黑果枸杞不同組織花青苷組分及相對含量研究

陳生蓉,史國民,葉廣繼,郭佳磊,何濤*

1(省部共建三江源生態與高原農牧業國家重點實驗室(青海大學),青海 西寧,810016)2(青海大學 農牧學院,青海 西寧,810016)3(青海省農林科學院,青海 西寧,810016)4(中國科學院西北高原生物研究所,青海 西寧,810001)

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)是茄科(Solanaceae)枸杞屬(Lycium)植物,主要分布在新疆、寧夏、西藏、甘肅和青海等地[1]。作為中國西北地區代表性沙漠作物,環境適應能力強,能夠生長在干旱、高鹽堿地區,對生態保護具有重要作用[2-3]。同時,黑果枸杞果中含有豐富的花青苷,具有預防和治療多種癌癥和代謝疾病的作用[4-6],被廣泛應用于醫藥、食品和天然食用色素等領域[7-8]。因此,兼具生態保護和經濟價值的黑果枸杞在中國西北地區被大面積種植。研究黑果枸杞花青苷的合成調控機制對培育優良品種和進一步開發其潛在的利用價值至關重要。

目前,黑果枸杞成熟果中鑒定出的花青苷有37種,其花青苷的苷元包含常見的6類花青素。其中,矮牽牛素類花青苷占黑果枸杞中總花青苷含量的95%以上[9-11],主要成分是矮牽牛素-3-反式香豆酸-蕓香糖苷-5-葡萄糖[petunidin-3-O-rutinoside(trans-p-coumaroyl)-5-O-glucoside, PRG],其含量占比達到總花青苷含量的80%[12-13]。對黑果枸杞不同發育階段果中PRG含量變化研究表明,青果中PRG的含量最低,隨著果的發育,PRG不斷積累含量顯著增加,花青素合成相關基因LrAN2在果中的表達與PRG含量呈正相關性[12]。對果中花青苷合成調控網絡研究發現LrAN2-like與LrAN1b和LrAN11相互作用形成MBW(MYB-bHLH-WD40)蛋白復合體,調節下游靶基因LrDFR和LrANS啟動子調控花青素合成。當果實發育后期花青素積累過高時,MBW復合體會激活LrMYB3和LrETC1抑制子基因實現反饋抑制[14]。花青素合成調控是一個復雜多變的過程,其中還涉及甲基轉移酶(methyl transferase, MT)、類黃酮糖基轉移酶(UDP-flavonoid glucosyl transferase,UFGT)和酰基轉移酶(acyltransferase,BAHD)對合成的花青素進一步修飾,形成更穩定的花青苷[15]。因此,黑果枸杞花青素合成調控機制值得進一步研究和分析。對黑果枸杞花青苷的研究主要集中在果中花青苷的定性定量及花青苷的抗氧化活性[16-18],MBW復合體及結構基因調控花青素合成方面[19-21]。缺乏黑果枸杞生長發育過程中組織花青苷組分及相對含量的變化研究。

本研究以生長于青藏高原地區的野生黑果枸杞為研究對象,采用超高效液相色譜串聯四級桿飛行時間質譜(ultra performance liquid chromatography-electrospray ionization-quadrupole time-of-flight mass spectrometry, UPLC-ESI-QTOF/MS)和超高效液相色譜三重四級桿線性離子阱質譜(ultra performance liquid chromatography- quadrupole-Trap-mass spectrometry, UPLC-Q-Trap-MS)多反應監測(multiple reaction monitoring, MRM)模式,研究了黑果枸杞不同生長時期組織中花青苷的組分和相對含量的變化,以期為黑果枸杞花青苷的合成調控和形成機制研究提供基礎數據。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

黑果枸杞不同生長時期的組織采自青海省海西蒙古族藏族自治州都蘭縣荒漠地區,采集的新鮮組織裝入液氮冷凍運輸。黑果枸杞樣本信息如表1所示,黑果枸杞植株和組織照片如圖1所示。組織樣品冷凍干燥,磨細混勻,儲存于-20 ℃冰箱待用。矮牽牛素葡萄糖苷(Petunidin-3-glu)、矮牽牛素(Petunidin)、矢車菊素(Cyanidin)、矢車菊素葡萄糖苷(Cyanidin-3-glu)、天竺葵素(Pelargonidin)、錦葵色素(Malvidin)、飛燕草素(Delphinidin)、飛燕草素葡萄糖苷(Myrtillin)、芍藥素(Peonidin)標準品,美國ChromaDex公司;質譜級乙腈和甲醇,美國Fisher公司;質譜級甲酸,上海阿拉丁試劑公司;超純水,英國ELGA超純水機自制。

圖2 正交試驗中花青苷含量變化趨勢圖

表1 野生黑果枸杞樣品信息

1.2 儀器與設備

Agilent 6545超高效液相飛行時間高分辨質譜聯用儀、數據處理系統MassHunter工作站、Agilent 1290 Infinity Ⅱ超高效液相色譜儀,美國Agilent公司;AB Sciex QTRAP 5500超高效液相色譜三重四級桿線性離子阱質譜儀、Exion LC AD超高效液相色譜儀,美國AB Sciex公司;ME204E電子分析天平,德國Sartorius公司;KQ-118B超聲振蕩儀,昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 對照品配制

精確稱取適量標準品,用甲醇溶解并定容于5 mL容量瓶中,然后用體積分數55%的甲醇水(含體積分數0.5% HCl溶液)稀釋至不同質量濃度梯度的標準溶液(1 000、800、600、400、300、200、100、50 ng/mL)。

1.3.2 花青苷提取方法優化

參照杭園園等[22]的方法,準確稱取黑果粉末1 g,加入適量不同濃度甲醇溶液,超聲提取,并以PRG的提取率為指標進行正交試驗(表2),并確定最佳提取方法,用該方法處理黑果枸杞組織,進行后續分析。

表2 正交試驗因素水平表

1.3.3 UPLC-ESI-QTOF/MS鑒定黑果枸杞組織花青苷組分

色譜條件:Phenomenex C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,3 μm),柱溫30 ℃,以體積分數0.1%甲酸水溶液(A)和乙腈(B)為流動相,梯度洗脫:0～2 min,5% B;2～25 min,5%～25% B;25～30 min,25%～50% B;30～35 min,50%～75% B;35～40 min,75%～95% B;40～43 min,95%～5% B。流速0.30 mL/min,進樣量2 μL。

質譜條件:離子源為Dual AJS ESI離子源,正離子電離模式;干燥氣(N2)溫度350 ℃,流量8 mL/min;鞘氣溫度250 ℃,流量11 mL/min;霧化氣壓力45 psi;毛細管電壓4 000 V;掃描范圍:50～1 700m/z;碰撞能量:10.00、20.00、40.00 eV;參比離子:121.050 8與922.009 7;掃描模式:自動MS/MS模式。

利用MassHunter定性分析軟件進行數據分析,花青苷定性通過離子碎片、花青素標準品和Metlin數據庫比對及查閱文獻實現。

1.3.4 UPLC-Q-Trap-MS測定黑果枸杞組織花青苷含量

色譜條件:Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(RRHD,1.8 μm)色譜柱,柱溫30 ℃;以體積分數0.1%甲酸水溶液(A)和乙腈(B)為流動相,梯度洗脫:0～2 min,5%～11% B;2～8 min,11%～35% B;8～15 min,35%～95% B;15～18 min,95%～95% B;18～23 min,95%～5% B。流速0.4 mL/min,進樣量1 μL。

質譜條件:離子源為ESI源,正離子電離模式;離子源氣簾氣20 psi;碰撞氣Medium;噴霧電壓5 500 V;溫度450 ℃;離子源氣體Gas1:45 psi;離子源氣體Gas2:55 psi;掃描類型MRM模式。

1.3.5 方法學驗證

采用1.3.1節中已制備的不同濃度梯度的對照品溶液和1.3.4節色譜-質譜條件,進樣分析,記錄9種花青素的峰面積,并以質量濃度為橫坐標,以峰面積為縱坐標,擬合9種花青素的線性方程;隨后按1.3.2節已優化方法制備莖、葉、花和果4個組織混合樣品6份用于驗證儀器精密度和重復性。

2 結果與分析

2.1 花青苷提取方法優化

采用超聲時間、液固比和甲醇濃度3個因素考察花青苷的提取方法。超聲時間大于20 min時提取液中花青苷含量趨于平衡,但隨著甲醇濃度和液固比的增加,提取液中花青苷含量下降。因此,影響黑果枸杞花青苷濃度值的主次因素為:液固比>甲醇濃度>超聲時間。確定花青苷最佳提取方法為:超聲時間20 min,甲醇濃度65%,液固比10∶1(mL∶g)。

2.2 黑果枸杞組織中花青苷組分鑒定

利用UPLC-ESI-QTOF/MS測定了黑果枸杞組織在正離子模式下的總離子流圖(total ion chromatography, TIC)。通過自動MS/MS方式查找化合物,在查找的所有化合物中根據分子離子產生的碎片離子特征,對比文獻和Metlin數據庫在黑果枸杞莖、葉、花、青果、紫果和黑果中共鑒定出19種花青苷,有10種矮牽牛素花青苷、5種飛燕草素花青苷、2種錦葵色素花青苷、1種矢車菊素花青苷、1種芍藥素花青苷,它們的保留時間、分子離子和碎片離子、定性名稱如表3所示。其中90%的花青素以葡糖糖苷、蕓香糖苷、咖啡酸和香豆酸酰化形式存在,只有矮牽牛素和飛燕草素能檢測到苷元。

表3 黑果枸杞組織中花青苷的組分

根據表3列出的花青苷分子離子,在黑果枸杞組織總離子流圖中提取了花青苷離子色譜圖(extracted ion chromatograms,EIC)。通過比較S1、S2、S3生長時期莖、葉的提取離子色譜圖發現,不同生長時期莖、葉中的花青苷組分沒有發生變化。S2時期莖、葉的離子色譜圖如圖3-a和3-b所示,莖和葉分別有6種花青苷,其中的差異花青苷是petunidin-3-O-glucoside(maloyl)-5-O-glucoside(757.219 2)和矮牽牛素葡萄糖苷(479.120 0)。花(圖3-c)中檢測到10種花青苷組分,果中的花青苷組分隨果的成熟從青果(圖3-d)中的8種增加到黑果(圖3-f)的13種。莖、葉、花、青果、紫果和黑果中主要花青苷有5種,莖、葉、花、青果中主要是飛燕草素-3-O-對香豆酸-葡萄糖苷(delphinidin-3-O-(p-coumaroyl)-glucoside)(611.162 5)、petunidin-3-O-glucoside(maloyl)-5-O-glucoside(757.219 2)、cyanidin-3-O-rutinoside(595.167 6)和petunidin-3-O-(p-coumaroyl)-glucoside(625.178 2),紫果中PRG(933.266 5)開始合成,黑果中PRG(933.266 5)占主導。

a、b、c-S2生長時期莖、葉、花的色譜圖;d、e、f-青果(S2)、紫果(S3)、黑果(S3)的色譜圖

不同生長時期黑果枸杞組織中花青苷的組分存在組織特異性。莖、葉、花、果在各個生長期內共有的花青苷是飛燕草素-3-O-對香豆酸-葡萄糖苷(611.162 5)、cyanidin3-O-rutinoside(595.167 6)和petunidin-3-O-(p-coumaroyl)-glucoside(625.178 2)。peonidin-3-glucoside(463.123 5)和malvidin-3-glucoside(493.134 2)僅在花中特有。delphinidin-3-O-rutinoside-5-O-glucoside(773.215 6)、petunidin-3-O-rutinoside(glucosyl-trans-p-coumaroyl)-5-O-glucosid(1 095.319 8)、petundin-3-O-glucoside-5-O-glucoside(641.172 4)、petunidin-3-O-rutinoside(feruloyl)-5-O-glucoside(963.276 4)、malvidin-3-O-rutinoside(p-coumaroyl)-5-O-glucoside(947.281 2)、petunidin-3-caffeoylrutinoside-5-glucoside(949.261 3)僅在黑果中特有。這種組織特異性可能與花青苷合成路徑中結構基因和轉錄因子的表達調控有關,對結構基因和轉錄因子表達分析有待進一步研究。對莖、葉、花和青果中的主要花青苷飛燕草素-3-O-對香豆酸-葡萄糖苷(611.162 5)與黑果中的主要花青苷PRG(933.266 5)的結構對比,后者是delphinidin B環上的3′位羥基進一步被MT甲基化變成了甲氧基,同時,UFGT將一分子蕓香糖連接在C環3號位上,生成更大分子質量的花青苷[8]。

S2時期葉和青果中有6種花青苷相同,只有矮牽牛素(317.065 3)和PRG(933.266 5)不同。因此,葉和青果之間的花青苷可能存在轉移的過程。青果和紫果很明顯的差異是紫果中未檢測到delphinidin(303.049 7)和矮牽牛素(317.065 3),而紫果中生成了PRG(933.266 5),它是花青苷組分隨著果的成熟進一步糖基化、甲基化和酰化的產物。糖基化、甲基化和酰化能夠提高花青苷的穩定性。另外,花青苷飛燕草素-3-O-對香豆酸-葡萄糖苷(611.162 5)的抗氧化能力強于PRG(933.266 5)[25],作為莖、葉、青果和紫果中主要的花青苷可能是植物生長發育過程中需要抵御外界的非生物脅迫,而在果成熟時生成了更穩定但抗氧化能力稍弱的花青苷。

2.3 黑果枸杞組織花青苷含量差異分析

通過UPLC-Q-Trap-MS中的MRM,在正離子模式下對9種花青素標準品進行掃描,確定Q1和Q3,并優化了錐孔電壓和碰撞能量如表4所示。

表4 九種花青素標準品的質譜參數

表5顯示了9種花青素標準品的線性方程及其特征,從相關系數的取值可以看出在整個線性范圍50～1 000 ng/mL內方程呈線性關系。重復性的相對標準偏差(relative standard deviation, RSD)值平均為3.88,精密度平均為2.79,表明重復性和精密度良好。

表5 九種花青素標品的線性方程和相關系數

圖4-a為不同生長時期組織中5種花青苷的總含量(以峰面積表示),結果顯示S1、S2和S3時期莖、葉、花中花青苷的總含量都較高,S2時期葉和花中花青苷的總含量跟黑果中的相當,莖中的花青苷總含量相比于S2時期的葉、花和黑果較低,但比青果和紫果總含量高。葉中的花青苷總含量先增加后減少,莖中的花青苷總含量在不同時期基本保持穩定,但果中的花青苷總含量隨著果的成熟顯著增加。莖、葉、花、青果、紫果和黑果都含有豐富的花青苷,說明黑果枸杞莖、葉和花也有較高的食用和藥用價值。同時,對植物而言,組織中的花青苷起到了抵御強紫外線照射引起的分子氧化作用。

a-花青苷總含量;b-花青苷含量占比

圖4-b為不同生長時期黑果枸杞莖、葉、花、青果和紫果中含量較高的5種花青苷的含量占比。莖、葉和花中的主要花青苷是飛燕草素-3-O-對香豆酸-葡萄糖苷(611.162 5),其在不同生長時期的莖、葉和花中的含量占比都接近60%。除了莖之外,其他組織中均含有petunidin-3-O-glucoside(maloyl)-5-O-glucoside(757.219 2),并且它是葉、花和青果中的次要花青苷(含量可達14%～29%)。在莖的3個生長時期,cyanidin-3-O-rutinoside(595.167 6)含量占比最高達到27%,是莖的次要花青苷。雖然青果和紫果之間花青苷的占比差異較小,但它們與黑果相比差異明顯,青果和紫果中的主要花青苷是飛燕草素-3-O-對香豆酸-葡萄糖苷(611.162 5),而黑果中主要的花青苷是PRG(933.266 5)。對比青果、紫果和黑果,飛燕草素-3-O-對香豆酸-葡萄糖苷(611.162 5)的含量占比從55%減少到5%,PRG(933.266 5)含量占比從5%增加到69%,這可能是隨著果的成熟,花青苷組分的生物合成(甲基化、糖基化和酰化)、再生和從其他組織轉移的協同效應,形成了更加穩定的PRG(933.266 5)花青苷,上述2種花青苷可能在植物生長過程發揮著不同的作用[4]。

3 結論

研究野生黑果枸杞展葉期(S1)、花期(S2)、果期(S3)的莖、葉、花、果4種組織中花青苷組分和相對含量的動態變化,發現黑果枸杞組織在不同生長時期內花青苷組分存在組織差異性,含量差異較大。莖、葉、花和果中共檢測到19種花青苷,花和黑果中的花青苷組分最為豐富,花中檢測到10種花青苷,黑果中檢測到13種。在19種花青苷中含量較高的有5種,在莖、葉、青果和紫果中主要是飛燕草素-3-O-對香豆酸-葡萄糖苷(611.162 5)、petunidin-3-O-glucoside(maloyl)-5-O-glucoside(757.219 2)、cyanidin-3-O-rutinoside(595.167 6)、petunidin-3-O-(p-coumaroyl)-glucoside(625.178 2),黑果中主要是PRG(933.266 5)。S1、S2和S3生長時期組織中花青苷的總含量都較高,S2時期的葉和花中花青苷的總含量跟黑果中的相當。葉中的花青苷總含量先增加后減少,莖中的花青苷總含量在不同時期基本保持穩定,但果中的花青苷總含量隨著果的成熟顯著增加。說明黑果枸杞莖、葉和花也有較高的食用和藥用價值。同時,研究黑果枸杞不同生長時期組織中花青苷的組分和相對含量的變化,為黑果枸杞花青苷的合成調控和形成機制研究提供基礎數據。