甲狀腺乳頭狀癌中Cyclin D1、Ki-67表達和5項相關基因突變與遠處轉移的相關性研究

馮倩倩，王 也，王曉偉，徐晶晶，史艷芬，黃崎鑫，鐘定榮*

（1.中國醫學科學院北京協和醫學院研究生院，北京 100006；2.中日友好醫院病理科，北京 100029；3.中日友好醫院心臟科，北京 100029）

甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是甲狀腺癌最常見的病理類型，約占甲狀腺癌的70%～80%。雖然PTC 預后較好且相對惡性度低，但仍有約30%發生局部復發，5%發生遠處轉移[1]。一些研究推薦，對于存在PTC 復發風險因素（如腫瘤較大、甲狀腺外侵犯、淋巴結轉移、較小年齡和男性）的患者，應進行遠處轉移的篩查[2]。但許多沒有臨床復發風險特征的病例也可能出現局部復發或遠處轉移，因此尋找新的預測遠處轉移的指標具有重要意義。本研究中，我們比較了2 種生物標志物Cyclin D1、Ki-67 以及5種分子標志物在PTC遠處轉移與未轉移組織中的表達，以探討它們預測PTC遠處轉移的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 病例選擇

收集中日友好醫院2015年9月—2022年12月手術切除或局部病灶穿刺獲得的確診為轉移性PTC 的病例共18 例，發生遠處轉移的原發病灶直徑≥2cm；12 例來自肺，4 例來自骨，1 例來自腦，1例來自縱隔。其中男8 例，女10 例；年齡26～82歲，平均57.1±16.0 歲。對照組為中日友好醫院同期行甲狀腺切除術、確診為PTC 未發生轉移的病例25例，病灶直徑≥2cm。其中男9例，女16例；年齡20～66 歲，平均45.7±13.7 歲。所有病例的病理診斷均由2 位病理醫生進行獨立診斷。本研究獲中日友好醫院臨床研究倫理委員會批準（2023-KY-004）。

1.2 免疫組織化學檢測

1.2.1 試劑、儀器及操作步驟

Cyclin D1抗體購自福州邁新生物技術開發有限公司，Ki-67抗體購自北京中杉金橋公司。第二抗體使用全自動免疫組織化學染色儀配套試劑盒，購自德國Leica公司。儀器應用Leica全自動免疫組組織化學儀染色。操作步驟按說明書進行。

1.2.2 判斷標準

Cyclin D1 抗體的計分方法，在清晰背景下，出現黃色、棕色或褐色顆粒的細胞核染色視為陽性反應。我們根據陽性細胞百分比評定著色細胞的比例：無著色細胞得0 分，≤25%得1 分，26%～50%得2 分，51%～75%得3 分，＞75%得4 分。根據陽性細胞的著色特征評定染色強度：無著色得0分，淡黃色得1分，棕黃色得2分，棕褐色得3分。將染色強度與著色細胞比例的得分相加，總分＜5分定義為低表達組，≥5分定義為高表達組。

Ki67 按照陽性細胞百分比計分：著色細胞比例在0～3%，定義為低表達組；著色細胞比例≥3%，定義為高表達組。

1.3 分子檢測

1.3.1 主要試劑及儀器

每例選取樣本中腫瘤占比＞30%的蠟塊，連續切5～8 個10μm 蠟卷，直接封存于EP 管中行基因檢測。核酸提取試劑盒、人類KRAS/NRAS/BRAF基因及TERT/HRAS基因突變聯合檢測試劑盒，均購自廈門艾德生物醫藥科技股份有限公司，儀器應用ABI7500實時熒光定量PCR儀。

1.3.2 擴增程序及結果判讀

第一階段：95℃5min 1 個循環；第二階段：95℃25s，64℃20s，72℃20s，15 個循環；第三階段：93℃25s，60℃35s，72℃20s，31 個循環。信號收集：第三階段60℃時收集FAM 和HEX 信號，執行實時PCR，保存文件。結果判讀參照說明書判讀標準。

1.4 統計學方法

應用SPSS22.0 進行數據處理，計數資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，通過χ2值計算列聯系數進行相關性分析，以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 Cyclin D1 及Ki-67 在PTC 遠處轉移組和對照組的表達

Cyclin D1 及Ki-67 陽性染色均主要定位于細胞核（圖1～4，見封二）。表1 示，PTC 遠處轉移組和對照組中Cyclin D1高表達率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；2 組中Ki-67 高表達率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 PTC遠處轉移組和對照組Cyclin D1、Ki-67表達及相關基因突變情況n（%）

圖1 Cyclin D1 在甲狀腺乳頭狀癌遠處轉移組中高表達（EnVision 法，×400）。

圖2 Cyclin D1 在對照組中低表達（EnVision法，×400）。

圖3 Ki-67在甲狀腺乳頭狀癌遠處轉移組中高表達（EnVision法，×400）。

圖4 Ki-67在對照組中低表達（EnVision法，×400）。

2.2 5 基因（KRAS、NRAS、BRAF、TERT 和HRAS）在PTC遠處轉移組和對照組中的檢測結果

遠處轉移組患者中檢測到5 項甲狀腺癌相關基因突變15例次（圖5～7），其中BRAF V600E突變率55.6%（10/18），TERT突變率22.2%（4/18），NRAS突變率5.6%（1/18）；BRAF V600E和TERT啟動子共突變3 例，BRAF V600E、TERT 和NRAS 3 種基因同時突變1 例。TERT 及NRAS 突變均伴隨BRAF V600E突變，未檢測到KRAS、HRAS突變。

圖5～7 甲狀腺乳頭狀癌遠處轉移病例的基因突變擴增曲線

對照組25例患者中檢測到5項甲狀腺癌相關基因突變15例次，均為BRAF V600E基因突變，突變率60%，未檢測到KRAS、NRAS、TERT 和HRAS基因突變。表1 示，PTC 遠處轉移組TERT突變率22.2%（4/18）明顯高于對照組（0%），差異有統計學意義（P＜0.05）；BRAF V600E 和NRAS 突變率在2組間差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.3 PTC 遠處轉移病例Cyclin D1、Ki-67 表達與臨床特征及基因突變的關系

表2 示，PTC 遠處轉移組病例的BRAF V600E、TERT基因突變與Cyclin D1和Ki-67表達強度之間并無相關性（P＞0.05）。其臨床特征（性別、年齡）與Cyclin D1 和Ki-67 表達強度之間也無相關性（P＞0.05）。

表2 Cyclin D1、Ki-67表達與PTC遠處轉移病例臨床特征及BRAF V600E、TERT突變的關系n（%）

3 討論

3.1 Cyclin D1蛋白表達與PTC遠處轉移的關系

Motokura 等人[3]在甲狀旁腺腺瘤中首次發現了Cyclin D1 基因。該基因位于11q13 位置，全長120kb，有5 個外顯子和4 個內含子組成，編碼295個氨基酸殘基。進一步研究發現，Cyclin D1蛋白的過度表達可以推動細胞從G1 期進入S 期，引起細胞增殖，導致腫瘤的發生[4]。已有研究發現Cyclin D1 蛋白在PTC 中的表達明顯高于結節性甲狀腺腫，且與患者淋巴結轉移顯著相關[5]，這表明Cyclin D1 的高表達在PTC 的轉移和侵襲過程中發揮了關鍵作用。Lee 等[6]在PTC 中發現Cyclin D1 過度表達與腫瘤侵襲性、淋巴結轉移和細胞增殖密切相關；有研究[7]發現Cyclin D1 在PTC 中均有表達，但在有淋巴結轉移的PTC 患者中強陽性率為56.2%，在無淋巴結轉移的PTC 患者中強陽性率為25.0%。本研究中Cyclin D1 在PTC 遠處轉移組病例中以高表達為主，對照組中以低表達為主，2 組比較差異有統計學意義（P＜0.05），與以往的研究結果基本一致。因此，我們推斷Cyclin D1 高表達與PTC 遠處轉移的關系十分密切，臨床上可以通過檢測Cyclin D1 的蛋白表達，來預測PTC 是否更易發生遠處轉移、是否具有更高的侵襲性。

3.2 Ki-67蛋白表達與PTC遠處轉移的關系

Ki-67 作為一種重要的免疫組織化學標記物，其功能與有絲分裂密切相關，在細胞增殖中不可缺少，可以識別出G0期以外的G1、S、G2和M期的細胞，經常用于評估不同實體瘤發展過程中的細胞增殖指數[8]。Ki-67 的高表達與多種癌癥的侵襲性增加有關[9]。諸多文獻闡明Ki-67 的高表達與乳腺癌和前列腺癌的預后不良有關[10，11]。然而，目前對Ki-67 的高表達與甲狀腺癌之間的關系還沒有達成共識。Pan 和Guadagno 等[12，13]分別進行薈萃分析，他們發現Ki-67 高表達與患者年齡、腫瘤大小、淋巴結轉移、遠處轉移、甲狀腺外侵犯和TNM 分期顯著相關。此外，他們還證實，與Ki-67 低表達的患者相比，Ki-67 高表達的患者無病生存期更短，死亡風險更高。Pan 等[14]結合15項研究的數據總結Ki-67 的表達水平在大腫瘤（＞4cm）中高于小腫瘤（＜4cm）（合并OR=1.86）；Ki-67 的表達水平在陰性淋巴結轉移組低于陽性淋巴結轉移組（合并OR=2.49）。本研究發現Ki-67在PTC 遠處轉移組的表達高于PTC 未轉移組，2組比較差異有統計學意義（P＜0.05），與上述研究結果基本一致。可能是由于Ki-67 是與細胞增殖相關的核抗原，因此Ki-67 高表達可能代表PTC細胞增殖快、惡性度高、侵襲性更強。

3.3 基因突變與PTC遠處轉移的關系

BRAF V600E 和TERT 啟動子突變，已被證實與PTC的侵襲性及不良預后有關[15]。Yang等[16]研究發現，BRAF V600E 和TERT 啟動子突變共存與年齡、腫瘤大小、是否甲狀腺腺外侵犯、T 分期、AJCC 分期及腫瘤復發/遠處轉移顯著相關（P＜0.05）。在我們的18 例PTC 遠處轉移病例中，有3例檢測到了BRAF V600E 和TERT 啟動子共突變，1 例檢測到BRAF V600E、TERT 和NRAS 3 種基因同時突變。在對照組中沒有檢測到TERT 啟動子突變，這與以往的研究結果相符，進一步提示，當PTC 患者檢測出BRAF V600E 和TERT 啟動子共突變時，可能預示著更高的侵襲性和更易發生遠處轉移。另有研究顯示，Cyclin D1的表達強度在BRAF V600E 突變組中更強，呈現正相關[17]。我們的研究中沒有發現Cyclin D1 表達與BRAF V600E 和TERT 啟動子突變的相關性，可能與樣本量較少有關。

綜上所述，Cyclin D1、Ki67 的表達以及甲狀腺癌5 項基因的突變在PTC 發生遠處轉移及未發生遠處轉移患者中存在明顯的差異，這些指標對預測PTC患者是否發生遠處轉移有重要意義。