蘿卜泡菜母水中乳酸菌分離鑒定與發(fā)酵特性比較

胡此海,楊絮,郭全友*,李保國,鄭堯,黃海潮,范逸文

1(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 東海水產(chǎn)研究所,上海,200090)2(上海理工大學(xué) 健康科學(xué)與工程學(xué)院,上海,200093)

泡菜是中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品,是將蔬菜浸泡在質(zhì)量分數(shù)6%～8%的鹽溶液中,在密閉環(huán)境中自然發(fā)酵數(shù)天所得,因其質(zhì)地爽脆、香氣宜人和健康益處而深受消費者歡迎,被譽為“國粹”[1-2]。泡菜主要通過乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸降低pH值,與食鹽的高滲透壓共同抑制有害微生物的生長繁殖。

目前,在泡菜中已經(jīng)鑒定和報道了幾十種乳酸菌,主要為乳酸桿菌、魏斯氏菌、腸球菌和片球菌等菌屬[3-4]。乳酸菌通常被認為是安全的微生物,無論是天然存在菌群,還是添加直投式發(fā)酵劑,都在食品發(fā)酵和保存中發(fā)揮著重要作用[5]。泡菜微生物的研究主要集中在縮短泡菜成熟期[6],減少亞硝酸鹽[7-8],延長保質(zhì)期,抑制致病菌[9-10],實現(xiàn)功能特性,改善感官質(zhì)量[11]。母水發(fā)酵泡菜中丙二醇、甘油、甘露醇、乳酸和草酸等含量較高,且氨基酸種類更豐富,比自然發(fā)酵和接種發(fā)酵具有更好的風(fēng)味和口感[12]。因泡菜母水中含有豐富的微生物,這些微生物是多輪使用后重新選擇出來的,具有更好的發(fā)酵性能。接種發(fā)酵可縮短泡菜發(fā)酵周期、降低亞硝酸鹽含量,但是發(fā)酵風(fēng)味欠缺。已有文獻在篩選優(yōu)勢發(fā)酵菌株時缺乏對菌株產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)的研究[6-8]。頂空-氣相色譜-離子遷移譜(headspace gas chromatography-ion mobility spectroscopy,HS-GC-IMS)可以提高風(fēng)味檢測的準(zhǔn)確性和靈敏度,有效解決GC-MS分析速度慢和前處理導(dǎo)致?lián)]發(fā)性物質(zhì)損失的問題[13]。近年來,GC-IMS已廣泛應(yīng)用于食品風(fēng)味分析和質(zhì)量檢驗等許多領(lǐng)域[14-15]。

本課題組前期利用高通量測序技術(shù)對傳統(tǒng)發(fā)酵四川泡菜母水中的優(yōu)勢微生物群落進行了研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬和片球菌屬是泡菜中的優(yōu)勢微生物。本研究從四川傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜母水中分離純化出來的乳酸菌株中篩選出優(yōu)勢菌株,并探究其生長性能、產(chǎn)酸能力、耐鹽能力、耐亞硝酸及發(fā)酵產(chǎn)香的能力,以篩選出有可能用于泡菜發(fā)酵的乳酸菌,為其工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用菌株均分離自四川成都傳統(tǒng)發(fā)酵風(fēng)味較好的蘿卜泡菜母水,蘿卜泡菜母水信息見表1。類腸膜魏斯氏菌(Weissellaparamesenteroides)CICC 24392購買于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection,CICC),作為標(biāo)準(zhǔn)菌株W0。

MRS瓊脂培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基、細菌 DNA 試劑盒,北京索萊寶公司;NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液,上海麥克林生化科技有限公司;酚酞、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、NaNO2等化學(xué)試劑,國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BX53光學(xué)顯微鏡,日本奧林巴斯株式會社;Bioscreen C微生物生長曲線分析儀,芬蘭Bioscreen公司;PHSJ-3F pH計,上海雷磁儀器廠;UV9100紫外可見光分光光度計, 北京萊伯泰科有限公司;FlavourSpecc?氣相色譜-離子遷移譜聯(lián)用儀,德國G.A.S.公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株的分離純化

取泡菜母水加入到MRS肉湯培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h進行富集。取菌株富集液10 mL于無菌錐形瓶中,加入90 mL生理鹽水,振蕩混勻后,進行梯度稀釋,吸取100 μL涂布于含有CaCO3的MRS培養(yǎng)基平板上,37 ℃培養(yǎng)48 h。挑取有溶鈣圈的菌株多次劃線純化,按照菌落形態(tài)學(xué)進行分類,三代劃線分離后得到純菌株[16]。經(jīng)生理生化實驗,篩選出過氧化酶實驗、吲哚實驗、硫化氫實驗均為陰性的革蘭氏陽性菌株,4 ℃保藏待用。

1.3.2 16S rDNA分子鑒定

使用細菌基因組DNA提取試劑盒,按照說明書進行操作。使用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行PCR擴增。PCR擴增條件:35個循環(huán)(94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min),72 ℃末端延伸10 min,終止反應(yīng)(4 ℃,∞)。吸取10 μL的PCR產(chǎn)物,加入2 μL 6×Loading Buffer混勻進行2%(質(zhì)量分數(shù))瓊脂糖凝膠電泳,將出現(xiàn)目標(biāo)條帶的PCR樣品純化后送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行16S rDNA測序。測序結(jié)果提交至GenBank數(shù)據(jù)庫中,利用BLAST比對并進行序列同源性分析,構(gòu)建發(fā)育樹(MEGA 11軟件)。

1.3.3 發(fā)酵特性

1.3.3.1 菌株生長曲線

將活化菌株接種無菌微孔板中每孔加入180 μL MRS肉湯培養(yǎng)基,取106CFU/mL菌懸液20 μL接種至孔中并吹打混勻,每株菌平行5次實驗,無菌MRS肉湯作為對照。將微孔板放入微生物生長測定儀中37 ℃靜置培養(yǎng),每1 h測定其OD600nm值,測量前振蕩60 s使菌體懸浮。Gompertz模型擬合按參考文獻[17]方法。

1.3.3.2 產(chǎn)酸性能測定

將活化菌株以體積分數(shù)為2%的接種量接種于MRS肉湯中,37 ℃培養(yǎng)72 h。間隔一定時間采用pH計測定發(fā)酵液pH值,總酸含量測定按照GB 12456—2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總酸的測定》。

1.3.4 耐受性實驗

參考FESSARD等[18]的方法并修改,耐受性實驗結(jié)果以lg (OD24/OD0)表示:+++表示lg (OD24/OD0)>0.5為高速增長;++ 表示0.3

1.3.4.1 耐鹽能力測定

將活化菌株以體積分數(shù)為2%的接種量,接入含有2%、4%、6%、8%、10%、12%(質(zhì)量分數(shù),下同)NaCl的MRS肉湯中,加入到無菌微孔板中,每孔300 μL,無菌MRS肉湯作為對照,將微孔板放入微生物生長測定儀中37 ℃靜置培養(yǎng),測量前振蕩60 s,測定0和24 h的OD600nm值。

1.3.4.2 耐亞硝酸鹽能力測定

將活化菌株以體積分數(shù)為2%的接種量,接入含有5、10、15、20、25、30 mg/L NaNO2的MRS肉湯中,加入無菌微孔板中每孔300 μL,無菌MRS肉湯作為對照,將微孔板放入微生物生長測定儀中37 ℃靜置培養(yǎng),測量前振蕩60 s,測定0和24 h的OD600nm值。

1.3.5 降解亞硝酸鹽能力測定

將活化菌株以體積分數(shù)為2% 的接種量,接種到含有200 mg/L NaNO2的MRS肉湯中,在37 ℃下培養(yǎng)48 h后,發(fā)酵液待測。

按照 GB /T 5009.33—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中的分光光度法測定并繪制亞硝酸鹽含量標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算亞硝酸鹽含量。

參考熊蝶等[19]的方法,亞硝酸鹽降解率按公式(1)計算:

(1)

式中:X,亞硝酸鹽的降解率,%;m1,菌株發(fā)酵48 h后培養(yǎng)基中NaNO2的質(zhì)量,mg;m0,初始培養(yǎng)基中的NaNO2的質(zhì)量,mg。

1.3.6 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測定

將菌株以體積分數(shù)為2%的接種量接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h,以8 000 r/min離心2 min,取上清液待測[20]。利用GC-IMS檢測菌株發(fā)酵后產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[21]。

自動進樣條件:準(zhǔn)確吸取1 mL樣品置于20 mL頂空瓶中,孵育溫度40 ℃,孵化轉(zhuǎn)速500 r/min,孵育時間15 min,采用頂空自動進樣的方式,進樣量500 μL,進樣針溫度65 ℃,不分流模式進樣。

GC條件:采用強極性色譜柱MXT-WAX(30 m×0.53 mm, 1 μm),柱溫60 ℃,載氣N2(≥99.999%),載氣的流速程序:起始流速2 mL/min,保持2 min,8 min內(nèi)升至10 mL/min,然后10 min內(nèi)升至100 mL/min并保持10 min,運行時間30 min。遷移管溫度45 ℃,分析時間30 min。

數(shù)據(jù)分析:使用HS-GC-IMS儀器內(nèi)置的NIST數(shù)據(jù)庫和IMS數(shù)據(jù)庫對揮發(fā)性化合物進行定性分析,運用Gallery Plot插件生成指紋圖譜。采用半定量的方法計算各揮發(fā)性物質(zhì)相對占比。

1.4 統(tǒng)計分析

實驗重復(fù)測定3次,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。通過統(tǒng)計軟件SPSS 26中進行方差分析及顯著性分析(置信區(qū)間為95%),利用Origin 2022b軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌分離純化與初篩結(jié)果

從5種泡菜母水中共分離出36株菌株。通過含有CaCO3的MRS 固體培養(yǎng)基對富集液中的菌株進行初篩,挑取有溶鈣圈的菌株多次劃線純化,以篩選疑似乳酸菌。對疑似菌株進行形態(tài)學(xué)分類,革蘭氏染色及部分生理生化實驗,結(jié)果見表2。共發(fā)現(xiàn)過氧化氫酶實驗、吲哚實驗、H2S實驗均為陰性和革蘭氏陽性菌株30株,初步鑒定為乳酸菌,編號為L1～L30。乳酸菌初篩分為5個類別,每種取代表性菌株進行分析,其中1種球菌和4種桿菌。

2.2 菌株的16S rDNA鑒定結(jié)果

將5株代表性菌株的16S rDNA部分基因序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST同源性比對,選取相似性高于99%的菌株序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖1)。由圖1可知,L2、L3、L7、L15和L24分別與布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、植物乳植桿菌(Lactiplantibacillusplantarun)和鼠李糖乳酪桿菌(Lacticaseibacillusrhamnosus)的親緣關(guān)系最近。

2.3 乳酸菌生長能力與產(chǎn)酸能力

為了直觀評價5株目標(biāo)乳酸菌的發(fā)酵性能,選擇中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心中推薦的傳統(tǒng)泡菜發(fā)酵菌種類腸膜魏斯氏菌作為對照菌株,編號為W0。由圖2-a可知,W0和L15菌株對數(shù)期為0～10 h,在10 h后進入穩(wěn)定期;L7和L15對數(shù)期為0～15 h,在15 h后進入穩(wěn)定期;L2和L3對數(shù)期為0～21 h,在21 h后進入穩(wěn)定期。在達到穩(wěn)定期后,5株目標(biāo)菌株的OD值均高于標(biāo)準(zhǔn)菌株W0,其中L15和L24的OD值較高分別為1.5和1.8。通過修正Gompertz模型進行擬合,結(jié)果見圖2-b。L15和L24的最大比生長速率最高可達0.07 h-1左右,但L24有較長的遲滯期(3.04 h)。L15的遲滯期為1.32 h,比W0的遲滯期(1.18 h)長,但顯著短于其余菌株(P<0.05)。因此,5株乳酸菌生長能力均較好,L15和L24具有最大生長比速率和較短遲滯期,更適合作為泡菜發(fā)酵菌株。

a-生長曲線;b-模型擬合

乳酸菌可以利用碳水化合物產(chǎn)生乳酸等有機酸,帶來泡菜獨特的酸爽風(fēng)味,并使pH值快速下降,從而達到抑制有害微生物的作用[22]。從圖3可看出,菌株處于生長對數(shù)期時,微生物含量不斷增加,并持續(xù)產(chǎn)酸,使總酸含量快速增加,pH值持續(xù)下降。乳酸菌生長進入穩(wěn)定期后,pH值趨于平緩。L7、L15和L24產(chǎn)酸能力較強,發(fā)酵至48 h時pH 值降至3.75,產(chǎn)總酸在72 h后可達到2.00 g/100 mL;L2和L3與W0產(chǎn)酸能力接近,pH發(fā)酵至穩(wěn)定期時pH值降至4.20,但因它們生長速率慢于W0,產(chǎn)酸速率也較慢。結(jié)果表明,L7、L15和L24具有較強的產(chǎn)酸能力,其中L24產(chǎn)酸能力最強,可能因為生長速度較快,這有利于乳酸等有機酸的快速積累,以抑制有害微生物生長繁殖。ZHU等[23]利用高通量測序手段從多種傳統(tǒng)發(fā)酵食品中篩選一批產(chǎn)酸菌株,發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳酪桿菌產(chǎn)酸能力較好,與本研究結(jié)果一致。

a-pH值;b-總酸含量

圖4 GC-IMS指紋圖譜

2.4 乳酸菌耐受性

2.4.1 耐鹽能力

鹽含量使泡菜具有較高的滲透壓,抑制腐敗菌的生長,有利于泡菜的保存,因此發(fā)酵菌株對鹽含量的耐受性非常重要[24-25]。由表3可知,隨著鹽含量的不斷升高,各菌株生長速度也隨之減少。菌株L15和L24的耐鹽能力較好,8%鹽含量時菌株生長速度可達到中等增長,但在10%和12%條件下,菌株耐受性能力開始顯著下降。L3在6%鹽含量時可以較好生長,但8%時增長速度顯著下降。L2和L7在6%鹽含量時生長狀態(tài)為低速增長,對鹽含量的耐受能力較差。W0的耐受性最差,在4%鹽含量時只能低速增長。目標(biāo)菌株具有較好的鹽含量耐受性,可能因為泡菜母水中高滲透壓環(huán)境的馴化。歐雪等[26]采用不同鹽含量(2%、5%、8%,質(zhì)量分數(shù))接種發(fā)酵泡菜,結(jié)果8%鹽含量的微生物生長較差且風(fēng)味較差,與本實驗研究結(jié)果一致。

表3 菌株對NaCl的耐受性

2.4.2 耐亞硝酸鹽能力

泡菜發(fā)酵過程中會產(chǎn)生亞硝酸鹽,因此泡菜發(fā)酵菌株需對亞硝酸鹽有一定耐受性。對不同菌株在5～30 mg/L的NaNO2耐受性進行研究,結(jié)果見表4。隨著亞硝酸鹽含量的增加,各菌株的生長量均無變化,可見各菌株對亞硝酸鹽均具有較好的耐受性。在同一濃度亞硝酸鹽的脅迫壓力下,只有L7菌株中速增長,與其他菌株的耐受性存在差異性。

表4 菌株對亞硝酸鹽的耐受性

表5 各菌株培養(yǎng)48 h后對NaNO2的降解率

2.5 降亞硝酸鹽能力

泡菜發(fā)酵過程中由于雜菌所含的硝酸還原酶導(dǎo)致亞硝酸鹽含量的增加[27],根據(jù)GB 2762—2022《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》對于蔬菜及其制品(腌漬蔬菜)的規(guī)定,亞硝酸鹽含量不得超過20 mg/kg,因此菌種對亞硝酸鹽的降解能力非常重要。實驗結(jié)果表明5株目標(biāo)菌株和1株對照菌株均具有較高的降解 NaNO2的能力,降解率都達到90.00%以上,其中L2和L3降解能力更強,與其余菌株存在顯著性差異(P<0.05)。

2.6 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測定

揮發(fā)性風(fēng)味是衡量泡菜品質(zhì)的一個重要指標(biāo),故研究泡菜發(fā)酵菌種產(chǎn)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)能力是篩選泡菜發(fā)酵菌種的重要指標(biāo)。通過 GC-IMS 技術(shù)在接種菌株培養(yǎng)48 h的發(fā)酵液中共定性了27種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)(包括單體和二聚體),其中酸類1種、醇類9種、酯類8種、酮類4種、醛類4種和其他物質(zhì)1種。為對比不同菌株發(fā)酵液產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)區(qū)別,采用Gallery Plot插件生成指紋圖譜。在指紋圖譜中,每一列代表同一揮發(fā)性有機物在不同樣品中的信號峰,每一行代表一個樣品中的全部揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。為了方便觀察比較,將變化規(guī)律相似的物質(zhì)排在一起比較。由圖5可知,5種目標(biāo)菌株都比對照菌株W0產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)種類更多。L2的特征揮發(fā)性物質(zhì)主要有乙酸乙酯二聚體、丙烯腈、乙酸和環(huán)己酮等物質(zhì),其中環(huán)己酮具有薄荷香氣。L3特征揮發(fā)性物質(zhì)是2-丁酮單體、叔丁醇、2-甲基丁醛二聚體、乙酸和乙偶姻等物質(zhì)。2-甲基丁醛二聚體和1-戊醇代表L7菌株發(fā)酵液的特征揮發(fā)性物質(zhì)。異戊烯醛、反-2-己烯醛、庚醛和甲酸乙酯單體是L15的特征風(fēng)味物質(zhì)。1-丁醇、乙酸異丙酯二聚體、甲酸乙酯二聚體、3-甲氧基-3-甲基丁醇、異丁醇、1-丙醇單體、乙酸丁酯是L24菌株發(fā)酵后所具有的特征揮發(fā)性物質(zhì)。丙酮、2-甲基丁醛單體、乙醇、乙酸乙酯單體、乙酸甲酯為6株菌株發(fā)酵所共有揮發(fā)性物質(zhì)。

為進一步研究6株菌株產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)的差異性,通過峰體積歸一化法對各樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的組成進行分析,詳細見電子增強出版附件(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035228)。從化合物類別來看,W0樣品中醛類物質(zhì)占比最高,具有水果特征香氣;L3樣品中酮類物質(zhì)占比最高,顯著高于其他樣品(P<0.05),可以產(chǎn)生薄荷香氣等刺激性氣味;L15樣品中醇類物質(zhì)占比最高,其中乙醇相對含量顯著高于其他組別(P<0.05);L24樣品中酯類物質(zhì)的占比最高,主要是乙酸丁酯、2-甲基丁酸甲酯和乙酸異戊酯的相對含量顯著高于其他組,酯類物質(zhì)提供香蕉、菠蘿蘋果等香氣。這表明菌株產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)的能力具有差異性。各菌株所產(chǎn)特征揮發(fā)性物質(zhì)也存在差異。W0可以產(chǎn)生更多2-甲基丁醛單體(9.23±0.10)%和丁酸乙酯(1.02±0.05)%,顯著高于其他組別,可以產(chǎn)生果子香氣;L2樣品中檢測到乙酸異丙酯單體含量高(1.46±0.09)%;L3菌株可以產(chǎn)生更多叔丁醇、環(huán)己酮和乙偶姻;L7菌株的1-戊烯-3-醇、丙烯腈和1-戊醇含量最高;L15菌株產(chǎn)1-丙醇、乙醇、1-丁醇、3-甲氧基-3-甲基丁醇、異丁醇、乙酸乙酯、乙酸甲酯、甲酸乙酯、乙酸異丙酯二聚體、2-丁酮的相對含量顯著高于其他菌株(P<0.05);L24菌株可以產(chǎn)生更多乙酸丁酯、2-甲基丁酸甲酯、1-丙硫醇單體、丙烯腈等物質(zhì),其中2-甲基丁酸甲酯相對含量為(16.06±1.23)%顯著高于其他菌株(P<0.05),具有青蘋果樣香氣。

3 結(jié)論

為豐富傳統(tǒng)四川泡菜發(fā)酵菌種庫,對四川成都地區(qū)泡菜發(fā)酵母水優(yōu)勢菌株篩選,分離得到30株菌,經(jīng)過16S rDNA序列同源性分析,得到2株布氏乳桿菌、1株短乳桿菌、7株乳酸片球菌、12株植物乳植桿菌和8株鼠李糖乳酪桿菌。進一步對5種乳酸菌生長曲線和產(chǎn)酸曲線測定以及對NaCl和亞硝酸鹽的耐受性實驗,與標(biāo)準(zhǔn)菌株W0進行對比。結(jié)果發(fā)現(xiàn),L7、L15和L24具有更好的生長繁殖和產(chǎn)酸能力;L3、L15和L24對NaCl的耐受性強,其中L24在10%(質(zhì)量分數(shù))NaCl還能保持低速增長;L7對亞硝酸鹽的耐受性較差與其他菌株存在顯著性差異;5株乳酸菌均具有90%以上的亞硝酸鹽降解能力。從菌株發(fā)酵液中共檢測出27種揮發(fā)性成分,其中L3樣品中酮類物質(zhì)含量最高;L15樣品中醇類物質(zhì)含量最高;L24樣品中酯類物質(zhì)的含量最高,主要是乙酸丁酯、2-甲基丁酸甲酯和乙酸異戊酯的相對含量顯著高于其他組,酯類物質(zhì)提供香蕉、菠蘿、蘋果等香氣。綜上所述, L15和L24具有良好的發(fā)酵特性和產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)種類豐富,L2和L3可以產(chǎn)較多酮類物質(zhì),L7可以產(chǎn)生較多的1-戊烯-3-醇和1-戊醇,因此5種乳酸菌具有發(fā)酵泡菜潛能,可作為發(fā)酵泡菜功能菌株資源。