1株非釀酒酵母2-苯乙醇合成規律及相關特性的初步研究

王琮杰,錢云開,閻賀靜,崔宗巖,石文琪,羅莉莎,肖艷霞,單超,葛超*

1(河北科技師范學院 食品科技學院,河北 秦皇島,066004)2(秦皇島海關技術中心,河北 秦皇島,066004)

非釀酒酵母是廣泛存在于葡萄園和釀造環境中的一類非常規酵母,常見的非釀酒酵母有美極梅奇酵母(Metschnikowiapulcherrima)、有孢漢遜酵母(Hanseniaspora)、戴爾有孢圓酵母(Torulasporadelbrueckii)等[1]。大量研究表明,非釀酒酵母具有豐富的胞外酶,能夠產生大量酯類、高級醇和揮發酸等香氣化合物,也能降低乙醇含量并調節酸度及顏色,可為葡萄酒增香、改善品質和提升風味多樣性拓寬途徑[2-3]。非釀酒酵母通常具有較低的發酵性能和乙醇耐受性,難以單獨完成乙醇發酵。因此,葡萄酒釀造過程中廣泛采用非釀酒酵母和釀酒酵母的混合發酵用于改善葡萄酒的感官品質。在混菌發酵過程中,非釀酒酵母與釀酒酵母間的交互作用影響代謝產物和微生物的生長,對于獲得葡萄酒所需性狀具有重要作用。因此,為控制和優化混菌發酵,了解和掌握非釀酒酵母和釀酒酵母間的生理和代謝交互作用非常必要。

群體感應是微生物界廣泛存在的細胞-細胞之間的通訊方式。許多真菌通過群體感應的形式進行交流,即通過分泌群體感應信號分子(quorum sensing molecules,QSM)來溝通和協調群體行為[4-5]。很多真菌既可以單細胞酵母形態生長,也可以絲狀酵母形態生長[6-7]。這種二型態被認為是一種古老的真菌特異性適應行為[8]。群體感應信號介導包括釀酒酵母在內的非致病真菌和致病性真菌(如白色念珠菌等)的二型態轉變。作為白色念珠菌的主要QSM,法尼醇抑制酵母形態到菌絲形態的轉換,而酪醇則促進白色念珠菌體由單細胞向多細胞菌絲的二型態轉變[9-10]。2-苯乙醇是釀酒酵母重要的QSM之一,由釀酒酵母在酒精發酵過程中通過Ehrlich途徑合成[11]。2-苯乙醇參與調節細胞密度和刺激假菌絲體的形成,外源添加2-苯乙醇也會導致細胞形態發生改變和單倍體侵入生長[12-15]。2-苯乙醇還參與酵母菌生物被膜的形成[16]。有研究認為作為酵母中樞碳代謝產物的2-苯乙醇等QSMs的合成反映了菌體代謝途徑通量,使酵母菌在不同環境條件下改變路徑優化生長[17]。在氮源豐富條件下酵母菌經莽草酸途徑合成少量2-苯乙醇,在氮源受限條件下,酵母通過Ehrlich途徑合成2-苯乙醇[18]。

目前發現有一些非釀酒酵母Hanseniasporauvarum、T.delbrueckii、M.pulcherrima、Starmerellabacillaris也能夠合成2-苯乙醇[19-20]。非釀酒酵母Kloeckeraapiculata不僅自身可以合成2-苯乙醇,而且6個與菌體成膜相關基因的表達也可被2-苯乙醇誘導,并產生細胞間黏附形成生物膜[21]。有些非釀酒酵母如Candidazemplinina和Dekkerabruxellensis,沒有檢測到任何已知的QSM[19]。不同非釀酒酵母菌株合成QSM的種類和能力不同,具有種特異性[22]。目前人們對非釀酒酵母的QSM研究重視不足,對2-苯乙醇在非釀酒酵母中的合成規律和影響以及其所引發的群體感應機制還不太清楚。因此,從性狀優良的本土非釀酒酵母中篩選出可以合成2-苯乙醇的菌株,并進一步研究2-苯乙醇在非釀酒酵母菌中的合成規律及作用將有助于對未來通過調節QSM來控制和優化混菌發酵過程提供理論依據。

本研究從實驗室前期分離鑒定的發酵性能優良的非釀酒酵母中篩選出1株具有明顯二型態轉換的非釀酒酵母Mp-57。采用GC法驗證了這株非釀酒酵母合成2-苯乙醇的能力,分析研究該菌株2-苯乙醇合成規律,并考察了外源添加2-苯乙醇對目標菌活性、生物被膜形成及乙醇耐受力的影響。以期為未來研究混菌發酵中非釀酒酵母和釀酒酵母的交互作用,以及群體感應機制提供菌株來源和基礎數據,也為葡萄酒混菌發酵體系的定向調控拓展研究思路和途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

商業釀酒酵母Ds(原產國:法國)、42株本土非釀酒酵母,河北科技師范學院食品科技學院。

酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose, YPD)培養基(g/L):葡萄糖20,蛋白胨20,酵母浸粉10,pH 6.0,121 ℃高壓滅菌20 min。

營養豐富(nutrient rich, NR)培養基:無氨基酵母氮源(yeast nitrogen base, YNB)1.7 g/L,葡萄糖20 g/L,(NH4)2SO445.4 mmol/L,瓊脂20 g/L。

限制性培養基(minimal medium, MM):YNB 1.7 g/L,葡萄糖20 g/L,5 μmol/LL-脯氨酸。

酵母基礎(synthetic dropout,SD)培養基:YNB 1.7 g/L,(NH4)2SO437.8 mmol/L,葡萄糖20 g/L。

合成低銨葡萄糖(synthetic low-ammonium detrose,SLAD)培養基:4×YNB 6.8 g/L,(NH4)2SO450 μmol/L,葡萄糖20 g/L,瓊脂20 g/L。

2-苯乙醇標準品,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;無水乙醇,天津歐博凱化工有限公司。

1.2 儀器與設備

7890A 氣相色譜儀,美國Agilent Technologies公司;BioSpec-mini 核酸蛋白分析儀,日本島津公司;EN PH pH計,上海梅特勒-托利多儀器有限公司;BHC-1300IIA2 生物安全柜,哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司;BL-320S 分析天平,北京賽多利斯天平有限公司;HVE-50 高壓滅菌鍋,上海天呈科技有限公司;BGZ-246 電熱鼓風干燥箱,上海博訊醫療生物儀器股份有限公司;YCP-5 生化培養箱,長沙華曦電子科技有限公司;THZ-82B 氣浴恒溫振蕩器,江蘇金壇市醫療儀器廠;MultifugeX3R 高速冷凍離心機,賽默飛世爾科技有限公司;QJD0025 酶標儀,美國伯騰儀器有限公司北京代表處。

1.3 實驗方法

1.3.1 限氮條件下二型態轉換非釀酒酵母菌株的篩選

實驗室篩選的非釀酒酵母試驗菌株在YPD固體培養基上,28 ℃活化培養48 h,挑取單菌落接種于YPD液體培養基中,28 ℃、120 r/min培養24 h,取活化菌懸液1 mL于9 mL蛋白胨生理鹽水中,搖勻,將其作為10-1稀釋濃度,依次稀釋至10-6,然后移取每個梯度稀釋菌懸液100 μL于SLAD固體平板上,涂布棒均勻涂抹,每組重復3次,28 ℃倒置培養。分別于7、14、21 d觀察菌落形態并拍照記錄。

1.3.2 非釀酒酵母Mp-57的2-苯乙醇合成鑒定

采用氣相色譜法進行2-苯乙醇的鑒定。

樣品準備:YPD培養基活化菌株,離心收集菌體,蒸餾水洗滌,MM液體培養基中28 ℃培養72 h,收集菌液凍存。

樣品預處理:取2 mL凍存液,10 000 r/min離心5 min除去菌泥,上清液用純水稀釋至合適倍數,然后用0.22 μm的濾膜過濾即得待測液。

GC-FID色譜條件:色譜柱:Agilent DB-WAX彈性石英毛細管柱(30 m×0.32 mm×0.5 μm);載氣He(≥99.999%),流速為2 mL/min;H2流速35 mL/min;空氣流速400 mL/min;進樣口溫度250 ℃;檢測器溫度300 ℃;升溫程序:初始溫度80 ℃保持2 min,以20 ℃/min升溫至220 ℃保持3 min;進樣方式:分流進樣,分流比10∶1,進樣量1 μL。

1.3.3 非釀酒酵母菌Mp-57的2-苯乙醇合成規律研究

28 ℃,YPD培養基活化非釀酒酵母Mp-57和釀酒酵母Ds(對照),6 500 r/min離心收集菌泥,蒸餾水清洗后接種于MM培養基中,初始接種密度分別調整至4×103、4×105、4×107CFU/mL。然后28 ℃、120 r/min培養78 h,每隔6 h取樣,一部分樣品6 500 r/min離心10 min,上清液-20 ℃凍存,用于GC測定2-苯乙醇含量;另一部分樣品用血球計數板及美蘭染色法測定活細胞數。

樣品預處理:取2 mL凍存上清液,10 000 r/min離心5 min棄沉淀,上清液用純水稀釋至合適倍數,然后用0.22 μm濾膜過濾即得GC法2-苯乙醇定量分析待測液。

GC法測定2-苯乙醇含量,測定條件同GC-FID條件。以標準2-苯乙醇溶液繪制標準曲線進行定量分析。2-苯乙醇合成速率計算如公式(1)所示[20]:

(1)

式中:R2-苯乙醇,2-苯乙醇合成速率,fg/(cell·h);C2-苯乙醇,2-苯乙醇質量濃度,mg/L;c,細胞濃度,cell/mL;t,時間,h。

1.3.4 外源添加2-苯乙醇對非釀酒酵母Mp-57及釀酒酵母Ds生長的影響

將Mp-57和Ds(對照)在YPD液體培養基中28 ℃、120 r/min預培養24 h,分別以106CFU/mL的量接種至2組10 mL SD培養基中,一組添加2-苯乙醇至終濃度(質量濃度)分別為5 μmol/L(0.6 mg/L)、50 μmol/L(6 mg/L)及500 μmol/L(60 mg/L),另一組添加相同體積水作對照,置于120 r/min的搖床中28 ℃培養72 h,通過血球計數板計數、測定OD600nm評價細胞生長情況。

1.3.5 外源添加2-苯乙醇對非釀酒酵母Mp-57及釀酒酵母Ds生物被膜形成能力的影響

為檢測2-苯乙醇對Mp-57和Ds生物被膜形成能力的影響,將Mp-57和Ds(對照)在YPD培養基中28 ℃培養24 h,收集和清洗后用YPD重懸,調整細胞濃度為107CFU/mL,取20 μL 107CFU/mL的培養物,加入到每孔含有180 μL YPD培養基的96孔板中,處理孔中分別加入2-苯乙醇至終濃度5、50、500 μmol/L,空白對照組加入相同體積水,于28 ℃保溫培養72 h,每個處理重復4次。用200 μL PBS清洗2次去除游離細胞,之后用200 μL 0.4%(體積分數)結晶紫(crystal violet,CV)溶液在室溫下染色45 min,PBS重復清洗4次后,每孔加入95%(體積分數)乙醇200 μL,室溫處理45 min,輕微搖晃以洗脫CV。移取100 μL脫色液到另一塊96孔板中,使用酶標儀測量OD630nm值。

1.3.6 外源添加2-苯乙醇對非釀酒酵母菌Mp-57及釀酒酵母Ds乙醇耐受性的影響

將Mp-57和Ds(對照)在YPD液體培養基中28 ℃振蕩培養24 h,離心收集菌泥,蒸餾水洗滌2次后用YPD重懸,將菌體密度均調整至107CFU/mL,取相同濃度菌液1 mL離心,菌泥用YPD重懸,加入無水乙醇至終體積分數為15%,混勻后再加入2-苯乙醇至終濃度分別為5、50、500 μmol/L,對照加入水,置于28 ℃恒溫培養箱中培養,分別于30、60、90 min取樣20 μL,稀釋相同倍數后,點接至YPD平板上,培養24 h后拍照記錄生長情況。

1.4 數據處理

采用Excel 2016進行基本數據處理,SPSS 26進行數據統計分析,Origin 2022進行相關圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 限氮條件下二型態轉換非釀酒酵母菌株的篩選

氮是自發酵葡萄醪中微生物生長的主要限制性營養元素。釀酒酵母能根據環境營養供應情況調整自身生長形態以適應環境變化。在氮源受限時,2-苯乙醇等QSM介導釀酒酵母由單細胞酵母形態轉變為絲狀形態生長。為研究非釀酒酵母的群體感應機制,將前期實驗室篩選鑒定過的性狀優良的非釀酒酵母菌株,分別接種到SLAD(限制氮源)和NR(豐富氮源)2種培養基上。觀察21 d培養期間平板菌落形態變化,篩選發現一株非釀酒酵母Mp-57(Mp-57 ID NO Z1392-30Metschnikowiaaff)為美極梅奇酵母,僅在SLAD平板上分化形成假菌絲。從圖1可以看到該菌株在NR平板上菌落邊緣一直保持光滑,無明顯變化;SLAD平板上7 d已分化形成明顯假菌絲,并隨時間延長形成向各個方向輻射的絨毛狀菌絲。

圖1 限制氮源平板篩選二型態轉換菌株

2.2 非釀酒酵母Mp-57的2-苯乙醇合成規律研究

2-苯乙醇在釀酒酵母菌二態型轉換中發揮重要作用。2-苯乙醇合成基因突變后,菌體不能形成假菌絲。添加2-苯乙醇,釀酒酵母重新分化形成假菌絲,恢復部分野生型表型[12]。利用SLAD平板篩選獲得一株具有二型態轉換的Mp-57。推測在相同自然環境中生存的Mp-57菌株也能合成2-苯乙醇,并誘導菌絲基因表達,使菌體在氮源受限時發生二型態轉換[8]。采用GC法,以二型態轉換明顯的商業釀酒酵母菌株Ds為陽性對照,驗證了非釀酒酵母Mp-57在限氮培養基中存在2-苯乙醇。

釀酒酵母2-苯乙醇合成與細胞密度相關[12, 23],高群體密度刺激芳香醇合成。由圖2結果可知,盡管生長曲線不同,Mp-57菌株2-苯乙醇合成的起始具有細胞密度依賴性。與Ds(對照)均在細胞密度達到107CFU/mL時,開始檢測到2-苯乙醇。Ds菌株2-苯乙醇合成的細胞密度閾值與已報道的研究結果基本一致[23]。其次Mp-57上清液中2-苯乙醇含量隨細胞密度增加而增加,靜止期達到最大值,之后保持在較高水平。另外不同初始接種密度下,Mp-57菌株2-苯乙醇合成量始終顯著高于對照(圖3)。如高接種密度(4×107細胞/mL)下Mp-57菌株2-苯乙醇含量最大值為146 mg/L,是Ds菌株的4倍。表明Mp-57在限氮條件下,Ehrlich途徑非常活躍,超過Ds。與GONZLEZ等[20]的研究認為非釀酒酵母2-苯乙醇合成能力普遍低于釀酒酵母的結論不同。我們篩選的另一株庫德畢赤酵母H1的2-苯乙醇合成量也顯著低于Mp-57。即非釀酒酵母2-苯乙醇的合成有種屬特異性。

a-釀酒酵母Ds(對照);b-非釀酒酵母Mp-57

圖3 不同初始接種密度下Mp-57及Ds不同生長階段上清液2-苯乙醇含量

釀酒酵母菌體2-苯乙醇合成除受細胞密度影響以外,還受環境氮源水平影響。在菌體不同生長階段,隨著培養基氮源消耗,2-苯乙醇合成相關基因表達發生變化,合成速率不斷改變[23]。為研究Mp-57菌株細胞內2-苯乙醇合成能力變化規律,利用已測得的78 h培養過程中,不同取樣點活細胞數和2-苯乙醇含量,換算成2-苯乙醇合成速率并繪制變化曲線(圖4)。發現Mp-57的2-苯乙醇合成速率,在對數期不斷增加,對數期末期增至峰值,在進入靜止期后迅速降低(圖4),盡管合成速率在不斷降低,但從總體上看靜止期培養液中2-苯乙醇累積含量持續保持在較高水平。菌體在靜止期2-苯乙醇合成速率的迅速降低,可能由于生長環境中營養缺乏,細胞整體代謝水平下降導致2-苯乙醇合成前體物苯丙氨酸不足所致[20]。

a-4×103細胞/mL;b-4×105細胞/mL;c-4×107細胞/mL

2.3 外源添加2-苯乙醇對非釀酒酵母Mp-57及釀酒酵母Ds菌株的影響

釀酒酵母合成分泌2-苯乙醇參與自身細胞生長、形態變化、生物被膜形成等生理過程[4]。進化上同源的非釀酒酵母在混菌發酵體系中,是否也是利用2-苯乙醇調控上述生理過程尚不清楚,因此根據2.2節中Mp-57及Ds的2-苯乙醇含量測定結果,并參考以往2-苯乙醇對菌體影響的相關文獻[12,16],研究不同濃度2-苯乙醇對Mp-57及Ds發酵相關特性的影響。

2.3.1 外源添加2-苯乙醇對非釀酒酵母Mp-57菌株生長的影響

選用可以抑制內源性2-苯乙醇合成的含有高濃度(NH4)2SO4的SD培養基[12],以各自未處理菌株為對照,用5、50、500 μmol/L 3種不同濃度2-苯乙醇分別處理Mp-57和Ds培養液,然后測定相同培養時長后菌體細胞量,以評價該化合物對Mp-57及Ds菌株生長的影響。從圖5可以看出,當2-苯乙醇處理濃度為5 μmol/L時,Mp-57和Ds菌體生長量與各自對照相比無明顯變化;當處理濃度提高至50 μmol/L,Mp-57和Ds菌體量與各自對照相比分別增加了80%和62.5%;繼續增加2-苯乙醇濃度至500 μmol/L時,Mp-57和Ds菌體量與各自對照相比分別下降了20%和25%,與國內研究報道高濃度2-苯乙醇有細胞毒性的結論相符[24]。2-苯乙醇對2株菌生長的影響呈現相同的規律,即在50 μmol/L濃度時促進菌體生長,500 μmol/L濃度時有細胞毒性,抑制菌體生長。此結果表明2-苯乙醇以劑量依賴方式影響Mp-57菌株和Ds菌株的生長,暗示作為已知釀酒酵母QSM的2-苯乙醇,也可能是Mp-57的信號分子,而且在菌體不同生長階段下發揮不同的生理效應。目前已有研究利用2-苯乙醇對釀酒酵母菌生長的抑制作用,通過在發酵培養基中添加2-苯乙醇降低菌體生物量來提高目的物乙醇產量[25]。

圖5 外源添加2-苯乙醇對Mp-57及Ds生長的影響

2.3.2 外源添加2-苯乙醇對非釀酒酵母Mp-57生物被膜形成能力的影響

生物被膜是一種微生物群落形式,微生物通過形成生物被膜這種群落結構,可以更好地適應高滲透壓、熱休克、氧化應激和營養缺乏等不利環境條件[26]。群體感應參與調節真菌的許多種群水平行為,如致病/毒力和生物被膜形成[5,10,27-28]。研究顯示酵母細胞形成生物被膜,有助于提高固定化發酵產品乙醇含量[29],也有利于生物膜反應器中進行的工業發酵[30]。如圖6所示,5 μmol/L的2-苯乙醇對2株菌生物被膜形成均無顯著影響;50 μmol/L的2-苯乙醇促進Mp-57菌株形成生物被膜,與自身未處理菌株相比,Mp-57在處理后,成膜能力提高28.7%。測定Ds成膜情況時發現50 μmol/L的2-苯乙醇顯著抑制Ds成膜。當處理濃度提高至500 μmol/L時,2-苯乙醇對Mp-57和Ds兩株菌生物被膜的形成抑制率分別為38%和44.3%。從圖6中明顯也可以看出,即使在未添加2-苯乙醇的條件下,Mp-57成膜能力也顯著高于Ds。表明Mp-57未來在生物膜固定化混菌發酵中可能有著良好的應用前景。

圖6 外源添加2-苯乙醇對Mp-57及Ds生物被膜形成能力的影響

2.3.3 外源添加2-苯乙醇對非釀酒酵母Mp-57乙醇耐受性的影響

在前面研究中發現,不同濃度2-苯乙醇對Mp-57和Ds生長及生物被膜形成產生不同影響,這些性狀變化與菌體對抗不良環境耐受力相關。因此為評價2-苯乙醇是否會提高Mp-57和Ds對乙醇的耐受性。參照文獻[31]中的方法,采用5、50、500 μmol/L 3種不同濃度的2-苯乙醇處理含有15%(體積分數)乙醇的Mp-57及Ds菌體培養液,對照與處理組完全相同,僅未添加2-苯乙醇。結果見圖7。

圖7 外源添加2-苯乙醇對Mp-57及Ds乙醇耐受性的影響

從2-苯乙醇添加量為0的對照平板菌落可以看出,15%(體積分數)乙醇處理不同時間,釀酒酵母Ds殘余菌落密度無明顯變化,表現出很高的乙醇耐受性;與釀酒酵母Ds相比,Mp-57在乙醇脅迫90 min后,菌落密度明顯降低,表明Mp-57的乙醇耐受性低于釀酒酵母Ds,這與美極梅奇酵母具有較低乙醇耐受性的研究報道相符[32]。觀察Mp-57和Ds在添加50 μmol/L的2-苯乙醇后,乙醇脅迫30、60、90 min后取樣涂板培養相同時間,平板上殘余菌落密度與各自對照相比均明顯增加。表明50 μmol/L的2-苯乙醇可以提高Mp-57和Ds菌株對15%(體積分數)乙醇耐受性。這可能是由于該濃度的2-苯乙醇能顯著促進2株菌生長的原因。5 μmol/L的2-苯乙醇對2株菌生長沒有顯著影響,所以添加此濃度的2-苯乙醇后殘余菌落密度,與相應對照比較無明顯變化。500 μmol/L的2-苯乙醇顯著抑制Mp-57和Ds的生長,但添加此濃度2-苯乙醇后,2株菌與同樣受乙醇脅迫的相應對照相比,菌落密度變化不明顯,可能由于實驗初始菌體濃度較高,因而一定程度上會削弱2-苯乙醇抑制效果。

3 結論

本研究從實驗室前期分離鑒定的非釀酒酵母中,篩選出1株具有二型態轉換的非釀酒酵母Mp-57。GC法鑒定出Mp-57能合成2-苯乙醇。測定并分析Mp-57菌株2-苯乙醇合成規律,發現2-苯乙醇合成起始具有細胞密度依賴性。其次,發現2-苯乙醇合成速率變化曲線呈鐘形,即開始時合成速率隨著培養時間延長不斷增加,對數期末期達到最大值,然后迅速降低。這種合成速率變化導致上清液中2-苯乙醇合成量從開始不斷增加,到靜止期末期達到高峰并維持在高含量水平。不同于以往研究認為釀酒酵母2-苯乙醇合成能力更強,篩選到的二型態轉換明顯的Mp-57菌株,其2-苯乙醇合成能力更強,其總合成量顯著高于釀酒酵母Ds。最后,我們還考察了外源添加2-苯乙醇對Mp-57及Ds菌株發酵相關性狀的影響,發現2-苯乙醇類似信號分子,以劑量依賴方式影響菌體生長、成膜及乙醇耐受性。本文對混菌發酵體系中由2-苯乙醇引發的酵母間代謝交互作用和風味物質的修飾研究具有重要理論意義,并為定向調控混菌發酵風味物質研究奠定基礎。