基于非靶向代謝組學分析辣木葉發酵前后營養物質及代謝物變化

李曦明,溫燕龍,楊雪瑩,劉昱輝,李凌飛*,田洋, 2,3*

1(云南農業大學 食品科學技術學院,云南 昆明,650201)2(國家辣木加工技術研發專業中心(云南農業大學),云南 昆明,650201)3(普洱學院,云南 普洱,665000)

辣木(Moringaoleifera),又名鼓槌樹[1-2]。廣泛栽種于非洲、亞洲及拉丁美洲熱帶、亞熱帶地區[3]。目前,云南、廣東、海南及福建等省大量栽培。辣木富含蛋白質、維生素A、葉酸、鈣、鐵、硒等營養素,及類胡蘿卜素、酚類、黃酮類、植物甾醇、生物堿、有機酸類等功能成分。因此,辣木擁有“奇跡樹”和“母親最好的朋友”等美稱[4]。已有研究表明,辣木具有抗氧化、降血糖、降血脂、降血壓、抗癌、抗炎、抗衰老、調節腸道功能、調節睡眠質量等功效[5-7]。

固態發酵是在基本無游離水的固體基質上進行的發酵過程[8]。固態發酵可以提高副產物的營養價值[9],且具有操作簡單、成本低、廢水產量低和生產效率高[10-11]等優點。在發酵過程中,微生物可以分泌降解底物分子所需的酶[10],因此,固態發酵是生產生物活性物質的一種經濟有效的方法[9,12]。目前,利用固態發酵來提高物質的營養價值或生物活性已成為當前的研究熱點。

本研究以辣木葉為研究對象,以植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)為發酵菌種,探究辣木葉發酵前后蛋白質、黃酮、多糖、多酚的含量變化,測定其抗氧化能力,并利用超高效液相色譜高分辨質譜(ultra high performance liquid chromatography-orbitrap exploris-mass spectrometry,UHPLC-OE-MS)技術深入探討辣木葉發酵前后物質成分的變化,以期為乳酸菌發酵辣木葉的代謝物鑒定提供理論依據,為開發相關辣木葉功能食品提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣木葉,云南紅河谷辣木產業有限公司;植物乳桿菌CICC 194165,中國工業微生物菌種保藏管理中心。

甲醇、乙酸(色譜純),美國Fisher Chemical公司;福林-酚試劑、沒食子酸(分析純),上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

400Y粉碎機,鉑歐五金制品有限公司;LRH-250智能生化培養箱,鄭州生元儀器有限公司;FD-1A-50冷凍干燥機,上海比朗儀器制造有限公司;Vanquish超高效液相、Orbitrap Exploris120高分辨質譜儀,美國賽默飛公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備

取50 g干辣木葉粉,于121 ℃滅菌15 min,冷卻后將辣木葉粉轉移到發酵盤中,加入30 mL無菌水,調整初始含水量為60%,接種量5% 3×108CFU/mL的植物乳桿菌菌液,攪拌均勻,38 ℃發酵10 d。發酵結束后將辣木葉粉凍干,-20 ℃下保存備用。

1.3.2 蛋白質含量測定

參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》進行測定。

1.3.3 黃酮含量的測定

以蘆丁為標準品,繪制標準曲線[2]。稱0.5 g辣木葉粉,加體積分數60%乙醇30 mL,超聲30 min,離心后用乙醇定容至25 mL。取0.5 mL,加0.3 mL 50 g/L NaNO2溶液,0.3 mL 100 g/L Al(NO3)3溶液,4 mL 40 g/L NaOH溶液,15 min后定容至10 mL。于510 nm測定吸光度,計算總黃酮含量,如公式(1)所示,單位為mg/GAE 100 g。

(1)

式中:ρ,黃酮質量濃度,mg/mL;V1,提取液總體積, mL;V2,吸取提取液體積, mL;m,辣木葉質量,g。

1.3.4 多酚含量測定

以沒食子酸為標準品,繪制標準曲線。分別取0.8、1.6、2.4、3.2、4.0、6.0 mL沒食子酸標準品于試管中,取1 mL 10 mg/mL的辣木葉醇溶樣品于試管中,加入2 mL 70 g/L的NaHCO3溶液,隨后加入1 mL福林酚溶液,于765 nm處測定吸光度,如公式(2)所示:

(2)

式中:ρ,多酚質量濃度,mg/mL;V1,稀釋體積, mL;V2,樣品體積, mL;V3,取樣體積, mL;m,樣品質量, g。

1.3.5 多糖含量的測定

參考郭剛軍等[2]的方法并加以修改。分別配制0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL葡萄糖標準溶液。取1 mL葡萄糖溶液,加0.2 mL苯酚和2.5 mL硫酸,靜置30 min,于490 nm處測定吸光度,繪制標準曲線。配制0.1 mg/mL辣木粗多糖溶液,依據標準曲線計算辣木葉多糖含量,如公式(3)所示:

(3)

1.3.6 抗氧化活性測定

1.3.6.1 DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除率測定

取0.5 g辣木葉于錐形瓶中,加入體積分數60%乙醇15 mL,超聲30 min,離心過濾,用體積分數60%乙醇定容至25 mL。取1 mL提取液,再加3 mL DPPH溶液,30 min后于517 nm測定吸光度。將7 mmol/L ABTS溶液與40 mmol/L K2S2O8溶液混合定容至50 mL,靜置12～16 h。ABTS陽離子自由基工作液在734 nm處吸光值要求為0.70±0.02。將0.5 mL 1 mg/mL的提取物與4 mL ABTS溶液混合,于734 nm處測定吸光度。

1.3.7 代謝物提取

將20 mg樣品置于1 000 μL提取液(甲醇∶水=3∶1,體積比)中。在35 Hz下均質4 min,在冰水浴中超聲5 min。然后在-40 ℃孵育1 h,離心后將上清液轉移到進樣瓶中上機分析。

1.3.8 代謝物檢測

A相為水相,B相為乙腈。樣品盤溫度4 ℃,進樣體積2 μL。護套氣體流速50 Arb,Aux氣體流速15 Arb,毛細管溫度320 ℃,MS/MS分辨率15 000,噴霧電壓3.8 kV(正)或-3.4 kV(負)。

1.4 數據統計與分析

采用SPSS 19.0軟件進行統計分析;運用Orbitrap Exploris對樣本中的代謝物進行檢測,然后對代謝物進行鑒定。根據P<0.05,變量重要性投影(variable importance in project,VIP)>1,進行差異代謝物篩選,將差異代謝物通過京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)進行注釋解析,分析差異代謝物通路。

2 結果與分析

2.1 辣木葉發酵前后營養及功能成分含量的變化

由圖1-a可知,辣木葉經植物乳桿菌發酵10 d后蛋白質含量顯著增加(P<0.05)。蛋白質含量從發酵前的44.92 g/100 g增加到了52.16 g/100 g。與發酵前相比,蛋白質含量提高了16.12%。此結果與郭剛軍等[2]研究結果一致,他們采用酵母發酵自制辣木葉茶,發現發酵過程中蛋白質隨發酵時間延長而增加。由圖1-b可知,未發酵辣木葉中黃酮含量為10.74 mg/g,發酵10 d后黃酮含量為10.97 mg/g,提高了2.1%,未達到統計學差異。由圖1-c可知,發酵前辣木葉中多酚含量為45.64 mg/g,發酵后提升到53.10 mg/g,比發酵前提高了16.35%。在發酵過程中,辣木葉中多酚含量逐漸升高,最后趨于平穩。這與張云娟等[12]對辣木葉經毛霉固態發酵后多酚含量升高的結果一致。由圖1-d可知,發酵到第10天,辣木葉多糖含量從23.56%提高到33.45%,比發酵前顯著提高(P<0.05)。植物乳桿菌發酵過程中產生的纖維素酶,將辣木纖維素分解為多糖,進而增高了辣木葉多糖含量。

a-蛋白質;b-黃酮;c-多酚;d-多糖

2.2 辣木葉發酵前后抗氧化能力變化

由圖2-a可知,發酵10 d后辣木葉的ABTS陽離子自由基清除率比發酵前略有升高,ABTS陽離子自由基清除率從70.60%上升到71.10%,但差異不顯著。由圖2-b可知,發酵10 d后,辣木葉DPPH自由基清除率雖然略有下降,從43.90%降低至38.50%,同樣差異不顯著。

a-ABTS陽離子自由基清除率;b-DPPH自由基清除率

2.3 代謝物多維統計分析

2.3.1 辣木葉發酵前后代謝物主成分分析(principal component analysis,PCA)

PCA可以反映辣木葉發酵前后代謝物的變化程度,采用UHPLC-OE-MS對發酵辣木葉的代謝物進行檢測分析。在正、負離子模式下PC1和PC2累計貢獻率分別是64.7%和67.5%,從PCA得分圖(圖3-a、圖3-b)可知,樣本全部處于95%置信區間內,表明實驗重現性好,樣本點分布越遠,表明整體代謝水平差異越大。在研究中,未發酵與發酵的辣木葉中代謝物可以明顯區分開,表明未發酵和發酵后的辣木葉代謝物具有顯著差異。

a-正離子模式PCA得分圖;b-負離子模式PCA得分圖;c-正離子模式OPLS-DA得分圖;d-負離子模式OPLS-DA得分圖;e-正離子模式代謝產物置換圖;f-負離子模式代謝產物置換圖

2.3.2 辣木葉發酵前后代謝物的正交偏最小二乘-判別分析(orthogonal partial least square discriminant analysis,OPLS-DA)

對模型質量進行檢驗(圖3-c、圖3-d);將驗證得到的R2Y和Q2對模型有效性進行評判;本研究中,樣本間橫向距離遠,樣本組間差異大,組內重復性好。

為避免模型出現過度擬合現象,通過置換檢驗對模型有效性做進一步檢驗。本研究置換檢驗結果如圖3-e、圖3-f所示。本研究正負離子模式下置換檢驗模型分別為R2Y=0.98、Q2=-0.28;R2Y=0.99、Q2=-0.29,表明原模型不存在過擬合現象。

2.4 辣木葉發酵前后差異代謝物篩選

根據t檢驗的P<0.05,同時結合OPLS-DA模型獲得的VIP>1,進行差異代謝物的篩選,獲得物質的火山圖(圖4),火山圖可以直觀展示組間代謝物差異的整體分布情況。

圖4 辣木葉未發酵組與發酵組的代謝物火山圖

2.5 差異代謝物聚類分析

將發酵前后辣木葉中顯著差異的代謝物進行歸一化處理,選取相對含量較高的前40個代謝物繪制聚類熱圖。由圖5可知,在辣木葉發酵前后共檢測到

565種代謝物,主要集中在氨基酸及黃酮類。具有顯著差異的物質有96種,其中52種代謝物顯著增加,44種顯著降低。顯著降低的物質包括L-賴氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酸、L-亮氨酸、煙酰胺等。結果表明,發酵組中的腺嘌呤、綠原酸、對乙酰氨基酚、次黃嘌呤、紫云英苷、金絲桃苷含量均高于未發酵組。綠原酸為多酚類化合物,具有抗菌消炎、清熱解毒的作用[13],還具有抗肝損傷、增強機體免疫功能[14-15]。金絲桃苷具有抗炎[16]、抗氧化[17]、抗癌、抗纖維化[18]等作用,對心腦缺血、肝纖維化和心力衰竭[19]等疾病有治療效果。紫云英苷是黃芪、辣木葉等多種天然植物黃酮類化合物之一。研究表明,紫云英苷具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等功效[20]。從總體來看,發酵10 d后的辣木葉中黃酮類物質和苯丙素類化合物相對含量顯著提高,黃酮類化合物屬植物次生代謝產物,在植物體內大部分與糖結合成苷類或碳糖基的形式存在,部分以游離形式存在。此外,在鑒定出的96種差異性代謝物中,發酵辣木葉中煙酰胺、L-色氨酸相對含量低于未發酵辣木葉。煙酰胺參與蛋白質的新陳代謝,可改善人類營養。色氨酸在體內能轉變為5-羥色胺、煙酸,人體缺乏色氨酸會引起一般低蛋白癥,心肌纖維化等病癥。

2.6 差異代謝物的代謝通路分析

通過KEGG數據庫對差異代謝物的代謝通路進行分析。結果表明,辣木葉發酵后的差異代謝物共參與69條代謝通路,分別為氨基酸代謝、脂質代謝、跨膜運輸、其他氨基酸代謝等。以影響值>0.2為篩選依據,得到5條關鍵代謝通路(圖6),分別為苯丙氨酸代謝、黃酮和黃酮醇的生物合成、異喹啉生物堿的生物合成、丙氨酸精氨酸脯氨酸代謝、天冬氨酸谷氨酸代謝。這5條代謝途徑與氨基酸類、黃酮類物質的代謝和生物堿類等物質的生物合成有關,其中苯丙氨酸代謝的氣泡顏色最深、氣泡相對較大。苯丙氨酸屬芳香族氨基酸,在體內經苯丙氨酸羥化酶催化后氧化成酪氨酸,并與酪氨酸一同合成重要的神經遞質和激素,參與機體糖代謝和脂肪代謝。由此可見,植物乳桿菌發酵對辣木葉中氨基酸類物質的影響最顯著。

圖6 辣木葉未發酵組對發酵組的關鍵通路分析圖

3 結論

本研究以辣木葉為研究材料,探討了植物乳桿菌發酵前后辣木葉的營養成分及代謝物的變化。結果表明,發酵提高了辣木葉中的蛋白質、黃酮、多酚、多糖含量,但辣木葉的抗氧化活性沒有顯著變化。基于UHPLC-OE-MS非靶標代謝組學技術,從未發酵和發酵的2組辣木葉中共鑒定出96種差異代謝物。通過對代謝通路進行分析,得到5條關鍵代謝通路,這些代謝途徑與氨基酸類物質的代謝以及黃酮類、生物堿類物質的生物合成有關,表明植物乳桿菌發酵對辣木葉營養物質的形成、生物活性的提高具有積極的促進作用。本研究可為乳酸菌發酵辣木葉的代謝物鑒定提供理論依據,也為開發相關辣木葉功能食品提供理論參考。