質(zhì)粒介導(dǎo)的氨芐西林耐藥腸炎沙門氏菌生長特性及抗性研究

洪意,謝雅妮,吳瑜凡,秦曉杰,董慶利,王翔*

1(上海理工大學(xué) 健康科學(xué)與工程學(xué)院,上海,200093)2(華東理工大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院分析測試中心,上海,200237)

沙門氏菌是最常見的食源性致病菌之一,能夠?qū)е履c胃炎和敗血癥等疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì),在全球范圍內(nèi)沙門氏菌每年造成約1.53億例腸道感染病例以及5.7萬人死亡[1]。在中國,沙門氏菌也成為了細(xì)菌性食源性疾病的第二大常見原因[2],腸炎沙門氏菌(Salmonellaentericaserovar Enteritidis)是其中重要的血清型之一,主要通過禽類及其副產(chǎn)品等食品傳播感染[3]。

隨著抗生素的廣泛甚至不合理使用,細(xì)菌耐藥性普遍增強(qiáng)給細(xì)菌感染的控制帶來挑戰(zhàn)。據(jù)2018年中國細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(China antimicrobial surveillance network,CHINET)的報(bào)道,細(xì)菌耐藥性整體呈上升趨勢,耐藥菌的分離比2017年增加了28.7%[4]。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)沙門氏菌主要對四環(huán)素、氨芐西林、磺胺類與鏈霉素等抗生素藥物表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐藥性[5]。其中,氨芐西林作為第一種廣譜β-內(nèi)酰胺類抗生素,可通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成發(fā)揮作用[6],在細(xì)菌中的耐藥狀況較為嚴(yán)重[7]。細(xì)菌主要通過修飾青霉素結(jié)合蛋白、生產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶、改變膜的通透性以及促進(jìn)外排泵等方式提高對氨芐西林的耐藥性[8],而耐藥基因則通過染色體基因突變與水平基因轉(zhuǎn)移等方式獲得[9]。水平基因轉(zhuǎn)移既是細(xì)菌整體耐藥性快速上升的重要原因,也是耐藥基因傳播的主要手段,耐藥基因由質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子等載體以低于染色體基因突變的成本,賦予細(xì)菌耐藥的特性[10],而腸炎沙門氏菌中含有許多的耐藥質(zhì)粒。

細(xì)菌在獲得耐藥性后通常會發(fā)生生長速率下降及對不利環(huán)境的抗性降低,這種現(xiàn)象稱為適應(yīng)性代價(jià)[11]。也有研究發(fā)現(xiàn)耐藥性的獲得會誘導(dǎo)細(xì)菌對常見的食品相關(guān)壓力產(chǎn)生交叉抗性,導(dǎo)致細(xì)菌在食品鏈中具有更強(qiáng)的存活能力[12],造成食品安全隱患。對于氨芐西林此類作用于細(xì)胞壁的抗生素,細(xì)菌可通過一系列信號通路的協(xié)調(diào)反應(yīng)改變細(xì)菌的代謝和抗性,加之不同種類細(xì)菌間的異質(zhì)性以及抗生素作用機(jī)制不同,變化有待進(jìn)一步探究。因此,本研究將通過質(zhì)粒導(dǎo)入的方式賦予腸炎沙門氏菌氨芐西林的耐藥特征,并檢測轉(zhuǎn)化后菌株的耐藥性、生長特性、熱與酸抗性的變化,以期為沙門氏菌的風(fēng)險(xiǎn)評估以及在食品加工環(huán)節(jié)中的防治提供參考,從而保障食品安全。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)中所用的5株抗生素敏感腸炎沙門氏菌及含pKD46的大腸埃希氏菌為本實(shí)驗(yàn)室保存。野生型腸炎沙門氏菌均分離于食品,1、4號來自雞肉,2、3、5號來自豬肉。經(jīng)藥敏測試發(fā)現(xiàn)對包括氨芐西林、頭孢唑啉、四環(huán)素、亞胺培南等在內(nèi)17種抗生素藥物敏感。100 μg/mL的LA培養(yǎng)基與培養(yǎng)液由1 000 mL滅菌的LB培養(yǎng)基與培養(yǎng)液中加入100 mg/mL的氨芐西林原液1 mL配制而成。

LB培養(yǎng)基,青島海博生物有限公司;SOC培養(yǎng)液、MH培養(yǎng)液(Mueller-Hinton Broth),上海生工生物工程有限公司;質(zhì)粒小量提取試劑盒,上海捷瑞生物工程有限公司;甘油、鹽酸(分析純),國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;氨芐西林原液,北京博奧森生物科技有限公司;GN4F革蘭氏陰性菌藥敏板,美國賽默飛世爾科技有限公司。

Bioscreen C全自動微生物生長曲線分析儀,芬蘭Oy Growth Curves Ab公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株活化

野生沙門氏菌(WT)在LB培養(yǎng)液中于37 ℃,靜置培養(yǎng)24 h到達(dá)穩(wěn)定期。含有pKD46質(zhì)粒的大腸埃希氏菌和質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后的沙門氏菌在含有100 μg/mL氨芐西林的LA培養(yǎng)基中培養(yǎng),30 ℃靜止培養(yǎng)至穩(wěn)定期。

1.2.2 質(zhì)粒提取與感受態(tài)細(xì)胞制備

大腸埃希氏菌活化后,根據(jù)上海捷瑞生物工程有限公司質(zhì)粒小量提取試劑盒說明書步驟提取pKD46質(zhì)粒。使用電轉(zhuǎn)法進(jìn)行沙門氏菌轉(zhuǎn)化,采用甘油洗滌法制備感受態(tài)細(xì)胞。將活化后的沙門氏菌在LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)至OD值為0.5。將培養(yǎng)完成的菌液置于冰上冷卻30 min后分裝至15 mL離心管中,4 ℃下2 500 r/min離心10 min,除去上清液。再用雙蒸水重懸菌體,離心去除上清液。隨后再用預(yù)冷的10%(體積分?jǐn)?shù))甘油,重懸離心2次以至徹底去除菌液中的離子。最后加入500 μL預(yù)冷的10%(體積分?jǐn)?shù))甘油重懸。

1.2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

采用電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)化沙門氏菌,先取3 μL質(zhì)粒與0.2 cm電擊杯置于冰上預(yù)冷,再將質(zhì)粒與感受態(tài)細(xì)胞混合均勻,置于電擊杯中,輕輕敲擊杯壁使混合液體進(jìn)入杯底。將電轉(zhuǎn)儀調(diào)至2.5 kV,電擊后,迅速加入1 mL的SOC溶液重懸細(xì)胞,輕輕吹吸數(shù)次后轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中。將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞懸液在30 ℃下220 r/min振蕩復(fù)蘇2 h。取100 μL復(fù)蘇菌液于LA平板上涂布,培養(yǎng)觀察轉(zhuǎn)化情況。挑取單菌落于LA培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)至穩(wěn)定期與50%(體積分?jǐn)?shù))甘油混合保存于-80 ℃下,為后續(xù)試驗(yàn)所用。

1.2.4 最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)值測定

使用革蘭氏陰性菌藥敏板對轉(zhuǎn)化后的沙門氏菌(pKD46)對多種抗生素的MIC值進(jìn)行測定。從LA培養(yǎng)基上挑取3～5個生長正常的單菌落,在無菌水中乳化,充分混合并調(diào)為0.5麥?zhǔn)蠞岫取Ｈ?0 μL配制好的菌液與10 mL的MH培養(yǎng)液混合,移至藥敏板中,每孔30 μL。將藥敏板于37 ℃下靜置培養(yǎng)24 h,觀察孔中是否生長,并參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(Clinical and Laboratory Standardization, CLSI)對抗生素耐藥性進(jìn)行判斷。

1.2.5 生長特性測定

對野生及轉(zhuǎn)化后沙門氏菌在25、30、35 ℃下的生長特性,包括最大比生長速率(μmax)和延滯期(λ)進(jìn)行測定。將培養(yǎng)至穩(wěn)定期的菌液進(jìn)行梯度稀釋,每個濃度取200 μL于100微孔板中在全自動微生物生長曲線分析儀(BioscreenC)測定生長狀態(tài),溫度設(shè)定為25、30、35 ℃,中等強(qiáng)度振動,每10 min檢測1次OD600。通過不同稀釋梯度的菌液濃度與檢測時間(time to detection,Tdet)做線性回歸計(jì)算最大比生長速率μmax,檢測時間即定義為初始的OD值至達(dá)到菌液濃度107CFU/mL時所對應(yīng)OD值的時間,計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

式中:slope,斜率。

基于以上公式所求μmax值,根據(jù)BARANYI等[13]提出的方法計(jì)算延滯期λ,計(jì)算如公式(2)所示:

(2)

式中:x0,初始菌量,CFU/mL;xdet,達(dá)到檢測時間的菌數(shù),CFU/mL;Tdet,OD值達(dá)到107CFU/mL濃度的時間,h;μmax,對數(shù)期細(xì)菌生長的最大比生長速率,lg CFU/h;λ,生長延滯期,h。

1.2.6 熱失活特性測定

采用WANG等[14]的方法對菌在55 ℃/12 min、57.5 ℃/3 min、60 ℃/12 s的處理下觀察存活情況。取培養(yǎng)至穩(wěn)定期的菌液30 μL于PCR管中,按照對應(yīng)的溫度與處理時間在PCR儀中從37 ℃開始升溫,處理結(jié)束后迅速將PCR管置于冰水中停止熱失活,對初始菌液及熱失活后菌液進(jìn)行梯度稀釋并進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。以近似D值作為熱失活表征參數(shù),計(jì)算如公式(3)所示:

(3)

式中:t,熱處理時間,min;N0,初始菌濃度,CFU/mL;Nt,熱處理后菌濃度,CFU/mL。

1.2.7 酸失活特性測定

依據(jù)沙門氏菌在酸化培養(yǎng)液中處理后細(xì)菌對數(shù)減少量判斷耐酸情況,實(shí)驗(yàn)中采用1%(體積分?jǐn)?shù))鹽酸將培養(yǎng)液pH調(diào)至3.0。取1 mL培養(yǎng)至穩(wěn)定期的沙門氏菌至酸化的LB培養(yǎng)液中,4 ℃培養(yǎng)18 h后,3 600 r/min離心5 min,用普通的LB培養(yǎng)液重懸離心2次,沉淀菌體用1 mL的LB重懸后于梯度稀釋并在平板上計(jì)數(shù),對比耐藥質(zhì)粒導(dǎo)入前后的對數(shù)減少值。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)分析

每組試驗(yàn)重復(fù)不少于2次,計(jì)算平均值及標(biāo)準(zhǔn)差。單因素方差分析(one-way analysis of variance,ANOVA)和圖基(Tukey’s)檢驗(yàn)對不同耐藥表型沙門氏菌之間的生長延滯期、最大比生長速率、熱失活特性及酸抗性的差異進(jìn)行顯著性分析。試驗(yàn)采用95%置信限,P<0.05則差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)均通過SPSS 25進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐藥沙門氏菌MIC測定

經(jīng)耐藥質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后共獲得5株沙門氏菌耐藥菌株。革蘭氏陰性菌藥敏板對質(zhì)粒導(dǎo)入后的沙門氏菌進(jìn)行了16種抗菌藥物的MIC測定,表1展示了其中MIC值發(fā)生變化的6種抗生素耐藥情況。整體而言,經(jīng)質(zhì)粒導(dǎo)入氨芐西林耐藥基因不易導(dǎo)致廣泛的交叉耐藥。其中,轉(zhuǎn)化后的沙門氏菌對氨芐西林/舒巴坦鈉、頭孢唑啉與替卡西林/克拉維酸的MIC值普遍增加;米諾環(huán)素與呋喃妥因的MIC值普遍下降,1號與5號菌對氨芐西林/舒巴坦鈉的耐藥表型和1號、4號與5號對頭孢唑啉的耐藥表型均從敏感變?yōu)槟退帯?/p>

表1 質(zhì)粒導(dǎo)入前后腸炎沙門氏菌對不同抗生素的MIC值

2.2 生長特性分析

質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后的沙門氏菌整體生長特性存在較為顯著的變化(圖1)。在3種溫度條件下,沙門氏菌的平均生長延滯期λ均發(fā)生了顯著的延長(P<0.05),25 ℃時由3.02 h延至5.59 h;30 ℃時由2.09 h延至4.48 h;35 ℃時由2.27 h延至3.02 h。而對于最大比生長速率μmax的平均值在轉(zhuǎn)化前后則無顯著差異。

a-生長延滯期;b-最大比生長速率

2.3 熱抗性分析

質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后的5株耐藥沙門氏菌,在3種溫度條件下近似D值均呈現(xiàn)下降趨勢(圖2),即耐藥沙門氏菌對熱的抗性降低。其中,平均近似D值在55 ℃下由4.76 min降至3.35 min,差異不顯著;在57.5 ℃下由1.70 min顯著降至0.64 min(P<0.01);在60 ℃下由0.77 min顯著降至0.24 min(P<0.01)。

圖2 野生型與耐藥型腸炎沙門氏菌近似D值

2.4 酸抗性分析

野生型與質(zhì)粒導(dǎo)入的耐藥型沙門氏菌整體在pH=3.0條件下細(xì)菌減少量如圖3所示,耐藥菌的平均對數(shù)減少值雖然低于野生型,但兩者之間的酸抗性無顯著性差異。其中,野生型沙門氏菌的對數(shù)減少平均值為2.90 lg CFU/mL,耐藥型沙門氏菌為1.81 lg CFU/mL。

圖3 野生型與耐藥型腸炎沙門氏菌對數(shù)減少值

3 討論與結(jié)論

腸炎沙門氏菌是一種人畜共患的食源性致病菌,質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因傳播以及所帶來的生長特性與抗性給耐藥細(xì)菌的風(fēng)險(xiǎn)評估帶來新的挑戰(zhàn)。本研究將含有氨芐西林耐藥基因的外源質(zhì)粒pKD46導(dǎo)入敏感的腸炎沙門氏菌中,并對轉(zhuǎn)化后沙門氏菌的耐藥性、生長特性以及熱與酸抗性進(jìn)行了探究,發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒介導(dǎo)氨芐西林耐藥的腸炎沙門氏菌對其他不同種類的抗生素交叉抗性較弱,延滯期λ增長而最大比生長速率μmax無顯著差異,熱抗性降低,酸抗性無顯著差異。

CHOI等[15]在探究質(zhì)粒介導(dǎo)的耐黏菌素大腸埃希氏菌生長特征時得到了與本研究相似的結(jié)論,3株耐藥大腸埃希氏菌的最大比生長速率μmax與敏感菌無顯著性差異。JIANG等[16]同樣發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入含有廣譜β-內(nèi)酰胺酶的pHK01質(zhì)粒對大腸埃希氏菌的生長曲線無影響,然而當(dāng)質(zhì)粒中的一些sRNA過表達(dá)時會使延滯期改變。推測質(zhì)粒本身或許比其攜帶的耐藥基因?qū)?xì)菌生長特性的影響更大。減毒的鼠傷寒沙門氏菌在導(dǎo)入真核表達(dá)質(zhì)粒plRES2-RGFP-4-1BBL后,生長繁殖較親本變慢[17]。在對萬古霉素耐藥腸球菌的研究中發(fā)現(xiàn),在自然營養(yǎng)條件下具有較大質(zhì)粒的菌株比無質(zhì)粒的敏感菌株衰減更快[18]。而在自然環(huán)境中,適應(yīng)性代價(jià)較低的質(zhì)粒在傳播中占據(jù)更大優(yōu)勢[19],WANG等[20]比較了自然分離的沙門氏菌生長特性,發(fā)現(xiàn)敏感、耐藥與多重耐藥菌株間的生長并無顯著性差異。

目前,關(guān)于研究耐藥質(zhì)粒與食品相關(guān)壓力抗性關(guān)聯(lián)的研究較少。在自然分離的菌株中,質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因傳播是細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)的主要原因,研究發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌[21]、單增李斯特菌[22]和大腸埃希氏菌[23]等的敏感與耐藥菌株間熱抗性不存在顯著性差異,然而本次研究中發(fā)現(xiàn)耐藥沙門氏菌的耐熱性是顯著降低的。熱激蛋白是生物體在應(yīng)急條件下誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白質(zhì),通常作為分子伴侶協(xié)助熱損傷的蛋白進(jìn)行修復(fù)與折疊[24]。耐藥質(zhì)粒的導(dǎo)入能在短時間內(nèi)擾亂宿主原有的基因表達(dá),包括熱激蛋白,而自然界分離的耐藥菌中耐藥質(zhì)粒則在長久的傳播中實(shí)現(xiàn)了補(bǔ)償性進(jìn)化從而盡可能減小了對宿主基因組的影響,這可能是解釋實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的原因之一。此外,研究發(fā)現(xiàn)攜帶四環(huán)素抗性基因的質(zhì)粒與沙門氏菌中的熱激誘導(dǎo)相關(guān)[25],肺炎克雷伯氏菌中預(yù)測細(xì)菌熱抗性蛋白的基因與廣譜β-內(nèi)酰胺酶的基因通過質(zhì)粒共傳播的現(xiàn)象[26],均表明耐藥質(zhì)粒的傳播與細(xì)菌熱抗性之間存在著復(fù)雜的聯(lián)系。而酸抗性的結(jié)果更加多樣,研究發(fā)現(xiàn)大腸埃希氏菌的敏感菌株耐酸能力更強(qiáng)[23],相反,單增李斯特菌[22]與金黃色葡萄球菌[21]的耐藥菌株酸抗性更強(qiáng),而在沙門氏菌中酸抗性則與耐藥性無關(guān)[27-28]。細(xì)菌的酸抗性主要包括3種機(jī)制:提高胞內(nèi)pH、酸激蛋白的修復(fù)以及細(xì)胞膜修飾[29],其中許多與耐藥機(jī)制相同,如外排泵、雙組分系統(tǒng)調(diào)節(jié)以及改變膜的通透性等[30],因此不同菌株各自的特性及不同抗生素耐藥機(jī)制導(dǎo)致研究間出現(xiàn)了較強(qiáng)的異質(zhì)性。

綜上所述,腸炎沙門氏菌在導(dǎo)入含有特定基因的耐藥質(zhì)粒后,耐藥譜變化較小,交叉抗性主要體現(xiàn)在作用機(jī)制相似的抗生素中;細(xì)菌的最大比生長速率μmax不變,延滯期λ增長;耐藥菌的耐熱性顯著降低,對食品生產(chǎn)加工過程中致病菌的防控有利;耐藥菌的酸抗性有所增加,但不顯著,不足以產(chǎn)生抗性的交叉保護(hù),然而這可能與細(xì)菌的種類以及抗生素的耐藥機(jī)制相關(guān)。試驗(yàn)結(jié)果一定程度上說明質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因傳播不會增加食品生產(chǎn)加工過程中致病菌防控的負(fù)擔(dān),但耐藥性的提高仍會增加動物飼養(yǎng)以及臨床治療的難度,且目前相關(guān)的研究數(shù)量較少,細(xì)菌與抗生素種類的多樣性同樣不容忽視,需要更多深入的研究為耐藥性食源性致病菌的防控提供支持與參考。