miR-584-5p抑制劑組[（8.64±1.20）%]相比，大豆皂苷組、大豆皂苷+miR-584-5p 抑制劑陰性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率升高（P<0.05）；miR-584-5p 抑制劑組細(xì)胞凋亡率降低（P<0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 大豆皂苷對(duì)HEC-1-A 細(xì)胞凋亡的影響

2.4 大豆皂苷對(duì)HEC-1-A 細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，大豆皂苷組與大豆皂苷+miR-584-5p 抑制劑陰性對(duì)照組細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白PCNA 表達(dá)降低（P<0.05），凋亡相關(guān)蛋白caspase-9、Bax 表達(dá)增高（P<0.05）；miR-584-5p 抑制劑組細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白PCNA 表達(dá)增高（P<0.05），凋亡相關(guān)蛋白caspase-9、Bax 表達(dá)降低（P<0.05）。與大豆皂苷+miR-584-5p 抑制劑組相比，大豆皂苷組、大豆皂苷+miR-584-5p 抑制劑陰性對(duì)照組細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白PCNA 表達(dá)降低（P<0.05），凋亡相關(guān)蛋白caspase-9、Bax 表達(dá)增高（P<0.05）；miR-584-5p 抑制劑組細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白PCNA 表達(dá)增高（P<0.05），凋亡相關(guān)蛋白caspase-9、Bax 表達(dá)降低（P<0.05），見(jiàn)圖2、表3。

圖2 大豆皂苷對(duì)HEC-1-A 細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表3 各組細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)（±s ，n=6）

表3 各組細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)（±s ，n=6）

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與大豆皂苷+miR-584-5p 抑制劑組比較，#P<0.05

組別 PCNA/β-actin caspase-9/β-actin Bax/β-actin對(duì)照組 1.43±0.37 0.61±0.07 0.55±0.08大豆皂苷組 0.71±0.13*# 1.38±0.19*# 1.27±0.16*#miR-584-5p 抑制劑組2.05±0.54*# 0.25±0.05*# 0.20±0.04*#大豆皂苷+miR-584-5p抑制劑組 1.39±0.30 0.63±0.08 0.59±0.11大豆皂苷+miR-584-5p抑制劑陰性對(duì)照組 0.70±0.18*# 1.40±0.21*# 1.29±0.22*#

2.5 大豆皂苷對(duì)HEC-1-A 細(xì)胞miR-584-5p/HDAC1通路表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，大豆皂苷組與大豆皂苷+miR-584-5p 抑制劑陰性對(duì)照組細(xì)胞HDAC1 mRNA及蛋白表達(dá)降低（P<0.05），miR-584-5p 表達(dá)增高（P<0.05）；miR-584-5p 抑制劑組細(xì)胞HDAC1 mRNA 及蛋白表達(dá)增高（P<0.05），miR-584-5p 表達(dá)降低（P<0.05）。與大豆皂苷+miR-584-5p 抑制劑組相比，大豆皂苷組、大豆皂苷+miR-584-5p 抑制劑陰性對(duì)照組細(xì)胞HDAC1 mRNA 及蛋白表達(dá)降低（P<0.05），miR-584-5p 表達(dá)增高（P<0.05）；miR-584-5p 抑制劑組細(xì)胞HDAC1 mRNA 及蛋白表達(dá)增高（P<0.05），miR-584-5p 表達(dá)降低（P<0.05），見(jiàn)圖3、表4。

圖3 大豆皂苷對(duì)HEC-1-A 細(xì)胞HDAC1 蛋白表達(dá)的影響

表4 各組細(xì)胞miR-584-5p、HDAC1 mRNA 及蛋白相對(duì)表達(dá)（±s ，n=6）

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與大豆皂苷+miR-584-5p 抑制劑組比較，#P<0.05

mRNA 相對(duì)表達(dá) 蛋白相對(duì)表達(dá)組別miR-584-5p/U6 HDAC1/GAPDH HDAC1/β-actin對(duì)照組 0.97±0.17 1.00±0.18 0.85±0.13大豆皂苷組 2.47±0.49*# 0.39±0.09*# 0.28±0.08*#miR-584-5p 抑制劑組 0.41±0.06*# 2.21±0.40*# 1.84±0.34*#大豆皂苷+miR-584-5p抑制劑組 1.01±0.20 0.96±0.15 0.82±0.12大豆皂苷+miR-584-5p抑制劑陰性對(duì)照組 2.46±0.51*# 0.40±0.11*# 0.27±0.07*#

3 討論

手術(shù)切除子宮、卵巢后輔助放化療是目前EC 的標(biāo)準(zhǔn)臨床治療手段，分子靶向治療、基因治療等新型療法亦得到補(bǔ)充應(yīng)用，患者生存率有所提高，但費(fèi)用昂貴，療效也未達(dá)到預(yù)期，因此還需尋找更為有效價(jià)廉的治療策略[12-14]。天然皂苷類(lèi)產(chǎn)物可促使腫瘤細(xì)胞凋亡，提高其對(duì)化療藥物的敏感性，起到抗腫瘤的功效，大豆皂苷是大豆、黃精等植物中含有的主要活性成分，可有效抑制卵巢癌增殖及遷移侵襲[15-16]。本研究顯示大豆皂苷可抑制HEC-1-A 細(xì)胞生長(zhǎng)，且在一定范圍內(nèi)隨濃度升高作用增強(qiáng)，根據(jù)IC50值選擇大豆皂苷最佳作用濃度對(duì)HEC-1-A 進(jìn)行處理后，發(fā)現(xiàn)大豆皂苷可降低HEC-1-A 細(xì)胞活力、PCNA 蛋白表達(dá)，增高細(xì)胞凋亡率、caspase-9 及Bax蛋白表達(dá)，表明大豆皂苷可下調(diào)增殖相關(guān)蛋白表達(dá)，促進(jìn)凋亡蛋白表達(dá)，降低HEC-1-A 細(xì)胞活力，誘導(dǎo)其凋亡，對(duì)EC 具有抗癌活性。

HDAC1 是一種組蛋白脫乙酰酶，在包括子宮內(nèi)膜腫瘤在內(nèi)的多種腫瘤中起致癌作用，抑制HDAC1表達(dá)，升高活性氧水平，觸發(fā)宮頸癌細(xì)胞凋亡[17-18]。HDAC1 過(guò)表達(dá)與胃癌患者預(yù)后不良呈正相關(guān)，可抑制胃癌異種移植瘤生長(zhǎng)[19]。miR-584-5p 是具有抗癌作用的微小RNA，在肝癌、非小細(xì)胞肺癌和胃癌等腫瘤組織中表達(dá)降低，過(guò)表達(dá)miR-584-5p 基因可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的遷移、增殖和侵襲，顯著促使肝癌細(xì)胞凋亡過(guò)程，這些結(jié)果表明，miR-584-5p/HDAC1 通路可作為EC 治療的作用靶點(diǎn)[20]。結(jié)果顯示，大豆皂苷可降低HEC-1-A 細(xì)胞HDAC1 mRNA 及蛋白表達(dá)，升高miR-584-5p 表達(dá)；以miR-584-5p 抑制劑下調(diào)HEC-1-A 細(xì)胞miR-584-5p 表達(dá)，可增強(qiáng)其增殖，抑制其凋亡，并可減弱大豆皂苷對(duì)HEC-1-A 細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用，逆轉(zhuǎn)大豆皂苷對(duì)EC 的抗腫瘤功效，提示大豆皂苷可調(diào)控miR-584-5p/HDAC1 通路促使EC細(xì)胞凋亡，抑制其增殖。

綜上所述，大豆皂苷可上調(diào)miR-584-5p 表達(dá)，降低HDAC1 表達(dá)，減輕EC 細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡發(fā)生，調(diào)控miR-584-5p/HDAC1 通路表達(dá)是其發(fā)揮抗癌作用的分子機(jī)制之一，本研究結(jié)果證實(shí)大豆皂苷對(duì)EC 具有較大的治療潛力。