重組大腸桿菌補救途徑合成2′-巖藻糖基乳糖的分子克隆和產物合成分析

李娜,徐錚*,韓子鈺,徐虹,李古月,夏洪志,牛堃

1(南京工業大學 食品與輕工學院,江蘇 南京,211816)2(南通勵成生物工程有限公司,江蘇 南通,226010)

人乳寡糖(human milk oligosaccharide, HMO)是在母乳中占比僅次于乳糖和脂類的固體物質,也是母乳區別于牛、羊奶的獨特成分。臨床和流行病學研究數據表明,喂養母乳可以預防感染、維持免疫穩態和培育健康的腸道微生物菌群[1]。最新報道指出這些作用可能使HMO在新型冠狀病毒肺炎感染過程中作為受體誘餌、免疫調節劑、黏膜信號劑和益生元,對新型冠狀病毒肺炎的治療有積極效果[2]。其中,2′-巖藻糖基乳糖(2′-fucosyllactose, 2′-FL)是由乳糖和L-巖藻糖結合而成的三糖,是HMO中含量最多的組分[3]。大量研究證實2′-FL有助于提高嬰幼兒免疫力、調節腸道菌群、促進大腦發育等作用[4-6],是新一代的母乳概念配方奶粉添加劑,有著巨大的市場潛力。2′-FL可通過化學和生物合成方法獲得,其中生物合成方法更加綠色環保,反應副產物少,有利于規模化推廣應用。

截止目前,2′-FL的生物合成分別由大腸桿菌[7-8]、釀酒酵母[9-10]、解脂耶氏酵母[11]、枯草芽胞桿菌[12]等底盤微生物實現。大腸桿菌作為基因工程操作成功率最高的模式生物,一直是研究的熱點。它主要通過從頭合成途徑和補救合成途徑生產GDP-L-巖藻糖,在外源α-1,2-巖藻糖基轉移酶的作用下生成產物,如圖1所示。然而由于從頭合成途徑較長,涉及基因較多,研究具有一定難度;而通過研究補救途徑探索2′-FL合成的影響因素更為方便。該途徑中巖藻糖到2′-FL的摩爾轉化率是影響生產成本的關鍵因素,WAN等[13]通過敲除EscherichiacoliBL21(DE3)菌株的多個基因(lacZ、fucI、fucK、araA、rhaA和wcaJ),阻止底物和關鍵中間體的降解和分流;將Fkp和FutC2通過短肽對(RIAD-RIDD)在體內形成自組裝多酶復合物,過表達gsk和gmk從而平衡代謝過程中的輔因子以及氧化還原通量,最終在補料分批發酵64 h后胞外2′-FL累積量達到30.5 g/L,轉化率為0.66 mol/mol巖藻糖。其次,提高底物攝入和產物由胞內運出的效率,也會對2′-FL的產量提升有促進作用,而促進物質轉運的蛋白均為膜結合,在高拷貝數質粒上表達會對宿主造成細胞毒性。首爾大學的PARK等[14]通過對宿主本底的乳糖操縱子進行編輯,使得乳糖轉運蛋白LacY可正常工作但不對宿主產生影響。最后,作為反應最終步驟的α-1,2-巖藻糖基轉移酶的選擇和可溶表達也是提高轉化率的重要手段,為了提高α-1,2-巖藻糖基轉移酶的可溶性表達,CHIN等[15]在從頭合成途徑中將FucT2蛋白的N端加上3個天冬氨酸,使得2′-FL產量提升到了6.4 g/L。盡管有研究表明可利用低溫促進FucT2的可溶性表達,但菌體生長和產物合成水平也會降低[16]。融合標簽的使用也提高了α-1,2-巖藻糖基轉移酶的可溶性表達,例如three aspartate tag[15]和SUMO標簽[11]的使用具有一定效果。

圖1 重組大腸桿菌合成2′-FL的代謝途徑

本研究以不同株系的大腸桿菌JM109(DE3)、BL21(DE3)、C41(DE3)作為底盤微生物,通過CRISPR-Cas9系統對它們進行基因編輯(敲除lacZ、wcaJ、lacA基因)使得底物和中間體不被分支途徑消耗,利用質粒對Fkp酶和不同來源的α-1,2-巖藻糖基轉移酶共表達從而搭建出補救途徑。通過分析不同重組菌株發酵液中2′-FL的含量,并對底物和產物轉運蛋白進行表達調控,最終通過發酵條件優化在搖瓶中進一步提高了2′-FL在胞外的累積,質量濃度達到2.67 g/L,2′-FL的摩爾轉化率達到0.82 mol/mol巖藻糖,為2′-FL的生物合成研究提供了借鑒。

1 材料與方法

1.1 質粒與菌株

本實驗所使用菌株和質粒見表1。

表1 質粒和菌株信息

1.2 底盤微生物的選擇和改造

1.2.1 對底盤微生物的分析

JM109(DE3)是缺失乳糖水解能力的大腸桿菌[15],這有助于其合成2′-FL。BL21(DE3)是廣泛使用的表達宿主,研究表明經改造的BL21(DE3)具備從頭途徑合成2′-FL的能力;C41(DE3)菌株來源于BL21(DE3),該菌株多個基因發生突變,尤其大幅降低了T7 RNA聚合酶的轉錄水平,在很大程度上解決了外源蛋白表達形成包涵體的難題;目前已有研究將C41(DE3)作為2′-FL從頭合成途徑的宿主[8],但補救途徑合成2′-FL的情況未見報道。

1.2.2 底盤微生物的改造

由于大腸桿菌本身存在多條分支代謝途徑會對合成底物和中間體產生消耗,嚴重影響了產物合成。本研究采用CRISPR-Cas9作為基因編輯工具對宿主相關基因lacZ、wcaJ、lacA進行敲除,以BL21(DE3)菌株敲除lacZ基因為例,所使用引物見表2。首先通過CHOPCHOP(https://chopchop.cbu.uib.no/)在線設計N20序列,合成引物lacZ-N20-F/R后加入包含T4 DNA連接酶緩沖液的反應體系中。將PCR反應程序設定為95 ℃解鏈5 min,梯度退火即可獲得lacZ-N20雙鏈DNA。將其稀釋后與pEcgRNA載體混合,加入BsaI酶和T4 DNA連接酶37 ℃反應1 h。將反應物轉化至DH5α感受態細胞,即可得到攜帶lacZ靶點的pEcgRNA-lacZ-N20重組質粒。以BL21(DE3)的基因組DNA為模板,分別PCR得到lacZ基因上下游的同源臂片段u-lacZ和d-lacZ,再經重疊PCR獲得同源臂片段u/d-lacZ并純化回收;將100 ng的pEcgRNA-lacZ-N20重組質粒和400 ng的u/d-lacZ片段混合,電轉化至含有pEcCas載體的BL21(DE3)感受態細胞中,涂布LB平板(含50 mg/L卡那霉素和50 mg/L壯觀霉素)在37 ℃過夜培養;挑取平板單菌落使用PCR鑒定敲除是否成功,電轉化和質粒消除等實驗步驟詳見參考文獻[17]。

表2 本研究中使用的引物

1.3 補救途徑的構建和優化

1.3.1 2′-FL生產菌株的構建

委托通用生物公司全合成脆弱擬桿菌(Bacteroidesfragilis)來源的fkp編碼基因,并克隆到了pRSF-Duet-1載體MCS1區域的NcoI-BamH I處,獲得重組質粒pRSF-F。使用NdeI和XhoI對pRSF-F進行雙酶切,通過試劑盒ClonExpress II One Step Cloning Kit(南京諾唯贊生物科技公司)將線性化的質粒和α-1,2-巖藻糖基轉移酶基因連接(引物見表2),通過測序驗證是否正確并轉化至相應感受態細胞獲得2′-FL的生產菌株。

1.3.2 巖藻糖基轉移酶的選擇

委托通用生物公司全合成野生型或按照大腸桿菌密碼子偏好性優化的幽門螺桿菌(Helicobacterpylori26695)來源的fucT2、脆弱擬桿菌(Bacteroidesfragilis)來源的wcfB、大腸桿菌O126來源的wbgL3種巖藻糖基轉移酶編碼基因。使用對應引物(如表2所示)進行PCR,所得片段經純化后連接到使用NdeI和XhoI雙酶切的pRSF-F載體上,再轉化大腸桿菌感受態細胞。比較攜帶不同來源巖藻糖基轉移酶菌株的生產能力,同時通過添加助溶標簽SUMO來提高FucT的可溶性[11]。

1.3.3 轉運蛋白的表達優化

LacY是一種膜結合蛋白,過量表達會帶來細胞毒性。本研究首先選用拷貝數較低的pACYCDuet-1載體進行表達,以lacY-F/R為引物從E.coliBL21(DE3)中擴增出lacY基因,連接到pACYCDuet-1載體的多克隆位點MCS1處(NcoⅠ和BamHⅠ位點之間),得到重組質粒pACYC-Y。為進一步降低表達量,以pUC19質粒為模板擴增出Lac啟動子片段來替換pACYC-Y上MCS1位點原有的T7啟動子,獲得重組質粒pACYC(Plac)-Y。糖轉運蛋白編碼基因tpyb由通用生物公司合成并組裝在lacY基因的終止密碼子之后,兩基因之間通過RBS序列連接得到重組質粒pACYC(Plac)-YT。使用同樣的方法可以獲得攜帶有糖轉運蛋白編碼基因setA的重組質粒pACYC(Plac)-YS。所得質粒均經過測序驗證后轉化至相應宿主,通過細胞干重(dry cell weight, DCW)和2′-FL產量來比較轉運蛋白表達的影響。

1.4 搖瓶發酵條件優化

將平板單菌落挑取至含有對應抗生素的5 mL LB液體培養基,于37 ℃培養過夜。吸取1 mL菌液接種于50 mL含10 g/L甘油的LB培養基中,37 ℃培養至菌體OD600值達到0.6～0.8時添加0.1 mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside, IPTG)誘導重組質粒表達。此時各加入2 g/L的L-巖藻糖和乳糖,25 ℃繼續培養48 h并定時取樣,通過HPLC檢測2′-FL的含量。分別考察了不同表達溫度(20、25、30、35、37 ℃),不同IPTG濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L),不同乳糖添加量(1、3、5、7、9 g/L)對發酵合成2′-FL的影響。

1.5 分析方法

生物量的測定方法:發酵液離心棄上清液,烘干稱重得到DCW數據。甘油、L-巖藻糖、乳糖、2′-FL在發酵液中的濃度通過HPLC測定,取1 mL發酵液,12 000 r/min離心1 min,將上清液用0.22 μm水系濾膜過濾后使用安捷倫HPLC系統和Carbohydrate Analysis(Rezex ROA-Organic Acid H+)色譜柱對樣品進行分析,其中流動相為0.5 mmol/L硫酸溶液,流速0.6 mL/min,柱溫60 ℃,進樣量20 μL。

2 結果與分析

2.1 宿主選擇及基因敲除對2′-FL合成的影響

含有β-半乳糖苷酶的大腸桿菌可將乳糖水解成葡萄糖和半乳糖并用于細胞生長,而不是和GDP-L-巖藻糖結合為2′-FL。如圖2所示,含有補救途徑但不能水解乳糖的JM-V1菌株可合成0.53 g/L的2′-FL,而可水解乳糖的菌株BL-V1和C41-V1分別只能合成0.23、0.05 g/L的2′-FL。我們通過CRISPR-Cas9系統敲除了編碼β-半乳糖苷酶的基因lacZ,敲除后的B1-V1和C1-V1菌株相比敲除前產量提高約2倍。GDP-L-巖藻糖是大腸桿菌克拉酸合成途徑的重要中間體[18],克拉酸合成會造成GDP-L-巖藻糖的大量消耗,因此需要敲除其合成途徑的關鍵基因wcaJ。敲除后得到了菌株J1-V1、B2-V1、C2-V1,2′-FL產量分別為0.21、0.62、0.15 g/L。值得注意的是J1-V1的生物量和產量較出發菌株下降60%,即wcaJ的敲除對菌體生長產生顯著的負面影響,說明該基因對JM109(DE3)有較為重要的作用而不宜被敲除。而B2-V1與出發菌株相比產量提升2.67倍,DCW相較之前略微下降。C2-V1產量仍較低,這可能是由于該菌株對T7啟動子的轉錄能力較弱導致。在上述工作的基礎上我們進一步將β-半乳糖苷乙酰基轉移酶基因(lacA)進行敲除并構建出J2-V1、B3-V1、C3-V1菌株,以期能進一步提高乳糖的利用率。由圖2可知,敲除lacA的菌株2′-FL產量均得到進一步提高,其中J2-V1菌株產量最高達到0.86 g/L,是出發菌株的1.61倍。以上結果表明,在3株候選菌株中lacZ和lacA基因的敲除均使得2′-FL胞外濃度提升;wcaJ的敲除對JM109(DE3)影響很大,導致菌株無法正常生長,但該基因對BL21(DE3)及C41(DE3)的生物量卻無顯著影響。

圖2 不同重組菌株的2′-FL產量

2.2 巖藻糖基轉移酶的選擇與優化

巖藻糖基轉移酶作為關鍵酶催化2′-FL合成的最后一步反應,它的表達以及活力高低對于產量是至關重要的。對不同來源的α-1,2-巖藻糖基轉移酶(FucT2、WcfB、WbgL)編碼基因進行密碼子優化,再與雙功能酶Fkp一起克隆到pRSFDuet-1載體上,分別轉化JM109(DE3)ΔlacA、BL21(DE3)ΔlacZΔwcaJΔlacA、C41(DE3)ΔlacZΔwcaJΔlacA等菌株。經搖瓶發酵后測定胞外2′-FL的濃度發現脆弱擬桿菌來源的wcfB在3個宿主中產量均較低,密碼子優化也沒有提升其生產性能(圖3-a)。WbgL源于致病型大腸桿菌E.coliO126,仍含有約41%的稀有密碼子,經密碼子優化后2′-FL在表達宿主中產量得到了進一步的提升,其中J2-V3提高了5.1%,產量為0.84 g/L;B3-V3提升了7.7%,產量為0.62 g/L。來源于幽門螺桿菌的fucT2密碼子優化前后雖未有較明顯提升,但與WcfB和WbgL相比產量最高,因此含有fucT的J2-V1和B3-V1是首選的2′-FL生產菌株。

a-不同來源巖藻糖基轉移酶基因密碼子優化對2′-FL合成的影響(WT:原始基因序列,OP:經過密碼子優化的序列);b-fucT2連接SUMO標簽對2′-FL產量的影響

在本研究的后續實驗中,我們將密碼子優化的fucT2作為選定的α-1,2-巖藻糖基轉移酶編碼基因。由于該酶在大腸桿菌中的可溶性較差,參考HOLLANDS等[11]的工作將fucT基因與SUMO標簽融合表達。通過測定J2-V4,B3-V4,C3-V4的胞外2′-FL濃度,我們發現帶有標簽的相應菌株產量均獲提升,其中J2-V4產量為1.13 g/L(圖3-b),表明該標簽的使用對FucT2的可溶性表達起到促進作用。

2.3 轉運蛋白的過表達

為進一步提高乳糖在胞內的利用率,過表達乳糖透過酶LacY來增強乳糖向胞內的轉運。由于LacY是一個膜蛋白,大量表達具有細胞毒性,因此選擇了拷貝數很低的pACYCDuet-1表達載體。發酵結束后測定生物量發現表達LacY的菌株J2-V5、B3-V5與對照組相比均下降了2/3左右,產物合成也被抑制(圖4-a),而C3-V5的生物量也下降了1/2。為降低lacY表達的細胞毒性,將pACYCDuet-1上的T7強啟動子替換為Lac啟動子,得到新菌株J2-V6、B3-V6、C3-V6。經發酵驗證更換啟動子后LacY的表達不僅沒有對菌體生長造成毒害,還如預期對2′-FL的合成起到了促進作用。如圖4-b所示,J2-V6相較沒有過表達LacY的J2-V4產量提升了47.7%,2′-FL的胞外質量濃度為1.67 g/L,B3-V6的2′-FL胞外質量濃度也提升至1.47 g/L,C3-V6產量也有提高但遠低于J2-V6和B3-V6。為促進胞內2′-FL分泌到胞外,過表達伯氏耶爾森菌(Yersiniabercovieri)的糖轉運蛋白Tpyb或大腸桿菌來源的的糖轉運蛋白SetA。結果如圖4-b所示,過表達Tpyb(V7菌株)或SetA(V8菌株)后胞外2′-FL濃度提高且在不同宿主內SetA的轉運效果均優于Tpyb,其中濃度最高的J2-V8達到2.21 g/L,生物量未受明顯影響。

a-T7啟動子過表達lacY對2′-FL合成的影響;b-Lac啟動子過表達lacY、tpyb、setA對2′-FL合成的影響

2.4 發酵條件優化

通過前期的菌株構建和途徑優化工作,我們獲得了可用于補救途徑生產2′-FL的重組菌株J2-V8。進一步對誘導溫度、誘導劑濃度以及乳糖的添加量進行了優化,測定了發酵條件下2′-FL的胞外濃度。由圖5-a可知,IPTG為0.2 mmol/L時,2′-FL產量最高,達到2.27 g/L。當IPTG濃度超過0.6 mmol/L后產量反而下降,這可能是由于過表達導致了胞內代謝不平衡,故0.2 mmol/L應為最適的誘導劑濃度。誘導溫度不僅會影響蛋白表達折疊也決定了菌體的生長速度,溫度過低,宿主生長較差不利于產物生成,溫度過高菌體生長過快,易引起蛋白質錯誤折疊而形成包涵體。如圖5-b所示,分別測定了20、25、30、35、37 ℃下菌株合成2′-FL的差異,結果表明25 ℃時最優,2′-FL胞外質量濃度為2.3 g/L,轉化率為0.71 mol/molL-巖藻糖。

由于乳糖濃度可能對2′-FL合成產生影響,本研究中我們采用終質量濃度為1、3、5、7、9 g/L的乳糖作為底物搖瓶發酵。分析圖5-c可得,當乳糖由1 g/L提升至3 g/L時,產量大幅提升,此時2′-FL的胞外質量濃度達到2.67 g/L,轉化率為0.82 mol/mol巖藻糖。當乳糖質量濃度高于3 g/L時產量不再明顯提升,乳糖轉運已經達到飽和,因此將終質量濃度3 g/L乳糖作為最適添加濃度。利用HPLC檢測發酵液中2′-FL含量如圖5-d所示大腸桿菌通過補救途徑生產2′-FL的相關實驗數據比較如表3所示。

表3 補救途徑合成2′-FL的結果比較

3 結論

本研究構建了利用補救途徑合成2′-FL的重組大腸桿菌菌株,通過篩選不同來源的α-1,2-巖藻糖基轉移酶基因并經過密碼子優化,添加SUMO標簽促進了酶的可溶性表達。通過替換弱啟動子對乳糖轉運蛋白LacY和產物運出蛋白Tpyb及SetA進行了過表達試驗,獲得1株2′-FL胞外質量濃度為2.21 g/L的重組大腸桿菌J2-V8。在搖瓶水平進行發酵優化,得到最優發酵條件:誘導劑IPTG濃度為0.2 mmol/L,誘導溫度25 ℃,誘導同時加入2 g/L的L-巖藻糖和3 g/L乳糖。通過HPLC測定48 h時發酵液中2′-FL質量濃度提高到2.67 g/L,轉化率為0.82 mol/molL-巖藻糖。L-巖藻糖作為發酵過程中成本較高的底物,通過LacY和SetA的表達增強了乳糖向胞內的輸入以及2′-FL向胞外的輸出,有助于充分利用L-巖藻糖合成產物,可為2′-FL的生物合成深入研究提供一定借鑒。