腸道微生物和前庭功能障礙之間的因果關系：孟德爾隨機化研究

張 彬， 滕 鑫， 吳 彤， 韓 琦， 董晗碩， 劉 寅， 項 顆， 孫 莉

前庭功能障礙（disorders of vestibular function）發(fā)生在許多以眩暈為主要表現(xiàn)的疾病中，其表現(xiàn)形式包括旋轉或非旋轉性的眩暈或頭暈、自發(fā)性眼顫，此外還會伴隨惡心、嘔吐等消化系統(tǒng)癥狀。調查顯示約有1/5 的成年人受到頭暈或眩暈的困擾［1］，而前庭性眩暈的患病率占比約為20%～30%［2］。機體在正常情況下不斷地處理3 種類型的感覺輸入，即前庭感覺、視覺和軀體感覺，這3 種輸入的信息在前庭系統(tǒng)被整合起來，從而形成頭部對身體的方向和運動的感受［3］。由于前庭系統(tǒng)的異常信號或不對稱處理導致了眩暈癥狀的產生，大約有30%的人在生命的某個階段會出現(xiàn)眩暈癥狀［2］。前庭功能障礙與情緒改變之間關系復雜，多數(shù)患者除眩暈癥狀和不穩(wěn)感外，還易伴發(fā)焦慮和軀體化癥狀［4］，眩暈癥狀的反復發(fā)生導致焦慮，長時間的焦慮又反過來加重眩暈，逐漸產生惡性循環(huán)，但這種惡性循環(huán)背后的分子機制尚未完全闡明。先前的研究表明前庭神經核與許多焦慮相關腦區(qū)存在聯(lián)系［5，6］，包含中縫背核、藍斑核等，大腦中的前庭通路和情緒通路相互作用，包括5-羥色胺（5-HT）、去甲腎上腺素（NE）等在內的多種神經遞質參與其中［3，7］。5-HT 在前庭通路和情緒通路的廣泛分布提示我們5-HT 可能是平衡、整合運動、失衡出現(xiàn)不良情緒的敏感性調節(jié)過程中的重要媒介［8］。NE 含量的增加與焦慮或恐懼等情緒的激發(fā)密切相關，在處理壓力、記憶恐懼事件和感受威脅方面有重要的作用［9］。在前庭損傷的早期，NE 含量的升高可能是患者眩暈后焦慮水平增高的重要因素之一［10］，當焦慮情緒出現(xiàn)時，NE 通過藍斑傳入前庭神經核，前庭脊束興奮，增強肢體肌肉活動，表現(xiàn)出警覺和姿勢搖擺，同時前庭眼動也增加，發(fā)生焦慮及平衡不穩(wěn)。谷氨酸是前庭神經傳導過程中的重要媒介，它可以維持中樞前庭神經元的放電過程，也可能對中央前庭結構中突觸傳遞進行調節(jié)［11］。腸道微生物是一個動態(tài)而復雜的生態(tài)微生物群落，曾被稱為“被遺忘的器官”［12］。過去的研究表明，腸道微生物對機體健康有重要的調節(jié)作用，它在宿主營養(yǎng)代謝、藥物代謝、維持腸道黏膜屏障結構完整性、免疫調節(jié)和抵御病原體方面具有特殊的功能［13］。近年來的研究表明，腸道微生物可以通過“腸-腦軸”調節(jié)腸道中的神經遞質進而影響神經系統(tǒng)，調整腸道微生物群可以改善5-HT 相關疾病的癥狀［14］。更有研究證明單側前庭損傷術后的小鼠焦慮水平出現(xiàn)一定程度的提高，同時體內的代謝物和腸道微生物也發(fā)生改變［15］。

綜上，神經遞質在前庭神經系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，而腸道微生物可以調節(jié)宿主體內神經遞質的變化，并通過“微生物-腸-腦軸”與大腦進行交流，但腸道微生物和前庭功能障礙之間的因果關系還有待進一步研究。

隨機對照試驗（randomized controlled trials，RCTs）是傳統(tǒng)方法中用來推斷因果關系的金標準，但在某些情況下，由于倫理要求的限制，完全實施隨機、對照具有很大的難度。孟德爾隨機化（mendelian randomization，MR）利用遺傳變異作為工具變量，來評估從暴露因素到結果的因果關系，可以作為一種替代的方法。根據(jù)孟德爾遺傳定律，在減數(shù)分裂的過程中，親代等位基因會隨機分配給子代，即在這個過程中會出現(xiàn)隨機的遺傳變異體，所選擇的遺傳變異體不會受到出生后社會、經濟等復雜環(huán)境因素的影響［16］。MR 方法在概念上與RCT 類似，區(qū)別在于MR 研究是根據(jù)患者的基因型來進行分配的。隨著越來越多的GWAS數(shù)據(jù)被研究者們共享，MR研究也獲得了大量可靠的遺傳變異［17］。MR 研究依賴于3 個假設［18］：（1）工具變量（IVs）與暴露因素強相關；（2）IVs 應該與影響“暴露-結局”的任何混雜因素無關；（3）IVs應只通過暴露影響結局。

本研究利用兩樣本MR 方法（two-sample mendelian randomization），利用腸道微生物的GWAS 數(shù)據(jù)作為本研究的暴露數(shù)據(jù)，前庭功能障礙的GWAS 數(shù)據(jù)作為本研究的結局數(shù)據(jù)，來研究腸道微生物與前庭功能障礙之間的因果關系。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 本研究中的腸道微生物GWAS 數(shù)據(jù)來源于MiBioGen 聯(lián)盟2021年發(fā)表的迄今為止最大的對美國、加拿大、以色列、韓國、英國等24 個國家，18 340 位個體進行測序得來的基因測序譜和基因分型數(shù)據(jù)，包含211 類腸道微生物［19］。前庭功能障礙的GWAS 數(shù)據(jù)來源于芬蘭數(shù)據(jù)庫（https：//www. finngen. fi/fi）中針對歐洲的前庭功能障礙人群的一項研究，包含216 903 位個體以及16 380 431個SNP位點，所有數(shù)據(jù)均可在公開數(shù)據(jù)庫中下載，圖1簡要展示了本研究的整個流程。

圖1 MR分析流程圖

1.2 工具變量的選擇 為保證腸道微生物和前庭功能障礙之間因果關系結論的準確性和真實性，本研究采用以下質量控制步驟來選擇最佳的工具變量：（1）在全基因組統(tǒng)計顯著性閾值（P＜0.000 1）基礎上，選擇與每個屬相關的單核苷酸多態(tài)性（SNPs）作為潛在的工具變量；（2）設置連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）參數(shù)r2＜0.01，遺傳距離為10 000 kb，選擇P值最小的SNPs，以保證工具變量間的獨立性，排除LD 對結果的影響；（3）對數(shù)據(jù)進行預處理，使其效應等位與效應量保持統(tǒng)一，排除回文SNPs，即A/T和A/C的等位基因；（4）利用異質性檢驗、多效性檢驗和留一法評估結果的穩(wěn)定性，并通過去除異常值消除多效性的影響［20］；（5）本研究使用以下方程來評估所選擇的SNPs的F統(tǒng)計量，r2代表IVs解釋暴露的程度，n代表暴露GWAS研究的樣本數(shù)，k代表SNP 的個數(shù)，F(xiàn)統(tǒng)計量用來評估弱工具變量效應，F(xiàn)統(tǒng)計量＜10，說明是弱工具變量，并被排除。

1.3 孟德爾隨機化分析 本研究以雙樣本孟德爾隨機化方法來評估腸道微生物對前庭功能障礙的因果關系，并且使用逆方差加權法（inverse variance weighted，IVW）［21］、MR-Eagger 回歸法［22］、加權中位數(shù)法（weighted median estimator，WME）［23］等方法對腸道微生物與前庭功能障礙之間的因果效應進行估計。每種統(tǒng)計方法均有獨立的假設模型，IVW方法假設無水平多效性，MR-Eagger方法假設在多于半數(shù)的SNPs 中存在多效性，WME 法假設在少于半數(shù)SNPs中存在多效性。在所用方法中，以IVW 方法的準確度強于其他方法，故本研究主要基于IVW 方法的結果，以其他方法的結果作為補充。為了評估研究結果的穩(wěn)定性，本研究利用IVW 方法中的Q 檢驗和MR-Eagger 回歸法來檢驗是否存在潛在的異質性和多效性，利用留一法分析（leave-one-out analysis）進行敏感性分析，分析所得出的因果效應是否只由單個SNP影響。

1.4 反向孟德爾隨機化分析 我們還進行了另外一個MR 分析來研究前庭功能障礙作為暴露因素，腸道微生物特征作為結局的反向因果關系，反向MR分析流程與上述相同。

本研究所有分析均采用R 軟件進行，MR 分析主要依托R軟件包中的two sample MR［18］進行。

2 研究結果

2.1 工具變量 根據(jù)P＜0.000 1 閾值、連鎖不平衡分析以及去除回文SNPs 后，得到1 642 個SNPs作為工具變量進行MR 分析，納入10 個腸道微生物分類別進行兩樣本MR 分析。F統(tǒng)計量均＞10，表明無弱工具偏差（見表1）。

表1 MR分析中腸道微生物群對前庭功能障礙的因果估計（IVW方法）

2.2 兩樣本孟德爾隨機化分析 本研究利用兩樣本孟德爾隨機化方法，從門、綱、目、科、屬等水平分析腸道微生物相對豐度與前庭功能障礙的因果關系，分析結果以IVW 方法為主，其他方法作為補充。

在IVW 方法中，發(fā)現(xiàn)腸道微生物中的Bifidobacteriaceae（OR=0.77，95%CI0.65～0.90，P=0.001）、Ruminococcusgnavusgroup（OR=0.85，95%CI0.74～0.97，P=0.02）Bifidobacterium（OR=0.78，95%CI0.66～0.93，P=0.01）Butyrivibrio（OR=0.91，95%CI0.83～0.99，P=0.03）豐度的升高，會降低前庭功能障礙的風險。RuminococcaceaeUCG005（OR=1.20，95%CI1.03～1.40，P=0.02）Sellimonas（OR=1.13，95%CI1.03～1.24，P=0.01）Lachnospira（OR=1.40，95%CI1.03～1.90，P=0.03）的豐度升高，會升高前庭功能障礙的風險，詳細結果見表1。圖2表示腸道微生物對前庭功能障礙的因果效應估計；補充圖1表示本研究在不同方法中，總體效應值的方向一致。

圖2 腸道微生物對前庭功能障礙的因果效應

2.3 質量控制 為進一步檢驗研究結果的穩(wěn)定性和可靠性，本研究利用錯誤發(fā)現(xiàn)率（false dscovery rate，F(xiàn)DR）校正MR 結果，用異質性檢驗、多效性檢驗和敏感性分析對納入的SNPs 進行質量控制，結果顯示所納入SNPs 的異質性檢驗和多效性檢驗的結果均為P＞0.05，表明在本研究中無需考慮異質性和多效性對研究結果造成的影響，具體結果（見表1）。補充圖2 顯示敏感性分析結果顯示本研究所納入的IVs 的效應值和總效應值大小比較接近，說明研究結果具有一定的穩(wěn)定性。

2.4 反向MR 分析結果 將前庭功能障礙的GWAS 數(shù)據(jù)作為暴露因素，腸道微生物GWAS 數(shù)據(jù)作為結局進行MR 分析，在剔除P＞0.05 的SNP 及去除連鎖不平衡后，我們未能在結局中提取到暴露因素的SNP，即沒有證據(jù)表明前庭功能障礙與已確定的腸道微生物之間存在因果效應。

3 討 論

本研究利用公共數(shù)據(jù)庫中的腸道微生物GWAS數(shù)據(jù)作為暴露因素，前庭功能障礙的GWAS 數(shù)據(jù)作為結局，使用兩樣本孟德爾隨機化方法分析了211種腸道微生物與前庭功能障礙的因果關系，發(fā)現(xiàn)腸道微生物中的Bifidobacteriaceae、Ruminococcusgnavusgroup、Bifidobacterium、Butyrivibrio是前庭功能障礙的保護因素，而RuminococcaceaeUCG005、Sellimonas、Lachnospira是前庭功能障礙的危險因素，在經過FDR矯正后，發(fā)現(xiàn)Bifidobacteriaceae的結果最具有穩(wěn)定性。

腸道微生物中的益生菌存在著“定植抵抗”，也被稱為“屏障效應”，是宿主體內的腸道微生物用來維持其穩(wěn)定生態(tài)的重要機制，這些益生菌對人體有一定的益處，能夠產生大量的生物活性化合物，包括神經遞質、免疫刺激物和各種維生素［24，25］，同時還具有抗炎、抗癌、抗過敏和血管生成活性方面的作用以及抗肥胖、抗糖尿等潛在作用，對大腦中的中樞神經系統(tǒng)也有一定的影響［26］。近年來的研究表明，腸道微生物可以通過由中樞神經系統(tǒng)、自主神經系統(tǒng)、腸神經系統(tǒng)和腸道微生物等組成的“微生物-腸-腦”軸與大腦相互調控［27］。研究表明，Bifidobacteriaceae對前庭功能障礙存在正向調節(jié)作用，Bifidobacteriaceae屬于雙歧桿菌屬，雙歧桿菌是人體腸道，尤其是新生兒腸道中最豐富的菌屬之一，對免疫系統(tǒng)的成熟具有重要的作用［28］，各項流行病學研究已經證實兒童時期的腸道微生物失調與老年時期的免疫系統(tǒng)紊亂具有明確的相關性［29，30］，而免疫系統(tǒng)作為腸腦互動中的關鍵角色，一直與焦慮、抑郁等精神類疾病相關。人體內的雙歧桿菌數(shù)量會出現(xiàn)增齡性的減少，尤其是在65 歲之后，與30 歲青年人相比更為明顯［31］，而前庭神經系統(tǒng)的生理功能隨著年齡增長而出現(xiàn)退行性改變，而這種改變也是引起前庭功能障礙的原因之一［32］，然而這種損傷的明確機制還未完全闡明，隨著“微生物-腸-腦軸”理論逐漸成熟，研究者們更加重視腸道微生物群在宿主體內發(fā)揮的功能和作用，而我們的研究結論或許能夠作為前庭功能障礙的早期篩查指標之一。

作為可食用的益生菌，雙歧桿菌在調節(jié)疾病方面發(fā)揮著多作用。一項研究通過給運動員服用雙歧桿菌來改善壓力下的焦慮狀態(tài)，觀察到隨著運動員體內雙歧桿菌豐度的增加，焦慮水平隨之下降［33］。雙歧桿菌可以有效改善小鼠的焦慮癥狀，同時還可以降低血清促炎細胞因子IL-6 水平，來改善抑郁和調節(jié)神經［34］。長時間的鉛暴露可能會導致中樞神經受損，導致焦慮、抑郁的發(fā)生，Chen［35］等人對鉛暴露SD 大鼠的腸道微生物進行測序后發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，暴露組大鼠的雙歧桿菌和乳酸菌的豐度顯著下降，并且下調了5-HT 和5-HT3R 的表達，導致了抑郁樣行為，這提示我們雙歧桿菌和乳酸菌可能是通過腸腦軸調節(jié)5-HT，改善抑郁樣行為。Hend［36］等研究表明高濃度的GABA 表達與雙歧桿菌豐度升高存在相關性，雙歧桿菌在調節(jié)GABA 的產生和谷氨酸的消耗方面發(fā)揮作用，來維持宿主神經系統(tǒng)的正常。前文已經討論5-HT 在前庭神經系統(tǒng)和焦慮中的作用，我們的研究提示雙歧桿菌對前庭功能障礙存在著正向調節(jié)作用，但5-HT 是否為此環(huán)節(jié)中的關鍵角色以及其具體機制還有待進一步的驗證。

我們的研究基于已知的腸道微生物與前庭功能障礙之間存在關聯(lián)，進一步通過兩樣本孟德爾隨機化方法研究兩者之間的因果關系。本研究的優(yōu)勢包括以下兩點：（1）我們借助MR 方法可以有效避免混雜因素，同時利用多重敏感性分析證實了我們的結論具有穩(wěn)健性。（2）我們所確定的因果關系可能為后續(xù)的機制研究和益生菌的開發(fā)提供候選細菌。

本研究也存在著一些局限性，首先，我們只利用了歐洲人群的GWAS 數(shù)據(jù)進行分析，未來還需在其他人群展開研究；第二，研究所納入的腸道微生物豐度有限，盡管我們所使用的腸道微生物GWAS 數(shù)據(jù)在撰寫截止之前是擁有最大人群隊列的腸道微生物測序研究，但隨著研究的不斷深入，我們仍然需要更加全面地研究腸道微生物和前庭功能障礙之間的關系；第三，TSMR 方法是一種高效的因果關系分析方法，但仍需開展動物試驗進行驗證。

綜上所述，我們評估了腸道微生物和前庭功能障礙之間的因果關系。4 種細菌與前庭功能障礙具有負向因果關系；3種細菌與前庭功能障礙存在正向因果關系。在經過FDR 矯正后，發(fā)現(xiàn)Bifidobacteriaceae與前庭功能障礙關系最為密切，其作用機制可能是通過腸腦軸影響5-HT 等神經遞質，改善了前庭神經系統(tǒng)，但仍需進一步驗證。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：張彬負責論文撰寫和修改；滕鑫負責數(shù)據(jù)收集；吳彤、韓琦負責數(shù)據(jù)整理、圖片調整；董晗碩、劉寅負責論文審校；項顆負責文章指導；孫莉負責論文設計和最后定稿。