快速眼動睡眠行為障礙和帕金森病患者血漿外泌體α-syn的變化

張新雨， 張婷婷， 許鵬飛， 王夢云， 王升輝， 周 瑤， 白瑩瑩， 張紅菊

快動眼睡眠行為障礙（rapid eye movement sleep behaviour disorder，RBD）是一種異態睡眠，表現為快速眼動睡眠期出現與夢境相關的異常行為［1］；分為特發性RBD（idiopathic RBD， iRBD）和繼發性RBD。約有30%～50%的PD患者伴有RBD［2］，因此又稱 iRBD是帕金森?。≒arkinson disease， PD）的臨床前期。iRBD 轉化為PD 間隔約5～10年［3］， 預測iRBD 轉化的早期診斷可為PD的干預提供廣闊的窗口。

PD 的病理改變是黑質細胞出現α-突觸核蛋白（α-synuclein，α-syn）的沉積和路易小體的形成，當黑質細胞損害達到50%～60%時才出現運動損害癥狀，因此iRBD 期間可能存在α-syn 的沉積。尸檢研究證明iRBD 和PD 患者的胃腸道、涎腺和皮膚活檢樣本均存在α-syn［4-6］，部分iRBD 患者嗅黏膜［7］及腸黏膜［8］活檢也發現了α-syn。

外泌體（exosome，EXO）是一種特殊的細胞外囊泡，通過胞體內陷與質膜融合釋放。通過轉運蛋白質、脂質、DNA、mRNA 和miRNA 等物質調節受體細胞的功能，參與細胞間交流、抗原提呈、病原體傳播、免疫應答、程序性細胞死亡、血管生成、炎癥反應和凝血等過程；可穿透血腦屏障傳遞中樞與外周信息。可在血清/血漿、腦脊液、尿液中均檢到，對疾病早期診斷更加敏感和特異。越來越多的研究發現PD 血漿神經元外泌體中α-syn 較正常健康人升高［9］，而iRBD血漿外泌體α-syn研究報道結果不一。

本研究擬通過定量比較iRBD、早期不伴RBD的PD 患者（PD-nRBD）血漿外泌體α-syn 水平，尋找iRBD 轉化的早期生物學標志物；通過對比分析血漿外泌體α-syn水平與iRBD夜間運動癥狀及PD-nRBD運動損害的評分相關性，探討iRBD 的REM 睡眠異常行為的病理機制。

1 對象與方法

1.1 對象 從河南省人民醫院神經內科招募符合歐洲運動障礙協會（MDS）PD 標準但不伴RBD的受試者21例為PD-nRBD 組，符合睡眠障礙國際分類第3 版iRBD 診斷標準的受試者20 例外為iRBD組，選取年齡、性別匹配的門診健康體檢者20 例為健康對照組（healthy control，HC）。

排除標準：（1）排除腦血管病、腦炎、癲癇、外傷等引起腦部結構功能改變的疾??；（2）排除家族性帕金森綜合征、帕金森疊加綜合征、藥物導致的帕金森綜合征、特發性震顫患者；（3）剔除重度心肺肝腎疾病及惡性腫瘤可能；（4）排除合并其他睡眠障礙患者；（5）排除藥物、酒精依賴的人群；（6）排除焦慮、抑郁等精神疾病患者；（7）排除文盲、失聰等不配合者。iRBD 組需排除繼發性RBD 患者；PD-nRBD組需排除伴RBD 的PD 患者，即快眼動睡眠障礙量表-香港版（RBDQ-HK）評分＞18排除。

1.2 臨床量表評估 對所有受試者進行行為學評估，利用統一帕金森病評定量表第3 部分（The unified Parkinson disease rating scale，UPDRS Ⅲ）和Hoehn-Yahr（H-Y）分期量表評估運動損害癥狀，使用RBDQ-HK評估夜間夢境及異常行為。

1.3 血漿樣本采集及外泌體提取 在取得受試者知情同意的情況下從每位受試者采集約10 ml血液，然后在4 °C 下靜置6 h，并以3 000 g 離心15 min收集血漿，并儲存于-80 °C冰箱待使用。

利用ExoQuickTM外泌體提取試劑盒（SBI，Cat EXOQ5A-1，Palo Alto，CA，USA）提取外泌體，通過透射電子顯微鏡證實分離的外泌體的形態；同時進行Western blotting 評估外泌體標志物（CD63、TSG101）的表達。

1.4α-syn 定量分析 為了量化和比較血漿外泌體α-syn 含量，我們使用ELISA 試劑盒（Elabscience Biotechnology，E-EL-H0983c，Wuhan，China）進行測量。

1.5 統計分析 采用SPSS 26.0軟件進行統計分析。正態分布的計量資料采用（±s）表示，方差齊性的多組比較采用單因素方差分析，兩獨立樣本比較采用t檢驗；非正態分布的計量資料以中位數和（四分位數）［M（P25，P75）］表示，組內比較采用秩和檢驗，組間比較采用U檢驗；計數資料以相對數構成比（%）或率（%）表示，采用Fisher 確切概率分析；符合正態分布的數據采用Pearson 相關分析，不符合正態分布的數據采用Spearman 相關分析。P＜0.05 被認為具有統計學意義。

2 結 果

2.1 人口信息學資料及臨床量表評估結果

研究期間共納入61 例受試者，其中iRBD 組20 例，平均年齡（63.05±6.94）歲，男性12 例；PD-nRBD 組21例，平均年齡（62.24±6.09）歲，男性12例；HC組20例，平均年齡（61.7±6.88）歲，其中男性12例（見表1）。

表1 iRBD、PD-nRBD、HC組人口信息資料及臨床量表評分比較

iRBD、PD-nRBD、HC 組在年齡、性別、受教育程度、BMI 上不具有統計學意義（P＞0.05），iRBD 組和PD-nRBD 組病程不具有統計學差異（P＞0.05）（見表1）。

iRBD、PD-nRBD、HC組RBDQ-HK評分具有統計學差異（P=0.000 1），其中iRBD 組評分分別高于PDnRBD、HC 組（P=0.000 1，0.000 1），PD-nRBD 與HC組不具有統計學差異（P＞0.05）。3組UPDRS III評分具有統計學差異（P=0.000 1），其中iRBD、PD-nRBD組評分分別高于HC組（P=0.045，0.000 1），PD-nRBD組評分明顯高于iRBD組（P=0.000 1）（見表1）。

2.2 血漿外泌體的鑒定

2.2.1 透射電鏡檢測血漿中提取的外泌體形態學 取出凍存于-80 ℃冰箱中的外泌體重懸液，置于透射電鏡下檢測，觀察iRBD組（見圖1A）、PD-nRBD組（見圖1B）、HC組（見圖1C）均可見多個大小均一的囊泡狀結構，直徑為30～150 nm，與其他文獻報道結果一致［10］，經上述鑒定證實提取的囊泡結構為外泌體顆粒。

圖1 血漿外泌體的鑒定

2.2.2 血漿外泌體內源性特異性蛋白檢測

根據蛋白組學，外泌體可表達特定的蛋白分子，稱之為內源性特異性蛋白，如CD9、CD63、TSG101等［11］。利用Western blotting 檢測CD63、TSG101 表達情況，結果顯示3 組提取物均有大量CD63、TSG101 表達（見圖1D），說明提取物中含有大量外泌體顆粒。

2.3 血漿及血漿外泌體α-syn 的比較 使用ELISA 法檢測血漿外泌體中α-syn 的含量，結果顯示3 組血漿外泌體α-syn 存在差異（P=0.001），iRBD 組和PD-nRBD 組血漿外泌體α-syn分別高于HC 組（P=0.010，P=0.007），PD-nRBD 組與iRBD 組間無明顯差異（P＞0.05）（見圖2）。

圖2 ELISA法檢測血漿及血漿外泌體中α-syn含量

2.4 iRBD、PD-nRBD 組血漿外泌體α-syn 與臨床量表評分的相關性分析 見表2，結果顯示：iRBD組血漿外泌體α-syn 與RBDQ-HK 呈正相關（r=0.842，P=0.000 1）（見圖3A）；PD-nRBD 組血漿外泌體α-syn 水平分別與UPDRS Ⅲ評分和H-Y 分期正相關（r=0.817，P=0.000 1；r=0.592，P=0.005）（見圖3B，3C）。

圖3 血漿外泌體α-syn與PD-nRBD、iRBD臨床資料的相關性分析

表2 血漿外泌體α-syn與PD-nRBD、iRBD臨床資料的相關性分析

3 討 論

iRBD是指患者在快速眼動睡眠期出現與夢境相關的異常行為［1］；多導睡眠監測顯示患者在REM睡眠期出現失張力障礙［12］?？v向研究發現90%以上的iRBD歷經10年后發展成了α-突觸核蛋白?。?3］，PD是α-突觸核蛋白病中發病率最高的神經變性病之一，RBD 是PD 的非運動癥狀［14］，又被稱為PD 的臨床前期，尋找iRBD轉化的早期生物學指標可為PD的干預提供廣闊的窗口。外泌體是中樞與外周對話的重要信使，可攜帶大量的中樞信息穿過血腦屏障；研究證明部分血漿外泌體α-syn來源于中樞神經系統［9］，并發現PD血漿神經元外泌體增加［10，15］，α-syn通過外泌體傳遞是PD發病機制的重要環節［16］。因此推測未來轉化的iRBD血漿外泌體也存在α-syn聚集。

我們的行為學結果顯示：iRBD 患者夜間夢境及異常，明顯高于PD-nRBD 患者和正常人群，3 組UPDRS Ⅲ評分具有統計學差異，且存在組間差異，其中PD-nRBD 評分最高，HC 評分最低。說明iRBD組夜間運動癥狀最顯著，而日間運動損害較PDnRBD低。

iRBD、PD-nRBD 組血漿外泌體α-syn 分別較HC組升高。既往研究發現PD 血漿外泌體α-syn 較HC升高［17-21］，與我們的研究結果一致。另一項研究報告PD 血漿神經元外泌體α-syn 降低，并認為外泌體在中樞神經系統中發揮保護/危害雙重作用，黑質紋狀體的星形膠質細胞分泌的外泌體對PD 具有神經保護作用［22，23］，外泌體也具有觸發、加速靶細胞α-syn寡聚［24，25］，而加劇細胞的損害。

有關iRBD 外泌體α-syn的報道較少，結果不一。Zhao等人［26］的研究報告與我們的結果一致，即iRBD血漿外泌體中α-syn較HC組升高；也有不同的報告：iRBD 與HC 的血漿外泌體α-syn水平無差異［15］，但血漿神經元外泌體α-syn 升高［10，15］。我們的結果未發現iRBD 與PD-nRBD 患者血漿外泌體α-syn 存在差異，但有研究發現PD 血漿外泌體α-syn 較iRBD 組升高［27］。這可能與受試者入選排除標準不同以及病程不同有關。我們的結果提示iRBD 患者血漿外泌體存在α-syn，說明了iRBD 存在α-syn 的病理損害；其含量較PD-nRBD 偏低，但無統計學差異，說明iRBD的α-syn 病理損害類似于PD-nRBD，也提供了iRBD是PD臨床前期的病理證據。

我們的相關分析顯示：PD-nRBD 血漿外泌體α-syn 與UPDRS Ⅲ評分和H-Y 分期正相關，進一步說明了血漿外泌體α-syn 的含量與疾病的運動損害程度顯著相關［9，15，28，29］；一項縱向研究表明晚期PD患者較早期PD 患者血漿外泌體α-syn 增高［15］，說明了PD 越嚴重α-syn 越多。iRBD 特征性表現是夜間REM 睡眠期與夢境相關的異常行為，RBDQ-HK 可主觀評估iRBD 患者夜間夢境及異常運動情況，我們的結果顯示：iRBD 的血漿泌體α-syn 的含量與RBDQ-HK 正相關，說明α-syn 越多夢境相關的異常行為越嚴重。Yan 等人［27］發現iRBD 患者血漿神經元外泌體α-syn與病程相關，夢境相關的異常行為隨病程的延長而更加明顯，間接支持了我們的相關結果。進一步說明iRBD 夢境相關的異常行為的病理生理機制與α-syn沉積有關。

綜上所述，血漿外泌體α-syn 有望成為iRBD 轉化的早期生物標記物，也可作為PD、iRBD 疾病監測的評價指標，同時可作為評估疾病運動損害的重要標志。我們的研究仍存在一些局限性，首先我們的樣本量較??；其次，RBD 是通過RBDQ-HK 進行的主觀評估，可能會影響入組患者的精準性；未來我們將繼續擴大樣本量并進行縱向研究，同時利用多導睡眠監測對RBD 進行的精準篩選，進一步探索血漿外泌體α-syn水平在iRBD向PD轉化過程中作用。

倫理學聲明：本研究獲得河南省人民醫院醫學倫理委員會（201715）批準。所有參與者或其監護人均簽署知情同意書。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：張新雨負責撰寫論文、研究過程的實施、統計學分析、繪制圖表、文獻收集、論文修改、擬定寫作思路；張婷婷、許鵬飛、王升輝、周瑤、白瑩瑩負責數據收集、實驗操作；張紅菊負責指導撰寫文章并最后定稿。