山羊乳及綿羊乳外泌體miRNAs表達譜的分析與差異比較

魯曦,任珂

(陜西科技大學 食品科學與工程學院,陜西 西安,710021)

山羊(Caprahircas)和綿羊(Ovisaries)為偶蹄目牛科羊亞科的不同屬生物,山羊有60條染色體,而綿羊只有54條[1-2]。除了分類學上不同之外,二者在生活習性、繁殖能力等方面也存在差異。例如山羊食性雜,除牧草外還喜食灌木嫩枝、藤蔓等,而綿羊喜食非禾本科草、闊葉草[3]。山羊繁殖能力強,每胎可產羔2～3只,哺乳期7～9個月,年產乳量450～600 kg;而綿羊多為單胎,哺乳期為3～5個月,年產乳量僅為30～350 kg[4-5]。

以上因素導致綿羊養殖范圍小、難度高,產乳量僅占羊乳總產量38%。但由于綿羊乳鐵蛋白含量是牛乳的3倍,其蛋白質、酪蛋白、共軛亞油酸和維生素C含量均顯著高于山羊乳[6-8]。與牛乳和山羊乳相比,綿羊乳在我國乳品加工領域尚處于初級階段,且綿羊乳功能成分研究較為缺乏。因此本研究通過測定山羊乳與綿羊乳外泌體miRNAs表達譜,并對其進行對比分析,揭示2種羊乳的潛在功能差異。

外泌體是細胞自然產生的胞外囊泡,幾乎存在于所有生物液體中。作為一種“納米載體”,粒徑在30～150 nm[9],通過攜帶脂質、蛋白質、mRNA、非編碼RNA和DNA,在各種生物學過程中以及物種間傳遞遺傳信息[10]。乳外泌體在自然界中含量豐富,并表現出許多有利于治療作用的納米載體特性[11]。母乳與牛乳外泌體中的miR-146a等分子,具有抑制Toll樣受體(Toll like receptors,TLR)依賴的免疫炎癥反應激活[12-13];豬乳源外泌體miRNAs可以提高葡聚糖硫酸鈉誘導腸炎模型腸道緊密連接蛋白ZO-1的表達[14]。藥物負載效果研究中也發現山羊乳外泌體的藥物裝載能力顯著高于牛乳和水牛乳[15]。此外,還有研究發現山羊乳外泌體能夠顯著降低了登革熱病毒的復制和成熟病毒粒子的分泌[16]。以上數據提示羊乳外泌體與其天然負載大分子具有重要的生物學功能。然而,目前關于山羊和綿羊乳外泌體miRNAs表達譜研究十分有限,這在一定程度上限制了研究人員對羊乳功能的進一步認識,也影響了羊乳外泌體的深入研究與應用。

本研究利用超高速離心法分離山羊與綿羊乳外泌體,接著構建了山羊乳及綿羊乳外泌體sRNA文庫,利用Illumina平臺對其中的miRNAs分子進行測序和生物信息學分析,并分析其功能及差異性。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和制備

本研究采用前中泌乳期的關中奶山羊和東弗里生綿羊乳液樣本。分別將30份山羊乳樣品和綿羊乳樣品隨機分為3組,并充分混合。樣品采集后立即冷凍,并置于干冰中運輸至實驗室,保存于超低溫冰箱(-80 ℃)直至后續研究。

1.2 儀器與設備

OptiamTML-90k Ultracentrifuge超速離心儀,Beckman Coulter公司;NanoPhotometer?分光光度計,IMPLEN公司;Qubit?2.0熒光定量儀,Life Technologies公司;2100型生物分析儀,Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 羊乳外泌體提取

取出樣本25 ℃水浴解凍后,在4 ℃、2 000×g離心10 min,將上清液繼續在4 ℃、10 000×g離心30 min,隨后將樣本上清轉移至超高速離心管中,在4 ℃、110 000×g離心75 min棄上清液。用 1 mL PBS 重懸沉淀并稀釋,用0.22 μm膜過濾后,繼續將樣本轉移至超高速離心管,在4 ℃、110 000×g繼續離心75 min收集沉淀,用PBS重懸,并利用透射電鏡和納米顆粒跟蹤分析技術(nanoparticle tracking analysis,NTA)對外泌體進行鑒定,其余外泌體置于-80 ℃保存。

1.3.2 總RNA提取

取外泌體樣本用TRIzol法提取后在1%(質量分數)瓊脂糖凝膠上監測RNA降解和污染,并利用NanoPhotometer?分光光度計和Qubit?2.0 熒光定量儀分別檢測RNA純度和濃度。最后使用Agilent Bioanalyzer 2100系統評估RNA完整性。

1.3.3 sRNA文庫構建及測序

每個樣品的總RNA量為3 μg。使用NEBNext?Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina?(NEB, USA)生成測序文庫,并將索引代碼添加到每個樣品的屬性序列中。具體是將NEB 3′ SR Adaptor直接特異連接到miRNA、siRNA和piRNA的3′端,SR RT引物雜交到多余的3′ SR 接頭,將單鏈DNA接頭轉化為雙鏈DNA分子。5′ SR Adaptor連接到miRNA、siRNA和piRNA的5′端。然后利用M-MuLV逆轉錄酶合成首鏈cDNA。隨后進行PCR擴增。PCR產物在8%(體積分數)聚丙烯酰胺凝膠(100V, 80 min)上純化。回收140～160 bp(小非編碼RNA長度加上3′和5′接頭)的DNA片段,溶解于8 μL洗脫緩沖液中,在Agilent Bioanalyzer 2100系統上對文庫質量進行評估。之后在cBot聚類生成系統上對樣本進行聚類。聚類生成后,文庫制備在Illumina HiSeq 2500平臺上測序,生成50 bp的單端reads。

1.3.4 測序數據質量控制

使用Fastq軟件篩選原始數據,去除山羊乳和綿羊乳外泌體miRNA樣品溶液中低質量序列、接頭污染序列和PolyA/T/G/C序列,獲得純凈序列。同時計算原始數據的Q20、Q30和GC含量,然后從純凈序列中選擇一定長度范圍進行所有下游分析。

1.3.5 sRNAs定位及序列特征分析

利用Bowtie對照參考基因組數據,分析它們在基因組上的表達和分布。將sRNA與miRBase及Rfam數據庫比對,對sRNAs進行鑒定,最終鑒定出的已知miRNAs用于后續分析。去除其中的rRNAs、tRNAs、snRNAs和snoRNAs等非miRNAs序列,同時對比對成功的非miRNAs序列進行數量統計。

1.3.6 已知miRNAs鑒定和新miRNAs預測

以基因組序列為參考,篩選出已知的miRNAs。整合 miREvo和mirdeep2軟件,通過探索二級結構、Dicer酶切位點和未注釋的sRNAs的最小自由能來預測新的miRNAs。同時對不同長度的已知miRNAs的首位堿基分布及各位點堿基分布情況進行統計。

1.3.7 靶基因預測與生物信息學分析

使用miRanda和RNAhybrid軟件分別對山羊乳及綿羊乳外泌體中檢測到的所有miRNAs進行靶基因預測并取交集,對預測到的靶基因進行GO富集分析和KEGG通路分析。

2 結果與分析

2.1 山羊乳和綿羊乳外泌體鑒定

如圖1所示,在透射電鏡下山羊乳和綿羊乳外泌體呈圓形、大小均勻、有典型的“茶托”結構。

a-山羊乳外泌體;b-綿羊乳外泌體

粒徑分析結果如圖2所示,山羊乳和綿羊乳外泌體粒徑大多分布于50～150 nm,濃度分別為4.37×109和9.42×1010個/mL。以上結果與以往山羊乳外泌體形態報道[11, 17]基本相符。

a-山羊乳外泌體;b-綿羊乳外泌體

2.2 測序數據和質控結果

如表1所示,山羊乳和綿羊乳外泌體測序數據通過質控,分別得到純凈序列8 866 439條(98.37%)和8 210 089條(97.75%)。接下來,對山羊乳和綿羊乳外泌體長度區間為18～35 nt的sRNAs純凈序列進行后續分析。

表1 山羊乳及綿羊乳外泌體中測序數據統計結果

2.3 羊乳sRNAs序列比對及miRNAs首位堿基偏好性

將長度篩選后的sRNAs定位到參考序列上(山羊:Capra hircus_Ensemble_97和NCBI_GCA_001704415.1_ARS1;綿羊:Ovis aries_Ensemble_97),分析了sRNAs和miRNAs在參考序列上的分布情況,結果如表2。通過比較發現,綿羊乳外泌體與基因組比對率為87.11%,而山羊乳外泌體的比對率僅為27.09%。

表2 山羊乳及綿羊乳外泌體中sRNA序列比對分析結果

堿基偏好性有助于了解miRNAs的加工作用機理與測序準確性。由圖3可知,不論山羊乳還是綿羊乳,不同長度的已知miRNAs首位堿基均對U具有顯著偏好性,其中綿羊乳外泌體miRNAs在25 nt對堿基A有顯著偏好。

a-山羊乳外泌體;b-綿羊乳外泌體

2.4 已知miRNAs及預測的新miRNAs比對和表達情況

在山羊乳和綿羊乳外泌體miRNAs中,分別鑒定出161和80種成熟miRNAs,其中miR-148a、miR-26a和let-7b均在山羊乳和綿羊乳外泌體中表達量較高,miR-151只在山羊乳外泌體中檢出(表3)。

表3 部分羊乳外泌體miRNAs表達情況

此外,對新miRNAs進行預測。在山羊乳和綿羊乳中分別預測到了5和7種新miRNAs,其中表達量最高的分別是Novel-62和Novel-82,其成熟體序列分別是:Novel-62:UCAGGACCUGUUGUUUCU和Novel-82:UAGAAAGUUUCUUUGGGGUUUU。這些新miRNAs在一定程度上豐富了山羊和綿羊乳miRNA的序列信息。

2.5 靶基因預測及GO功能分析

對山羊乳及綿羊乳外泌體中所有miRNAs靶基因進行GO富集,發現山羊乳及綿羊乳外泌體miRNAs在細胞組成、生物學過程和分子功能層面均具有顯著差異。例如:山羊乳外泌體miRNAs中有49.86%的靶基因參與組成細胞骨架(圖4-a);而綿羊乳中有43.35% 參與各類細胞器的組成,如內質網系統、高爾基體等(圖4-b)。

a-山羊乳外泌體;b-綿羊乳外泌體

在生物學過程層面,山羊乳的種類豐富,可參與定位、運輸、蛋白質修飾過程等(圖5-a);綿羊乳外泌體miRNAs靶基因大多集中在代謝過程,占比82.77%(圖5-b)。分子功能層面上,山羊乳外泌體miRNAs靶基因有13 706個,綿羊乳外泌體miRNA靶基因有571個。但可以看出,山羊乳及綿羊乳外泌體miRNAs靶基因蛋白質結合、催化活性和受體結合3種類型中均有富集(圖6)。通過分析還發現:綿羊乳外泌體miRNAs靶基因還具有腸菌素結合的功能。研究發現腸菌素作為一種由腸桿菌分泌的細菌素,具有調節菌群數量的作用,還可通過與ATP合成酶互作來促進微生物對鐵的吸收及宿主發育[18]。

a-山羊乳外泌體;b-綿羊乳外泌體

a-山羊乳外泌體;b-綿羊乳外泌體

2.6 靶基因通路富集分析

對山羊乳和綿羊乳外泌體miRNAs中的靶基因進行KEGG通路富集分析,圖7展示了富集顯著的20條通路。

a-山羊乳外泌體;b-綿羊乳外泌體

山羊乳外泌體中miRNAs中共10 512個靶基因,被富集到274條通路,其中花生四烯酸代謝、醚脂質代謝、自然殺傷細胞介導的細胞毒性、α-亞麻酸代謝、Ras信號通路、甘油磷脂新陳代謝、軸突引導和移植物抗宿主病這8條通路獲得顯著富集(P<0.05),最為顯著的是花生四烯酸代謝通路。

花生四烯酸是20碳鏈多不飽和脂肪酸,作為生物細胞膜的組成部分,包括環氧化酶(cyclooxygenase,COX)、脂氧合酶和細胞色素P450等3種途徑。其中COX通路是動脈粥樣硬化性和缺血性心臟病的主要治療靶點之一,可能影響該疾病的病理生理特征,包括血小板聚集、血管壁張力和動脈粥樣硬化病變中的炎癥過程[19],這些將為開發心血管疾病和癌癥的新治療藥物提供參考。

綿羊乳外泌體中miRNAs中共有1 067個靶基因被注釋到256 條通路中,其中11條獲得顯著富集(P<0.05),分別是氨基酸的生物合成,碳代謝,果糖和甘露糖代謝,蛋白質消化吸收,癌癥中的轉錄失調,葉酸生物合成,苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸的生物合成,吞噬體,核苷酸切除修復和NF-κB信號通路,最顯著富集的通路為氨基酸的生物合成。氨基酸的合成是生物合成代謝的關鍵,與兒童生長發育、免疫系統完善具有重要作用,這提示綿羊乳外泌體miRNAs在以上方面或許具有獨特的功能。

3 討論

本研究利用超高速離心法對羊乳樣本進行外泌體提取和鑒定,隨后構建了山羊乳及綿羊乳外泌體的sRNA文庫,并利用高通量測序技術研究了山羊乳和綿羊乳外泌體miRNAs的類型和表達量,最后對2種羊乳外泌體miRNAs的特點、靶基因參與的生物學過程進行分析。

在對miRNAs序列的鑒定分析時發現:山羊乳外泌體中鑒定出161種已知miRNAs和5種新型miRNAs序列;而在綿羊乳外泌體中鑒定出80種已知miRNAs和7種新型miRNAs序列。在已知miRNAs序列中,miR-148a、miR-26a和let-7b均在山羊乳和綿羊乳外泌體中表達量較高,其中miR-148a在2種羊乳樣本中表達量最高,分別占77.97%和79.53%,而該miRNA也在人乳中高度表達,它可通過靶向TLR4介導的途徑抑制NF-κB 和p65的激活,且在小鼠子宮內膜炎模型發現miR-148a的上調具有緩解炎癥的作用[20]。miR-151只在山羊乳外泌體中表達,它通過靶向白細胞介素17A(IL-17A) 減弱動脈粥樣硬化內皮細胞凋亡,是一種動脈粥樣硬化治療的潛在途徑[21]。通過文獻進行檢索后發現,這些高表達miRNAs在減輕病原微生物感染、炎癥、抑制癌細胞增殖遷移,甚至可作為緩解某些疾病的靶點或手段,這也提示上述羊乳外泌體miRNAs可能通過以上過程參與到了人體生理功能的調節過程。

此外,生物信息學分析時發現山羊乳和綿羊乳外泌體miRNAs的靶基因在分子功能性上也存在差異,如山羊乳miRNAs靶基因數量較多,集中在結合和催化活性等方面;綿羊乳外泌體miRNAs部分靶基因具有腸菌素結合的功能,且對宿主發育具有一定促進作用,上述結果提示山羊與綿羊乳外泌體miRNAs的差異化表達,使得不同羊乳外泌體可能具有不同功能,而這在今后研究中應當給予關注。

本研究也存在某些不足之處,例如:(1)本研究采用透射電鏡和納米顆粒跟蹤分析技術對外泌體進行鑒定,由于目前對山羊與綿羊乳研究的局限,與特異性抗體的缺乏,難以通過免疫印跡等免疫學方法鑒定外泌體;(2)在miRNAs注釋過程中發現,綿羊乳外泌體sRNAs總數為8 041 316,與參考序列比對之后有87.11%的序列可以被準確注釋;雖然山羊乳外泌體sRNAs序列與綿羊乳相當,但僅有27.09%的序列被準確注釋,本研究先后使用了Capra hircus_Ensemble_97和NCBI_GCA_001704415.1_ARS1兩套基因組序列進行比對但結果依然未能改善。造成這一情況的可能原因包括:樣本問題,即山羊乳樣品雜合度高,在進行擴增時使得其他序列種類增多;二是基因組重復序列的復雜性,即山羊乳外泌體重復序列種類占比22.83%,而綿羊乳僅為3.27%;2個物種的RNA數據庫信息尚不完善,也可能是造成注釋比例偏低的原因。這方面應當在后續的研究中予以重視。雖然存在上述2點不足,但對于2類樣本外泌體miRNAs的序列提取與表達分析仍然具有可比性。

羊乳營養豐富且與母乳成分較為接近,羊乳脂肪顆粒僅為牛奶的1/3,更利于人體吸收。近年來隨著羊乳及其制品逐漸被大眾接受,羊乳中功能成分的研究成為羊乳深加工與開發利用的關鍵。本研究構建了山羊乳和綿羊乳外泌體miRNAs表達譜,為不同類型羊乳外泌體的生理功能與各自優勢提供基礎數據,也為羊乳外泌體的后續研究提供參考。