全二維氣相色譜飛行時間質譜結合Napping?-UFP解析清雅型和米香型白酒的香氣差異

吳凡,范紹輝,何國良,梁思宇,徐巖,唐柯*

1(江南大學 生物工程學院,釀造微生物與應用酶學研究室,江蘇 無錫,214122)2(廣東石灣酒廠集團有限公司,廣東 佛山,528031)3(石灣清雅型酒研究院,廣東 佛山,528031)

作為世界蒸餾酒的重要組成部分,中國白酒自西漢時就有記載[1],因其獨特多樣的工藝、香氣和風味,在蒸餾酒市場上受到越來越多的關注[2]。釀造白酒的原料以各種谷物為主,而香型特征的形成與原料的選擇和配比具有直接關系,行業內也有“高粱產酒香、大米產酒凈、糯米產酒柔、小麥產酒純”的說法[3]。米香型白酒是以大米為主要原料,經過小曲糖化、液態發酵、液態蒸餾等工藝步驟,釀造出具有“蜜香清雅、入口綿甜、落口爽凈、回昧怡暢”香氣風格的白酒[4]。在濃清醬米4種基本香型的基礎上,白酒衍生出了12種香型[5],且隨著工藝的進一步發展,更多衍生香型的白酒也在逐步投入市場[6]。清雅型石灣玉冰燒白酒以大米為主要發酵原料,采用野生菌和各種中草藥制作而成的藥曲為發酵劑,加水發酵,釜式蒸餾,經過山洞陳釀,釀造出了具有獨特風味特征的清雅型石灣玉冰燒白酒[7]。

近年來,隨著對白酒香氣的研究逐步深入,微量香氣化合物對白酒整體風味的影響越來越得到研究人員的重視[8-9]。全二維氣相色譜飛行時間質譜(two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry, GC×GC-TOFMS)是在一維氣相色譜的基礎上開發出來的化學鑒定手段,相比于傳統的一維分離,GC×GC-TOFMS具有2個色譜柱,可以更有效的分離出峰時間相近的化合物,改善化合物共流出對定性定量的影響[10]。因此,GC×GC-TOFMS被越來越多地應用到白酒、白蘭地等具有復雜揮發性化合物組成的研究中來。如MU等[11]通過優化和驗證頂空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction-mass spectrometry, HS-SPME)與GC×GC-TOFMS檢測的方法,用于定量中國白酒中的痕量香氣化合物;李元一等[12]采用HS-SPME結合GC×GC-TOFMS和感官分析對來自中國煙臺和法國干邑的9種白蘭地的香氣特征進行了分析和區別;凌與聽等[13]采用HS-SPME結合GC×GC-TOFMS系統分析了古井貢酒中的揮發性化合物,并明晰了陳釀時間對于古井貢酒造成的揮發性化合物組成的差異性。

在解析白酒香氣屬性特征時,感官分析也是不可或缺的方法。目前,定量描述分析(quantitative descriptiv analysis, QDA)實驗廣泛應用于各類酒精飲料香氣的描述和量化中。經過科學訓練的感官人員能夠準確描述和定量復雜香氣中的各類香氣屬性及其強度[14]。但QDA前期訓練的周期長,成本高,促使研究人員逐漸開發并轉向更為簡單便捷的感官分析方法[15]?？焖俑泄俜治黾夹g(Napping?)是一種基于感官位置的擺放從而確定樣品相似性和差異性的一種快速感官分析方法[16]。相比于傳統的感官分析方法,Napping?的培訓難度低、周期短、成本少,近年來在國外的感官實驗中越來越多被應用。Napping?和ultra flash profiling(UFP)常常在感官實驗中被結合使用,在感官圖旁邊自由寫下描述詞,其分析結果可以達到近似于QDA的結果[17]。

清雅型白酒源于米香型,經過釀造工藝的改良,風味與傳統米香型具有較大差異,但是其物質特征及風格特點還尚未有過系統研究。因此,本研究以清雅型石灣玉冰燒白酒和傳統米香型白酒為研究對象,采用GC×GC-TOFMS儀器分析和Napping?-UFP感官分析技術,對清雅型石灣玉冰燒白酒和傳統米香型白酒進行化學分析和感官分析,區別兩者之間的化學組成差異和感官屬性差異。研究不僅豐富了以大米為主要原料的白酒風味化學的理論體系,同時為其風味的進一步調控提供基礎數據和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

本研究選用了2款清雅型石灣玉冰燒白酒和4款傳統米香型成品白酒,每個樣品3瓶,具體信息如表1所示。

表1 白酒樣品信息

1.1.2 試劑

C7～C30直鏈正構烷烴、愈創木酚(CAS:74495-69-5),均為色譜純,Sigma-Aldrich公司;NaCl,分析純,國藥集團上海有限公司。

1.2 儀器與設備

全二維氣相色譜-飛行時間質譜儀(Pegasus?4D飛行時間質譜儀,美國Leco公司;KT-2001冷噴調制器,美國Zoex公司;Agilent 7890B氣相色譜,美國Agilent公司);MPS2頂空固相微萃取多功能自動進樣系統,德國Gerstel公司;2 cm 50/30 μm DVB/CAR/PDMS三相萃取頭,美國Supelco公司;一維色譜柱DB-FFAP(60 m×0.25 mm×0.25 μm),美國Agilent公司;二維色譜柱Rxi-17Sil MS(1.5 m×0.25 mm×0.25 μm),美國Restek公司;Mili-Q超純水儀,美國密理博公司;電子天平,Mettler-Toledo公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 感官分析

參考GB/T 16291.1—2012《感官分析 選拔、培訓與管理評價員一般導則 第1部分:優選評價員》和研究室前期已建立的方法[18]進行感官品評人員的篩選和品評小組的組建。實驗室通過自愿報名,問卷調查的方式從報名的50人中篩選出22個無不良嗜好,具有白酒品評經驗的人,進行感官培訓。感官小組進行為期1月,1周1次的感官培訓,主要內容包括香氣識別測試,差異測試和分類標尺實驗檢驗。最終通過測試的15人組成感官實驗小組。

正式實驗時,每款白酒中取15 mL放入品評杯中,每一杯隨機設置三位數,一起將6款白酒都交給品評員,要求品評員對6款白酒香氣進行嗅聞,將6杯白酒按照香氣的相似性和差異性放置在A4紙上。在全部擺放完后,在每一杯白酒下用圓圈和對應的數字做標記,并根據香氣特點,在每一杯旁邊寫3～5個香氣描述詞。

1.3.2 HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析

樣品前處理:參考研究室前期已建立的方法[19],使用超純水將每款白酒按照酒精度稀釋到10%vol,取5 mL稀釋后酒樣于20 mL氣相進樣瓶中,并加入1.5 g NaCl和50 μL 20.88 mg/L同位素內標愈創木酚。

頂空萃取:采用頂空固相微萃取多功能自動進樣系統進行自動進樣。在50 ℃下平衡5 min,萃取時間45 min,轉速400 r/min,萃取后在進樣口解析5 min,接著運行飛行時間質譜的程序,不分流進行3次。

二維氣相色譜條件[20]:采用高純度He(純度>99.999 5%)為載氣,流速1 mL/min,樣品運行設置為恒流模式。一維烘箱的起始溫度45 ℃,3 min后升溫至150 ℃,升溫速度4 ℃/min,保持2 min,繼續升溫到200 ℃,升溫速度6 ℃/min,最后升溫到230 ℃,升溫速度10 ℃/min,保持10 min。二維烘箱的溫度一直比一維烘箱高5 ℃。

飛行時間質譜條件:EI電離源,離子源電壓70 eV,離子源溫度230 ℃,線溫度240 ℃。采集質量數范圍m/z35～400,采集頻率100 spectra/s。檢測器電壓為1 430 V。

1.4 數據處理方法

1.4.1 全二維氣相色譜飛行時間質譜數據處理

揮發性化合物定性[21]:采用軟件自帶的解析軟件ChromaTOF?4.61.1.0 software(LECO Corporation)進行化合物的定性。識別信噪比>200的色譜峰,自動解卷積并與軟件自帶的質譜庫進行對比。篩選相似度>700且3個平行中至少檢測到2次的化合物,刪除含有鹵族元素和柱流失的化合物。根據相同運行程序條件下,C7～C30直鏈正構烷烴的出峰時間,自動計算出各個化合物的保留指數(retention index, RI),保留與文獻記錄的保留指數相差<50的化合物。

揮發性化合物半定量質量濃度的計算如公式(1)所示:

(1)

1.4.2 數據處理

使用R語言處理Napping?-UFP實驗數據,并繪制普氏多維向量分析圖(procrusts multiple factor, PMFA);SIGMA軟件處理差異性化合物數據,并繪制主成分分析(principal component analysis, PCA)圖;HTML處理差異性化學物數據,繪制聚類熱圖。

2 結果與分析

2.1 感官分析

感官實驗是進行香氣分析的重要一環,往往和化合物分析相關聯。通過感官實驗明確白酒的特征香氣屬性及其強弱,對產品的工藝環節和消費偏好都有重要的指導意義。Napping?是一種快速感官分析方法,目前已廣泛應用于各類食品風味的解析中[22],而在白酒風味感官實驗中還尚未見報道。為了明確清雅型石灣玉冰燒白酒香氣的風格特點以及和米香型白酒的差別,本研究采用快速感官分析技術Napping?-UFP進行分析。匯總和處理Napping?和UFP實驗結果后,分別繪制6種白酒的聚類特征圖和香氣特征相關性圖(圖1)。觀察Napping?實驗結果繪制出的聚類特征圖(圖1-a),2款清雅型石灣玉冰燒白酒聚在一起,位于x軸左側,而4款米香型白酒聚在一起,位于x軸右側,這說明清雅型石灣玉冰燒白酒和米香型白酒在香氣特征上具有明顯的差異,且這種差異遠大于酒精度帶來的區別。結合UFP實驗結果繪制出的香氣特征相關性圖(圖1-b)發現,清雅型石灣玉冰燒白酒在植物、油脂香、中藥、甘草、薄荷、雪碧等屬性上明顯區別于米香型白酒,而米香型白酒的香氣則更多表現為米香以及水果、蜂蜜、糖果等甜香的香氣特性。

a-聚類特征;b-香氣特征相關性圖

2.2 HS-SPME-GC×GC-TOF/MS分析

2.2.1 揮發性化合物組分定性分析

采用HS-SPME-GC×GC-TOFMS,在清雅型石灣玉冰燒和米香型白酒中共定性出了400種揮發性化合物見電子版增強出版附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035392),其中2款清雅型石灣玉冰燒白酒中含有292種,具體各類別揮發物結果見表2。2款清雅型石灣玉冰燒白酒中鑒定出的揮發性化合物中含有酯類化合物78種,米香型白酒中鑒定到的酯類化合物數量大致相同,有83種。以往的白酒香氣化合物研究中,酯類化合物的往往數量最多[23],這與本實驗結果相符。從單個樣品來看,2款清雅型石灣玉冰燒白酒的酯類化合物均多于對照組米香型白酒。由于主要原料是大米或者糯米,大量氨基酸在酵母的作用下轉化為高級醇[24],因此大米為原料釀造的白酒往往具有較多的醇類物質。本研究在清雅型石灣玉冰燒和米香型白酒中共檢測到55種醇類化合物,其中清雅型石灣玉冰燒中含有52種,而米香型白酒占40種。某些高級醇具有調和香氣和后味的作用,而醛類化合物主要起到影響香氣釋放和香氣質量的作用[25]。清雅型石灣玉冰燒白酒中的醛類化合物的種類明顯高于米香型白酒。己醛類的醛類化合物往往給白酒帶來生青、草本類的香氣[26]。清雅型石灣玉冰燒檢測到的萜類化合物共有25種。先前的研究中,何張蘭等[27]通過對肉桂葉的揮發性香氣化合物進行檢測分析,發現其中含有多種萜類化合物。而清雅型石灣玉冰燒白酒的制曲過程中加入了甘草、肉桂葉、八角等多種中草藥,因此酒中檢測到大量的萜類化合物可能部分會來源于酒曲中加入的中草藥,同時萜類物質也是感官特征中植物、中草藥香氣的重要來源。此外,從檢測到化合物的數量來看,清雅型石灣玉冰燒白酒比米香型白酒含有的化合物更多。

表2 HS-SPME-GC×GC-TOFMS中鑒定的揮發性化合物

2.2.2 揮發性化合物組分半定量濃度分析

并不是所有的揮發性化合物都具有香氣特征,因此又進一步通過檢索Flavornet Home(http://www.flavornet.org/index.html)和Flavor DB(https://cosylab.iiitd.edu.in/flavordb/)2個香氣數據庫,對定性出的揮發性化合物進行篩選,鎖定了292種具有香氣特征的揮發性化合物。將上述香氣化合物的半定量濃度[見電子版增強出版附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035392)]進行單因素方差分析,篩選具有顯著差異的化合物(P<0.01),并依據半定量濃度進行聚類熱圖分析和主成分分析。根據PCA結果(圖2)可以發現,2款清雅型石灣玉冰燒白酒和對應的米香型白酒分別位于X軸兩側,這表明清雅型石灣玉冰燒白酒在差異性香氣化合物種類和濃度方面明顯區別于米香型白酒。

圖2 清雅型石灣玉冰燒和米香型白酒差異性化合物主成分分析

熱圖的聚類結果(圖3)同樣驗證了PCA的結果,6款白酒中2個香型的白酒分別聚成一類,說明在顯著差異性化合物的種類和濃度上,清雅型石灣玉冰燒和米香型白酒均具有各自的特征。熱圖顯示清雅型石灣玉冰燒白酒中含量較高的物質主要是醛類、醇類、萜類等化合物。酯類化合物是白酒香氣中貢獻水果屬性的重要化合物,清雅型石灣玉冰燒白酒中酯類化合物較多,但XU等[23]研究中具有重要香氣影響的酯類化合物(如異戊酸乙酯、乙酸苯乙酯)在米香型白酒中的濃度更高,這和感官結果中米香型白酒具有更多更強的水果香氣屬性相符。清雅型石灣玉冰燒中較多醛類和醇類化合物的濃度明顯高于米香型白酒,這2類物質往往貢獻出生青和植物的香氣,極有可能是清雅型石灣玉冰燒感官特性中各類植物香氣屬性的來源。alpha-松油醇和反式橙花叔醇等萜類化合物在清雅型石灣玉冰燒中的濃度略高于米香型白酒,這些萜類化合物的閾值往往極低,可能是構成植物類和香料類香氣屬性的關鍵香氣物質。感官實驗結果中清雅型石灣玉冰燒具有較為明顯的烘焙類香氣,這可能由呋喃和內酯類化合物貢獻。許多呋喃類化合物的閾值偏低,且具有烘焙、堅果類的香氣,往往是構成白酒中烘焙糧香屬性的重要化合物。顯著差異性化合物中,呋喃類化合物數量較多,其中2-戊基呋喃和糠醛等化合物的含量較高,明顯多于米香型白酒?？啡┳鳛橐环N具有杏仁、焦香香氣的揮發性化合物,被證明是醬香型白酒和芝麻香型白酒的重要呈香物質[28]。而清雅型石灣玉冰燒中含有濃度明顯高于米香型白酒的糠醛,這可能是造成清雅型石灣玉冰燒白酒中焦糖和杏仁屬性的重要物質。

圖3 顯著性差異香氣組分熱圖分析和 HCA 聚類分析

3 結論

以清雅型石灣玉冰燒白酒和米香型白酒為研究對象,采用GC×GC-TOFMS結合Napping?-UFP感官實驗,探究其香氣的化學構成和感官差異。GC×GC-TOFMS定性出了400種揮發性化合物,通過香氣數據庫篩選出了292種香氣化合物,以酯類、醇類、醛酮類、萜類化合物為主。聚類熱圖和PCA結果顯示,清雅型石灣玉冰燒白酒和米香型白酒在香氣化合物的種類和濃度具有明顯差異。Napping?-UFP結果顯示,植物、油脂香、中藥、甘草、薄荷、雪碧是清雅型白酒區別于米香型白酒的主要香氣屬性。該研究明確了清雅型石灣玉冰燒白酒的風味組成和感官特性,豐富了以大米為主要原料的白酒風味化學研究體系。