超聲波均質法制備糖基化蛋白-茶油納米乳液及其穩定性的研究

李姚昌,余靜怡,林秋瑀,張沁蕊,劉剛,張海枝,秦新光

(武漢輕工大學 食品科學與工程學院,湖北 武漢,430023)

油茶是我國廣泛種植的木本作物,種植面積達453.56 hm2,產業總值達1 160億元,其主要榨油產品是茶油[1]。具有降血壓、降血脂、防止心臟血管硬化、預防肝癌和抗癌疾病的功能[2]。茶油因其富含多種生物活性成分亟待得到更廣泛地利用[3],而選擇合適的乳液遞送系統則是提升茶油穩定性和利用度的極佳方法之一。

當前表面活性劑的應用和乳化技術的普及,使得乳狀液在工業以及日常生活中取得了十分關鍵的地位。利用食品膠體顆粒穩定乳液是荷載生物活性物質和防止油脂腐敗變質的有效途徑[4]。小分子表面活性劑、多糖和蛋白質等常被作為乳化劑來提高乳液穩定性[5],由于乳化劑吸附在油水界面上可以形成一層穩定的物理屏障,具有一定的保護作用[6],減少界面張力和增加空間位阻,進而改善乳液穩定性[7]。乳清分離蛋白(whey protein isolate,WPI)由于具有兩親性結構作為表面活性劑已應用于乳液生產中,但易變性和酸熱不穩定性使其應用受限[8],因此需要對WPI進行改性。目前相關研究都證實,經過糖基化改性后的蛋白質的功能特性有了明顯改善,如熱穩定性、酸堿穩定性等。其本質是多羥基糖分子上的羰基和蛋白質分子上的氨基之間經過共價鍵結合而得到糖基化蛋白的過程[9]。這類反應稱作美拉德反應,經美拉德反應改性后的理化性能更好。

納米乳液使用在食品包裝體系中可以提高產品的儲藏性能,豐富產品種類,提高感官特性和加工性能,為產品的創新開發提供一種新途徑。與普通的乳液相比,納米乳液在高液滴體積分數時表現出光學透明性,在低液滴體積分數時表現出良好的黏彈性,并增強了擴散傳輸和貨架穩定性[10]。蛋白質由于具備特定的乳化功能可以用作乳化劑制成納米乳液,納米乳液具有很高的動力學穩定性和低失穩性;其次,納米乳液界面面積相對更高,既有利于消化液作用,也有利于改善功能活性成分的生物利用率[11]。同時,當液滴粒徑相較于入射光波長更小時,其散射光會變弱,可具有一定的光學透過性,這也使得產品在外觀上具有更好的視覺效果。生產正常采用高能和低能方法制備納米乳液,低能方法優于高能方法,此方法需要更少的能量,并且不需要復雜的儀器。而高能方法需要較少量的表面活性劑[12],納米乳液體積小,因此具有很高的動態穩定性[13],這種穩定性可能是有利的,通過消除限制微乳液組成空間的熱力學限制,納米乳液可用更多種類和數量的添加劑進行功能化。因此,納米乳液具有從藥物遞送載體到新材料模板的潛在應用[14]。

超聲波技術廣泛應用于現代食品工業體系,具有明顯的優點:可以提高生產率,縮短加工時間,改善機器操作條件和降低成本,也可以用來制備穩定的納米乳液[15]。超聲波處理是納米材料合成過程中尺寸細化和分散的有效方法,有研究報道,經適當超聲波處理對乳化液乳化性能有不同程度的改善[16]。在蛋白質的結構方面,研究表明超聲波處理可降低辣木種子水溶性蛋白質β-轉角和β-折疊含量,增加α-螺旋和無規則卷曲含量[17]。基于以上,本實驗選擇了WPI為主要原料,以乳糖作為糖分子對其進行糖基化反應,糖基化蛋白與茶油基于超聲波處理技術制備納米乳液,并對其進行優化研究,對比不同條件下液滴顆粒的大小,以平均粒徑作為技術指標,研究糖基化蛋白-茶油乳液體系在不同環境條件下的穩定性,對于提升茶油穩定性和利用價值具有實際意義。本實驗是制作水包油乳液,形成的乳液在發揮茶油功效的同時能保持良好的穩定性,為在食品工業生產中的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

WPI(95%,純度),Hilmar Ingredients公司;D-乳糖,四川伯利恒藥業有限公司;山茶籽油,榨取自湖北當地油茶作物;實驗用水為超純水;甲醇、異丁醇、異辛烷、NaOH(分析純) 等,國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

ME104E/20電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;JY2001電子天平,上海浦春計量儀器有限公司;85-2型恒溫磁力攪拌器,金壇市城東新瑞儀器廠;FE20實驗室pH計,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;高速剪切機、超聲波破碎攪拌機,寧波新芝生物科技股份有限公司;ZEN 3600馬爾文粒徑分析儀,上海思百吉儀器有限公司武漢分公司;HH-2數顯恒溫水浴鍋,常州榮華儀器有限公司;DHP-9272電熱恒溫培養箱,上海一恒科學儀器有限公司;MIX-30S迷你混合儀,杭州米歐儀器有限公司;Min1512臺式高速離心機、高速臺式冷凍離心機,長沙英秦有限公司;UV-1000紫外可見分光光度計,翱藝儀器(上海)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 糖基化反應產物的制備

將WPI與乳糖(D-lactose, Lac)按質量比1∶1溶解于超純水,恒溫攪拌攪拌12 h,-20 ℃冰箱冷凍,隨后取出放入凍干機冷凍干燥3 d,將凍干得到的粉末置于含有飽和KBr溶液的容器中,并放入70 ℃培養箱中反應24 h,取出觀察其顏色變化,若無明顯變化則再次重復上述步驟,直至溶液顏色出現明顯變黃,通過鄰苯二甲醛法測定糖基化接枝度并保持批次間的一致性,得到糖基化反應產物(whey protein isolate glycosylation with lactose,WPIL)[18]。

1.3.2 茶油納米乳液的制備

將一定質量的WPI和WPIL分別溶解在一定量的超純水中,根據前期的研究進展,制成10 mg/mL的蛋白質溶液。恒溫攪拌至少 2 h(25 ℃,500 r/min)后,加入0.2 mg/mL的疊氮化鈉(防止微生物生長產生污染)。將WPI溶液放入4 ℃冰箱冷藏11 h,使蛋白質充分溶脹。將蛋白溶液與茶油按一定比例混合后均質(12 000 r/min,2 min)及超聲波處理,得到超聲處理乳清分離蛋白(ultrasonic whey protein isolate, UWPI)納米乳液和超聲處理糖基化乳清分離蛋白(ultrasonic whey protein isolate glycosylated, UWPIL)和納米乳液。觀察乳液外觀變化,并取樣經粒徑分析儀測定不同pH下乳液平均粒徑變化情況。

1.3.3 茶油納米乳液粒徑及多分散系數(polydispersity index,PDI)測定

采用動態光散射儀Malvern Nano-ZEN 3600測量1.3.2節制備的乳液粒徑大小、PDI分布情況和外觀變化,測量中使用的蛋白質和水的折射率分別為1.450和1.330。分別測量水相pH梯度(3.0、7.0、9.0),油相質量分數(5%～25%)、超聲波處理時間(5～15 min)、功率(300～500 W)幾種不同因素對粒徑的影響。

1.3.4 酸、熱穩定性實驗

根據1.3.3節所得條件(水相pH 7.0、油相質量濃度10 g/L、超聲波處理時間10 min,功率 450 W)制備糖基化蛋白-茶油納米乳液留存備用,同樣條件下制備對照組WPI茶油納米乳液。調節乳液pH為2.0～9.0,靜置30 min,觀察乳液外觀變化并取樣通過粒徑分析儀測定不同pH下乳液平均粒徑變化情況;將乳液放入不同溫度(40～100 ℃)水浴中 10 min,取出后冷卻至室溫并測定平均粒徑和電位。

1.3.5 儲藏穩定性實驗

按1.3.3節所得的優化條件制備2種乳液,比較研究WPI糖基化產物-茶油納米乳液的儲藏穩定性。將制得的2種茶油納米乳液置于50 ℃恒溫培養箱中放置14 d,每48 h只從其中1個等分取樣,測量其粒徑、氫過氧化物含量和硫代巴比妥酸反應物(thiobarbituric acid reactive substance,TBARS)含量,并觀察表觀變化。

1.3.6 測定乳液中氫過氧化物含量

將制得的2種納米乳液和等量的茶油分別置于試管中,50 ℃下加速氧化14 d,每48 h測定1次氫過氧化物濃度。V(樣品)∶V(異辛烷)∶V(異丙醇)=1∶6∶4,渦旋30 s,均勻混合, 2 000 r/min離心5 min。取上層有機相溶液0.2 mL,以2∶1的比例混合的甲醇和異丁醇溶液2.8 mL[19],再加入15 μL 3.94 mol/L硫氰酸銨溶液和15 μL亞鐵離子溶液(0.132 mol/L BaCl2溶液和0.144 mol/L FeSO4溶液按體積比1∶1混合,渦旋30 s,離心取上清液),渦旋混合15 s,避光靜置使之反應20 min后,在510 nm測吸光度。空白組樣品為等量異辛烷。以過氧化氫異丙苯為標準物作為標準曲線。過氧化值計算如公式(1)所示:

(1)

式中:A,所測樣品吸光值;a,標準曲線斜率;b,截距。

1.3.7 測定乳液中TBARS含量

將制得的2種納米乳液和等量的茶油各等分成7等份置于具塞試管中于50 ℃恒溫培養箱中氧化14 d,每間隔1 d測定TBARS濃度[19]。分別取樣品、75 mg/mL的三氯乙酸和濃度為2.88 mg/mL的硫代巴比妥酸各2 mL混合均勻后,于95 ℃水浴15 min后迅速冷卻至室溫,經離心后靜置10 min于532 nm條件下測定吸光值,以無水乙醇作空白,以丙二醛乙縮醛為標準物作標準曲線。

1.4 數據統計與分析

2 結果與分析

2.1 超聲波條件下WPIL-茶油納米乳液的表征

2.1.1 pH對超聲波條件下WPIL-茶油納米乳液穩定性的影響

固定蛋白溶液10 mg/mL,油相質量分數15%,超聲波處理功率450 W,時間10 min,研究蛋白溶液的pH對茶油納米乳液穩定性的影響。由于蛋白溶液在pH值4.0～5.0時,靠近等電點4.8～5.2[20],其中的氨基酸分子與氫離子結合使蛋白質結構更緊密,抑制了其與茶油的結合,導致制得的乳液不穩定,故不可選用。選用了酸性水相pH 3.0,中性水相pH 7.0,堿性水相pH 9.0為代表。由表1可知,WPI及WPIL-茶油納米乳液的粒徑及PDI在水相pH改變時均有明顯變化,2種乳液在pH 7.0時均有最小粒徑,且PDI的數值也較小,并且改性后乳液的粒徑和PDI更小,這說明了對WPI進行糖基化處理有助于制備更穩定的乳液,這也與PIRESTANI等[21]關于糖基化共軛物穩定的乳液顯示出更小的平均液滴尺寸和更低的乳析指數,對于穩定乳液更有效的結論相一致。在后續的實驗中,選取pH 7.0為制備乳化劑的優化pH值。

表1 不同pH下蛋白乳液平均粒徑及PDI分析

2.1.2 超聲波條件下油相質量分數對WPIL-茶油納米乳液穩定性的影響

由2.1.1節的結論,固定水相pH 7.0,蛋白溶液質量濃度為10 mg/mL,超聲波功率450 W,超聲波時間10 min,研究油相質量分數對茶油納米乳液穩定性的影響。由圖1-a、圖1-b得知,改變油相質量分數時,乳液的粒徑和PDI均有顯著改變。當油相質量分數>10%且逐漸增加時2種乳液的粒徑和PDI均逐漸變大,且在實驗中發現,當油相分數較大時,超聲波處理后的乳液表層會有油滴。這說明茶油沒有全部被包裹住。當油相質量分數為5%時其粒徑和PDI比質量分數為10%時大。由此可知當油相質量分數為10%時,乳液的穩定性最好。后續實驗中,選擇油相質量分數為10%制備乳液。

a-UWPI;b-UWPIL

2.1.3 超聲波功率對WPIL-茶油納米乳液穩定性的影響

超聲波處理是目前制備納米乳液的有效處理手段,制備的納米乳液具有粒徑小、穩定性高、乳化劑使用量少、高效環保等特點[22-23]。由2.1.1節和2.1.2節結論,固定水相pH 7.0,油相質量分數10%,超聲波時間10 min,研究超聲波功率對納米乳液穩定性的影響。觀察圖2可知,當超聲波功率<400 W時,2種乳液的粒徑和PDI均較大,這可能是超聲波功率不足,導致油滴表面未能被乳化劑充分覆蓋,造成粒徑偏大,均一性差。UWPI在400和450 W時,乳液粒徑無明顯差異,但PDI發生變化,且450 W時2種乳液的PDI均小于0.3,表明乳液的均一性和分散性較好。而當超聲波功率>450 W時,2種乳液的粒徑和PDI均有所增加,可能是因為超聲波功率過大,乳液中的蛋白部分發生聚集現象,導致油滴析出,粒徑變大,分散性變差,較高超聲波功率對乳液穩定性產生負面影響[24-25]。為制備穩定的納米乳液,后續實驗選擇超聲功率450 W。

a-UWPIL;b-UWPI

2.1.4 超聲波時間對WPIL-茶油納米乳液穩定性的影響

根據2.1.1、2.1.2節和2.1.3節的結論,固定水相pH 7.0,油相質量分數10%,超聲波功率450 W,研究超聲波時間對納米乳液穩定性的影響。由圖3可知,在功率450 W時超聲波10 min制得的乳液各方面均最優。而超聲波時間5 min,測量的粒徑偏大,這可能是超聲波時間較短,沒有完全產生作用。當超聲波時間>10 min時,2種乳液的粒徑緩慢變大,乳液的穩定性變差,而PDI則逐漸接近0.3,乳液的不均勻程度變大。原因可能是在選定超聲波功率下處理時間過長,較長時間的超聲波物理作用改變了乳液的粒徑和PDI,長時間的超聲波空化導致超聲波處理引起的空化能量閾值降低了[26],有助于產生更劇烈的空化效應,從而更容易形成粒徑小的液滴[27]。后續實驗中選擇超聲波時間10 min。

2.2 酸、熱條件下超聲波處理茶油納米乳液穩定性的影響

2.2.1 溫度對超聲波處理后WPIL-茶油納米乳液穩定性的影響

由圖4-a可知,UWPIL-茶油納米乳液所放置的溫度從40 ℃到100 ℃增加時,乳液的粒徑和PDI變化較小。溫度為40、50、60、70 ℃時乳液的粒徑和PDI無顯著變化,說明乳液在此溫度范圍內較穩定。當溫度在80～100 ℃時,乳液粒徑和PDI有變化的趨勢,兩者數值都在緩慢增加。這可能是由于溫度的升高造成乳化劑分子結構中的蛋白質部分發生變性,也就是乳化劑發生變性,乳化茶油的能力下降。由于加熱處理后蛋白質發生不同程度的變性,使乳化能力逐漸降低,其粒徑和PDI逐漸增大,但增長的幅度小,或許是納米乳液之間存在強靜電排斥作用降低了界面蛋白質分子間的相互作用產生的影響[28]。由此可知,經糖基化改性后制備的超聲波茶油納米乳液的熱穩定性是比較好的。而圖4-b則表現出明顯的上升態勢,超聲波處理蛋白UWPI-茶油納米乳液的粒徑和PDI隨溫度的升高而增大,乳液分散性變差,說明UWPI-茶油納米乳液的熱穩定性較差,這可能是WPI本身熱穩定性較差,當溫度變化時其變性程度也增大。對比可知UWPIL-茶油納米乳液熱穩定性比未改性的更好。由此可知,在較高溫度的工業生產中,選用糖基化蛋白結合超聲波處理可以制作更穩定的茶油納米乳液,可以更好地將茶油的功效利用到需要較高溫度生產的工藝中。

a-UWPIL;b-UWPI

2.2.2 pH對超聲波處理后WPIL-茶油納米乳液穩定性的影響

由圖5-a可知,超聲波處理后乳液的pH在7.0～9.0時,2種乳液的粒徑均沒有出現明顯變化,說明乳液在此pH區間內較穩定。但當乳液的pH降到5.0時,取樣時發現乳液的分散性變差,且粒徑發生巨大改變。再次降低乳液pH至4.0,UWPI-茶油納米乳液的粒徑有些許下降但仍然很大,此時乳液極不穩定,出現這種現象可能是WPI的等電點在pH 4.8～5.2[14],蛋白質易沉淀聚集,導致油滴析出,乳液粒徑增大[18]。改性后乳液的粒徑則出現明顯減小,這可能是因為用乳糖糖基化改性后蛋白的等電點在pH 5.0附近,乳液發生聚結而使粒徑變大。當乳液的pH為3.0時,乳液粒徑又下降且趨于較穩定的數值,pH降至2.0時乳液的粒徑輕微減小,此時乳液處于較穩定的狀態。再看圖5-b中兩種乳液在不同pH下的PDI變化。當pH從9.0逐漸降低到7.0時,UWPIL-茶油納米乳液的PDI逐漸減小并且整體低于UWPI,而pH從7.0逐漸降低到5.0時,UWPIL-茶油納米乳液的PDI逐漸增大但整體依然低于UWPI,說明乳液逐漸趨向不穩定的狀態。但當pH逐漸由5.0降低到2.0時,UWPIL-茶油納米乳液的PDI又逐漸減小至0.3以下,且處于較均勻和分散性較好的狀態。而在整個過程中,UWPI-茶油乳液的PDI除pH 3.0時,在其他pH下乳液PDI均比同樣環境條件下改性后的蛋白乳液要大,此時的乳液較不均勻,這與之前的研究結論是一致的[29]。以上分析可以說明在乳液pH從9.0到2.0逐漸降低時,經糖基化改性后制備的乳液基本上更穩定,使茶油在酸堿條件下的穩定性有顯著提升,更好發揮茶油功效作用。

a-平均粒徑;b-PDI

2.3 超聲波處理對WPIL-茶油納米乳液的儲藏穩定性

由圖6-a可知,制得的2種乳液的粒徑均呈現增長趨勢,但總體增長幅度不大,說明2種乳液的儲藏穩定性均較好,但仔細觀察發現UWPIL-茶油乳液粒徑增幅更小,在相同儲藏時間下粒徑更低,說明糖基化改性產物更有助于提升茶油納米乳液的儲藏穩定性。由圖6-b可知,2種乳液的PDI都出現緩慢增長,這可能是溶液中的茶油發生氧化反應,生成的過氧化物容易分布在乳液的油-水界面上,造成乳液粒徑和PDI增大,穩定性降低。UWPI-茶油納米乳液在儲藏6 d后其PDI數值就超過0.3,其后8 d的PDI逐漸增加,第8天時粒徑增加到230 nm,這表明此時的乳液已經不再均勻,分散性變差。而UWPIL -茶油納米乳液的PDI則在第8天后數值才大于0.3,其后幾天數值緩慢增長,且均小于或等于UWPI-茶油納米乳液的PDI數值,直到12 d時粒徑才增加至230 nm,較WPI-茶油納米乳液而言,UWPIL-茶油納米乳液能保持良好分散性和儲藏穩定性。由1.3.5節可知,乳液在50 ℃條件下恒溫儲藏[30],結合2.2.1節可以得出結論:UWPIL-茶油納米乳液的儲藏穩定性比UWPI-茶油納米乳液要好。且前者更能承受較高溫度,儲存時間更久。因此,在研究如何長時間、儲存溫度高于室溫時保存茶油,更多保留功能活性物質,可以制作更穩定的UWPIL-茶油納米乳液,延長功效時間。

a-平均粒徑;b-PDI

2.4 超聲波處理對WPIL-茶油納米乳液的氧化穩定性

2.4.1 儲藏時間對超聲波處理后WPIL-茶油納米乳液ROOH形成的影響

根據1.3.6節的方法配制的待測溶液,茶油樣品呈現較深的顏色,乳液樣品顏色則較淺,這可能是由于茶油含有的過氧化物較多,因此溶液顏色較深,而乳液將茶油包裹,減少了茶油氧化的可能性,使過氧化物含量比單純茶油儲藏時低,溶液顏色也就相對較淺。結合圖7-a分析,前6 d過氧化物濃度上升速度較快,其后8 d較為緩慢,總體水平較低,說明在長時間的儲藏過程中茶油被保護的較好。這可能是由于茶油本身含有的低極性多酚物質能有效地抑制脂質過氧化物的產生[31];也可能是制備乳液的過程中經過了超聲波處理,超聲波的物理作用使蛋白均勻包裹于液滴表面,油滴被保護,被氧化程度降低,且尺寸分布窄,乳液因此達到了穩定的納米級[32]。但從圖7中還是可以看出,2種乳液中,UWPIL-茶油納米乳液的過氧化物濃度更低一些,進一步說明它的氧化穩定性更好[30]。結合乳液的50 ℃儲藏環境,在進行提高乳液氧化穩定性的試驗時,表明UWPIL更適合做乳化劑,制備茶油納米乳液不僅不易氧化,熱穩定性好,而且能很好地保存負載物質的功能,使其在長時間儲藏中不易氧化變質,更好地運用到食品工業中。

2.4.2 儲藏時間對超聲波處理后WPIL-茶油納米乳液次級氧化產物形成的影響

根據1.3.7節的方法配制檢測溶液,進一步分析乳液儲藏過程中次級氧化產物TBARS含量的變化情況。如圖7-b所示,前8 d的中次級氧化產物濃度上升速度較快,后6 d較為緩慢,觀測過程中所測得的樣品中TBARS含量大小順序為:UWPI>UWPIL。這個結果表明氧化14 d中UWPIL-茶油納米乳液的次級氧化產物濃度更低,這也與LI等[33]研究結論一致,可能是由于糖基化改性引入了乳糖分子后可以快速吸附在油滴表面并形成更為穩定的蛋白界面層,更好地包裹茶油液滴從而可以有效減少次級氧化產物的生成,使UWPIL-茶油乳液具有更好的氧化穩定性。

3 結論

以WPI-乳糖糖基化改性產物作乳化劑,采用超聲波輔助均質處理制備茶油納米乳液。通過優化試驗發現,當水相pH 7.0,油相質量分數10%,超聲波功率450 W,超聲波時間10 min時可制備穩定的超聲波茶油納米乳液。超聲處理后乳液在pH 7.0～9.0,2種乳液的粒徑均穩定, 并且UWPIL/UWPI-茶油納米乳液的PDI均在 0.3以下,處于較均勻和分散性較好的狀態,UWPIL-茶油乳液在pH 7.0時PDI最小,乳液最穩定,并且在儲藏過程中粒徑始終不超過235 nm,相較于用WPI制備的超聲波茶油納米乳液而言,糖基化蛋白制備的超聲波茶油納米乳液在不同溫度、不同pH下更穩定,且儲藏穩定性和氧化穩定性也得到了改善。對于提升茶油產品綜合開發利用價值和改善茶油的穩定性具有實際參考意義,為拓寬茶油乳液在食品工業中的應用奠定了基礎。