添加不同生物炭對人工窖泥培養微生物群落影響

陳思恒,寧欣強,2*,唐棠,羅惠波,2,鄭佳,李華志,甘元甲

1(四川輕化工大學 生物工程學院,四川 自貢,643000)2(釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室,四川 宜賓,644000)3(宜賓五糧液股份有限公司,四川 宜賓,644000)4(資中縣銀山鴻展工業有限責任公司,四川 內江,641000)5(四川佳樂酒業股份有限公司,四川 瀘州,646000)

中國白酒,作為世界六大蒸餾酒之一,以其獨一無二的風味著稱于世[1]。濃香型白酒作為白酒四大香型之一,具有窖香濃郁、綿柔醇厚、香味協調等特點[2]。窖池作為白酒釀造的容器,窖泥中含有己酸菌、甲烷菌等多種功能微生物,通過這些微生物的代謝活動,賦予了濃香型白酒獨特的風味;這使窖泥成為濃香型白酒生產中最關鍵的部分之一,因此優質人工窖泥的培養成為生產優質白酒的前提[3-4]。目前人工窖泥培養研究主要包括窖泥配方優化、外源制劑添加、微生物作用機制和預防窖泥老化和復壯等方面[5]。但人工窖泥培養過程還存在水分易流失、營養物質利用率低、功能菌富集較慢等問題[6]。因此,加快培養的人工窖泥向優質老窖泥轉化,提高人工窖泥培養質量具有重要的理論和現實意義。

生物炭常作為土壤改良劑,其對土壤理化性質和微生物群落結構具有較大的影響。而人工窖泥一般選用黃泥作為基質,與土壤有一定的相似性。生物炭是一種在缺氧狀態下高溫分解得到的比表面積大、孔隙發達且富含碳素的生物質炭,被廣泛運用于環境等領域[7-8]。人工窖泥培養過程添加生物炭預期能夠提高碳氮比,改善窖泥含水量、pH,進而調節窖泥微生物群落結構。在人工窖泥培養過程中,生物炭的孔隙能定植微生物細胞并且能保住水分[9-10],高堿度可以延緩窖泥pH過度降低,豐富的表面含氧官能團(oxygenated functional groups,OFGs)能促進電子遷移,加快微生物生長代謝活性,增強生物量及酶活性[11];另外生物炭富含大量羧、醇羥基等,能進一步提高窖泥保水性[12],加快人工窖泥向優質老窖泥轉化。生物炭原料在結構、內含物等方面存在差別,不同原料高溫裂解后在結晶度、交聯和分支等結構特征上差異顯著[13]。竹子等生物炭木質素含量高,炭化后大孔徑結構多;而秸稈類生物炭由于纖維素含量高,炭化后結構以微孔為主,相比竹子生物炭,其灰分含量、礦物質種類和pH略高。另在碳含量上,秸稈生物炭一般為40%～80%,其他生物炭一般為60%～85%[14]。所以不同種類的生物炭在理化性質和結構上有明顯差異,故有必要針對不同來源的生物炭對人工窖泥培養過程影響進行研究。

本研究選用宜賓本地某酒廠窖泥培養原料,在實驗室條件下培養人工窖泥,分析添加丟糟生物炭(馬弗爐燒制ZM、熱解氣化燒制ZR)、玉米秸稈生物炭(YM)、稻殼生物炭(DK)、水稻秸稈生物炭(SD)、竹生物炭(ZT)6種不同生物炭和不添加生物炭(B)的人工窖泥,在培養開始和結束(90 d)時微生物群落結構、內部菌屬相關性、理化與微生物相關性的差異。對微生物群落結構與理化性質之間的相關性進行分析,解讀生物炭添加對人工窖泥培養過程微生物種群結構的影響,為生物炭加快人工窖泥向優質老窖泥轉化提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

培養人工窖泥材料均選取宜賓本地某酒廠;生物炭材料丟糟生物炭(馬弗爐燒制、熱解氣化燒制)、玉米秸稈生物炭、稻殼生物炭、水稻秸稈生物炭、竹子生物炭(具體參數見表1);其他試劑均為國產分析純。

表1 生物炭來源及主要特征參數

1.2 儀器與設備

PHB-4型pH計,上海儀電科學儀器股份有限公司;7890A氣相色譜儀,美國Agilent公司;LRH-250恒溫培養箱,上海一恒科學儀器有限公司;TG-10臺式離心機,四川蜀科儀器有限公司;101型鼓風干燥箱,北京中興偉業儀器有限公司;T6新世紀分光光度計,北京普析通用儀器有限公司;RR224ZH/E電子分析天平,奧豪斯儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 生物炭添加量及窖泥樣本采集

各種生物炭添加量均為15%(質量分數),采用五點取樣法對窖泥進行采樣,原始窖泥樣本標記為B_S;培養90 d后,未添加生物炭空白組窖泥樣本標記為B_E;添加丟糟生物炭(馬弗爐燒制和熱解氣化燒制)、玉米秸稈生物炭、稻殼生物炭、水稻秸稈生物炭、竹子生物炭的窖泥樣本分別標記為ZM_E、ZR_E、YM_E、DK_E、SD_E、ZT_E。

1.3.2 理化性質分析

樣品預處理:將1 g窖泥加入10 mL水中,充分搖勻,8 000 r/min離心10 min,將上清液通過20 μm濾膜轉移至離心管中儲存在冰箱中備用,即為樣品液。

采用烘干干燥法測定窖泥含水量;使用pH計測定窖泥pH值[15];采用納氏試劑分光光度法(HJ 535—2009)測定窖泥銨態氮含量;采用修正的Folin-Lowry法測定窖泥腐殖質含量[16];采用比色法測定窖泥有機酸含量[17]。采用固相微萃取技術結合氣相色譜-質譜聯用儀(solid-phase microextraction combined with gas chromatography-mass spectrometry,SPME-GC-MS)檢測窖泥己酸含量。取1 g窖泥樣品于25 mL頂空瓶中,加入5 mL超純水2 g NaCl,再加入50 μL乙酸正丁酯(色譜純)作為內標,混勻后超聲振蕩30 min。用萃取針在50 ℃下萃取30 min。GC條件:不分流,進樣口溫度230 ℃;升溫程序:40 ℃保持5 min,以4 ℃/min升溫至100 ℃不保持,以6 ℃/min升溫至230 ℃保持10 min;MS條件:傳輸線溫度230 ℃,電離方式為電子電離源,電子能量70 eV,離子源溫度230 ℃。

1.3.3 宏基因組提取和微生物群落結構組成分析

將窖泥樣品取少許于取樣管中,委托上海美吉生物科技有限公司完成DNA抽提和測序。具體操作如下,抽提DNA樣品,利用1%(質量分數)瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA,并對DNA抽提產物進行PCR擴增和純化。采用熒光定量對PCR產物進行定量分析和均一化,建立PE文庫并Illumina MiSeq雙端測序,得到原始序列。其中16S rRNA擴增子引物對為515 FmodF:5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′,和806RmodR:5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′,擴增區為16S rRNA的V4區[18-19]。

采用軟件對測序原始序列進行質控,包括序列拼接,去除含有N的序列、引物、接頭、質量值低于20的堿基、長度低于200 bp的序列及嵌合體序列得到有效序列。使用軟件對有效序列進行分類,通過Illumina MiSeq平臺,ASV分析流程對數據處理分析,并在物種分類水平統計每個樣本的微生物群落組成。利用ASV分析結果,計算Shannon、Chao1等α多樣性指數與冗余分析(redundancy analysis,RDA)等β多樣性分析[15]。并完成后續的微生物群落分析。

2 結果與分析

2.1 理化性質分析

對培養90 d后人工窖泥理化參數作顯著性分析(P<0.05),結果如表2所示。生物炭添加顯著影響窖泥pH、含水量、腐殖質等。添加SD、YM,窖泥的pH顯著提高(相比空白組高0.40和0.39),這主要是由于生物炭有較高的堿度,延緩了pH的降低。添加ZM、SD、DK窖泥含水量顯著高于空白組窖泥,含水量分別提高了 4.02%、2.13%、0.68%,主要是因生物炭表面有大且豐富的孔徑和醇羥基等結構鎖住窖泥部分水分,提高窖泥的保水性。添加生物炭窖泥腐殖質等營養物質利用率顯著提高,是由于生物炭富含OFGs,促進種間電子傳遞,微生物代謝加快所致。

表2 人工窖泥樣品理化參數

2.2 α多樣性分析

如表3所示,培養90 d后的窖泥樣本較原始樣本豐富度指數(Chao1)降低。相較新窖泥,優質老窖泥Chao1指數會有一定程度的下降,表明人工窖泥在向老窖泥轉化[20-21]。除YM和DK組外,其他生物炭添加組的物種豐富度均高于空白窖泥樣本,添加SD窖泥Chao1指數相比空白組提高幅度達9.15%。除ZM組外,其余組窖泥多樣性均下降。添加ZM、SD、ZR、ZT窖泥多樣性Shannon指數比空白組高18.52%、12.15%、8.15%和4.81%,其中ZM組窖泥多樣性最高。各組窖泥樣品多樣性指數隨著窖齡增加總體呈上升趨勢[22],且趨近于優質窖泥的多樣性指數(Shannon 5.50～6.45)[15]。表明添加生物炭,能夠使適應環境的微生物種群得到更好的富集并成為穩定的優勢種群[23]。這可能是由于生物炭擁有豐富的多孔結構和OFGs,提高了人工窖泥豐富度和多樣性的同時,加快微生物的富集。

2.3 β多樣性分析

如圖1-a所示,所有窖泥在屬水平上共有55種。其中主要是Caproiciproducens(19.87%)、Clostridium_sensu_stricto_12(16.26%)為己酸菌和梭狀芽孢桿菌(圖1-b)。說明這共有屬如Caproiciproducens和Clostridium_sensu_stricto_12是窖泥中重要的功能微生物,共同主導窖泥培養的正常進行。

如圖2所示,添加生物炭后人工窖泥優勢功能微生物屬得到富集,重要的功能優勢古生菌Methanosarcina[22,24]也得到富集。對比空白組窖泥,除YM組外,其他添加生物炭組窖泥Caproiciproducens和Clostridium_sensu_stricto_12等優勢功能菌屬相對豐度都有明顯增加。對比不同生物炭,添加DK窖泥組的Caproiciproducens菌屬、DK、ZM、ZR窖泥Clostridium_sensu_stricto_12菌屬均高于空白和原始組窖泥樣本。同時Lactobacillus菌屬相對含量較空白組都有降低,添加ZM窖泥Lactobacillus菌屬相對豐度更少,這是由于己酸菌、梭菌產生己酸等抑制了部分Lactobacillus生長[25]。說明添加ZM組窖泥微生物富含較為豐富的Caproiciproducens外,有利于Clostridium_sensu_stricto_12和Methanosarcina等優勢菌生長,同時抑制Lactobacillus生長效果更明顯,能加快人工窖泥向優質老窖泥轉化。這可能是生物炭擁有豐富的OFGs,促進了種間電子傳遞,加快了微生物生長代謝。

圖2 各窖泥樣品中相對豐度前50屬水平微生物種群柱狀圖

通過熱圖進一步分析窖泥微生物屬種,結果如圖3所示。所有微生物屬分別隸屬于8個門,主要分布在Firmicutes。其中Caproiciproducens、Clostridium_sensu_stricto_12、Lactobacillus為窖泥中的優勢菌屬,與已報道四川酒企的窖泥中優勢菌屬類有高度的一致性[15]。

圖3 各樣品窖泥相對豐度前50屬水平微生物種群熱圖

如圖3所示,聚類分析結果表明,原始窖泥樣本為單獨一大簇(Ⅰ),培養后的窖泥為另一大簇(Ⅱ)。培養90 d后YM、SD分為一個亞簇,ZM、DK、ZR分為一個亞簇,B、ZT又分為一個亞簇。表明窖泥培養后在微生物屬種上具有差異性。除ZT外,其他生物炭添加窖泥組較空白組在微生物屬種上差異顯著。原始窖泥樣本中存在豐度較高的norank_f__norank_o__Chloroplast等微生物屬,在窖泥研究的文獻中其功能并不明確。在添加生物炭培養后,這類微生物相對含量明顯減少甚至消失。添加ZM、DK、ZR窖泥培養后有相似的微生物組成,與Caproiciproducens和Clostridium_sensu_stricto_12有較強的相關性,與Myxococcus和Sporosarcina菌屬則呈顯著負相關。YM、SD窖泥中則與Acidipropionibacterium和Weissella等菌呈著正相關,表明添加ZM、DK、ZR的窖泥與釀酒重要優勢功能微生物有更強相關性,和Lactobacillus相關性更弱。此類生物炭表面孔徑更豐富更密集,表面OFGs更多,對人工窖泥理化性質和微生態環境調節效果更好,更有利于加快人工窖泥向優質老窖泥轉化。

2.4 窖泥微生物群落網絡相關性分析

根據Spearman相關性(|ρ|>0.6,P<0.05),分析分類學總豐度前50的物種,結果如圖4-a所示。這些微生物共49個節點,所有節點都隸屬于8個門,主要集中在Firmicutes,占所有節點的71%。各窖泥樣品中共存在5個樞紐,都屬于Firmicutes,在網絡中十分重要(圖4-a)。在添加生物炭培養后,窖泥中微生物分為了2個模塊,其中1個是以Firmicutes為主的主體部分,占了網絡相關性中絕大部分,Clostridium_sensu_stricto_12和Caproiciproducens在網絡中最為重要,它們都是己酸菌且呈正相關,這與已有文獻報道一致[22]。添加生物炭不會使窖泥微生態穩定性變差或退化,不會受到Lactobacillus等微生物對窖泥網絡平衡造成的影響。

a-水平微生物網絡相關性圖;b-共線性網絡圖

共線性網絡如圖4-b所示,不同生物炭添加,對培養后人工窖泥中微生物組成會造成明顯差異。原始窖泥樣本獨有屬種種類較多,添加生物炭會抑制這些微生物生長,并促進Caproiciproducens、Clostridium、Bacillus、Methanobacterium等菌屬富集。添加ZM窖泥組與Clostridium_sensu_stricto_19、Roseburi和g__unclassified_o__norank_c__Clostridia有較強的相關性,此類微生物都是在釀酒過程中能起到重要作用的梭菌。ZR、ZT窖泥組與Clostridium_sensu_stricto_11有較強的相關性。DK則沒有與特有的功能微生物有強相關性,多樣性不強。這可能是由于ZM等擁有更豐富的OFGs增強了種間電子傳遞效率,富集了更多種類的釀酒功能微生物。同時也表明己酸菌作為窖泥中關鍵的微生物,能聯系其他微生物從而帶動整個窖泥正常運行[26-27]。

2.5 窖泥微生物群落與理化因子相關性分析

基于窖泥核心菌群與理化性質的RDA,結果如圖5-a所示。理化因子對RDA1和RDA2解釋度依次是pH(99.67%)>有機酸(86.05%)>腐殖質(75.25%)>水分(49.61%),其中pH和含水量與微生物群落結構呈現極顯著關系(P<0.01),添加不同生物炭的窖泥也被明顯區分。圖5-a表明,添加生物炭主要與pH、含水量和銨態氮等具有相關性,而pH和含水量是提高窖泥質量的主要驅動力[28-29],添加生物炭有利于提升窖泥質量。添加YM、SD主要影響窖泥pH,ZM、ZR主要影響窖泥含水量,DK、ZR則主要影響窖泥銨態氮和己酸。微生物影響方面,添加生物炭主要與窖泥內Caproiciproducens、Clostridium_sensu_stricto_12、Methanobacterium和Hydrogenispora有顯著相關性。添加ZR、ZM和DK與Clostridium_

a-冗余分析;b-熱圖

sensu_stricto_12呈正相關。ZR和DK與Caproiciproducens呈正相關。YM、SD和ZM窖泥則與Methanobacterium和Hydrogenispora呈正相關性。說明添加生物炭能影響窖泥優勢功能微生物的生長,添加ZR、ZM和DK影響窖泥Clostridium_sensu_stricto_12菌屬的富集,ZR和DK影響窖泥Caproiciproducens菌屬的富集。同時含水量、pH、銨態氮與Lactobacillus呈負相關,這與畢天然等[30]研究相符。pH及乳酸菌分別與大部分菌群和梭菌呈負相關,這與吳浪濤[26]的研究相符。但銨態氮、腐殖質與窖泥細菌有較強的相關性,與pH、含水量有負相關,這與較多學者的研究結果有差異[29-32]。

理化性質與微生物相關性熱圖如圖5-b所示。pH、含水量和腐殖質與微生物呈顯著相關性。pH降低與Methanobacterium呈極顯著相關,而Methanobacterium產甲烷菌系是窖泥中功能古菌[23,33]。含水量和pH降低與Caproiciproducens和Clostridium_sensu_stricto_12呈負相關性。所以pH帶來窖泥質量的影響可能與Methanobacterium有關。添加生物炭提高窖泥保水性并延緩pH降低,較高的含水量和偏中性的pH更有利于窖泥質量提高。

3 結論

本研究利用高通量測序技術研究添加不同生物炭對人工窖泥培養過程中微生物群落的影響,結果表明添加ZM窖泥含水量比空白組窖泥高4.02%,含水量提高有利于加快人工窖泥向優質窖泥的轉化。添加ZM窖泥Shannon指數比空白組提高18.25%,多樣性更趨近于優質老窖泥的多樣性指數(Shannon 5.50～6.45)。添加ZM組能保證Caproiciproducens豐富度較高情況下,促進Clostridium_sensu_stricto_12等窖泥內產己酸功能微生物富集,其相對含量較空白組提高了7.99%,同時抑制Lactobacillus等對窖泥質量有不利影響的微生物生長,其相對含量較空白組減少了10.10%。RDA結果表明添加ZM與Clostridium_sensu_stricto_12有正相關性,且與Lactobacillus顯著負相關。本研究為生物炭應用于人工窖泥向優質老窖泥轉化提供了微生物學理論基礎。