環(huán)狀RNA circ_0010423 在宮頸癌中的表達(dá)及臨床意義△

毛雪寶，王秀虹，邱彬，李美靈，馬丹，蔣金朋

咸寧市中心醫(yī)院（湖北科技學(xué)院附屬第一醫(yī)院）婦科，湖北咸寧 437100

當(dāng)前宮頸癌已被列為全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，在女性腫瘤死亡原因中居第四位[1]。流行病學(xué)資料顯示，約85%的宮頸癌發(fā)生在低收入地區(qū)和國家[2]。高危型人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)，約95%的腫瘤組織中已鑒定出HPV 基因組，其中HPVE7和E6基因整合到宿主基因組被認(rèn)為是宮頸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵步驟[3]。目前，接種HPV 疫苗是預(yù)防宮頸癌最直接有效的方法，但各國由于醫(yī)療負(fù)擔(dān)的不同尚未能實(shí)現(xiàn)有效推廣。宮頸癌早期臨床癥狀與宮頸炎十分相似，因而容易漏診，而當(dāng)確診時(shí)往往已處于中晚期，預(yù)后不佳[4]。因此，探究高靈敏度和特異度的無創(chuàng)生物標(biāo)志物對宮頸癌的早期篩查、診斷、治療和預(yù)后監(jiān)測具有重要意義。

環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是近年來發(fā)現(xiàn)的一類具有共價(jià)閉合環(huán)結(jié)構(gòu)的內(nèi)源性非編碼RNA，經(jīng)證實(shí)其在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中具有關(guān)鍵的調(diào)控作用[5]。circ_0010423 來源于親本基因磷酸酶張力蛋白同源物誘導(dǎo)激酶1（phosphatase and tensin homolog induced kinase 1，PINK1），位于人染色體chr1：20966384-20971165 區(qū)域，由其第3 和4 號(hào)外顯子頭尾剪接拼接形成，長度為284 bp。作為一種新的circRNA，目前尚無研究報(bào)道circ_0010423與宮頸癌的關(guān)系。研究組前期通過生物信息學(xué)分析基因表達(dá)綜合（Gene Expresion Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫中有關(guān)宮頸癌的circRNA 微陣列表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，circ_0010423 在宮頸癌中高表達(dá)。本研究驗(yàn)證circ_0010423 在宮頸癌中的表達(dá)水平，分析臨床意義，并探討其與宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系，以期為改善該病的診療提供相關(guān)理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2015 年1 月至2017 年12 月咸寧市中心醫(yī)院收治的宮頸癌患者的病歷資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理檢查證實(shí)為宮頸癌；術(shù)后隨訪依從性好；病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：其他部位腫瘤伴宮頸轉(zhuǎn)移；因嚴(yán)重肝、腎、心及肺功能不全，凝血功能障礙，血糖、血壓控制不良等無法耐受手術(shù)；嚴(yán)重精神障礙；無手術(shù)治療意愿。根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入180 例宮頸癌患者，年齡33～74 歲，平均（56.08±12.07）歲，＜60歲77例，≥60歲103例；腫瘤大小：＜4 cm 125 例，≥4 cm 55 例；組織學(xué)類型：鱗狀細(xì)胞癌148 例，腺癌32 例；分化程度：高分化140 例，低分化40 例；高危型HPV 感染：無115 例，有65 例；宮頸浸潤：＜2/3 53 例，≥2/3 127 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：無68例，有112 例；國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）分期：Ⅰ～Ⅱ期61例，Ⅲ～Ⅳ期119例；糖類抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）：＜35 U/ml 87 例，≥35 U/ml 93 例；鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen，SCC-Ag）：＜4 μg/L 46 例，≥4 μg/L 134例。取180 例宮頸癌患者的宮頸癌組織和癌旁組織。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，所有患者均知情同意。

1.2 檢測方法

1.2.1 離心吸附柱法提取樣本中總RNA 取出液氮中保存的組織塊10～20 mg，加入300 μl 裂解液（含β-巰基乙醇），剪碎組織塊并用研磨杵徹底研磨。加入590 μl ddH2O 和10 μl 蛋白酶K，56 ℃放置15 min，13 000 r/min 離心5 min，取上清。上清中加入0.5 倍體積的無水乙醇，混勻后置于吸附柱中，13 000 r/min 離心60 s。首先吸附柱中添加350 μl去蛋白液RW1，13 000 r/min 離心60 s。隨后吸附柱中添加80 μl 的DNase Ⅰ工作液，37 ℃放置15 min，并加入350 μl 去蛋白液RW1，13 000 r/min離心60 s。然后吸附柱中加入500 μl 漂洗液RW，37 ℃靜置2 min，13 000 r/min 離心60 s。最后將吸附柱轉(zhuǎn)入一個(gè)新的離心管中，加入50 μl ddH2O，37 ℃靜置2 min，13 000 r/min 離心2 min，即得到總RNA，并測定純度與濃度。

1.2.2 隨機(jī)引物法進(jìn)行互補(bǔ)DNA 合成 取微型離心管，依次加入1 μl 隨機(jī)引物（50 ng/μl）、1 μl dNTP mix（10 mmol/L）、2 μg 總RNA 以及適量ddH2O 至總體積為13 μl，充分混勻，65 ℃反應(yīng)5 min，然后放置冰上至少1 min。隨后向離心管中依次加入4 μl 5×SSIV Buffer、1 μl 100 mmol/L 二硫蘇糖醇、1 μl 核糖核酸酶抑制劑以及1 μl Super-Script?Ⅳ反轉(zhuǎn)錄酶（200 U/μl），充分混勻，23 ℃反應(yīng)10 min，53 ℃反應(yīng)10 min，80 ℃反應(yīng)10 min，即得到互補(bǔ)DNA，并放置-20 ℃保存。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（poIymerase chain reaction，PCR）法檢測circ_0010423、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metaIIoproteinase，MMP）2、MMP9mRNA 水平 取微型離心管，依次加入12.5 μl 2×TB Green Premix Ex Taq ⅡROX plus buffer、1 μl 上游引物（10 μmol/L）、1 μl 下游引物（10 μmol/L）、2 μl 互補(bǔ)DNA（＜100 ng）以及8.5 μl ddH2O至總體積為25 μl，充分混勻。95 ℃反應(yīng)30 s，一個(gè)循環(huán)；95 ℃反應(yīng)5 s，60 ℃反應(yīng)45 s，40 個(gè)循環(huán)；72 ℃反應(yīng)5 min，4 ℃反應(yīng)20 min，一個(gè)循環(huán)。引物由生工生物工程公司合成，circ_0010423 上游：5'-GTCGACTACCCTGATGTGCT-3'，下游：5'-GTAAGTGACTGCTCCATACTCC-3'；MMP2上游：5'-TACAGGATCATTGGCTACACACC-3'，下游：5'-GGTCACATCGCTCCAGACT-3'；MMP9上游：5'-TGTACCGCTATGGTTACACTCG- 3'，下游：5'-GGCAGGGACAGTTGCTTCT-3'；GAPDH上游：5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT- 3'，下游：5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。以GAPDH為內(nèi)參對照，并使用2-ΔΔCt法計(jì)算樣本中circ_0010423、MMP2及MMP9mRNA 表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，GraphPad Prism 5.0 軟件制圖。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier 生存曲線和Log-rank 檢驗(yàn)分析circ_0010423 表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系；采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析circ_0010423、CA125、SCC-Ag 檢測對宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與宮頸浸潤的診斷價(jià)值，并計(jì)算曲線下面積（area under the curve，AUC）；相關(guān)分析采用Pearson 相關(guān)性分析；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組織和癌旁組織中circ_0010423 表達(dá)水平的比較

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測結(jié)果顯示，宮頸癌組織中circ_0010423 表達(dá)水平為（0.611±0.154），明顯高于癌旁組織的（0.394±0.107），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=15.253，P＜0.01）。

2.2 不同臨床特征宮頸癌患者宮頸癌組織中circ_0010423 表達(dá)水平的比較

有高危型HPV 感染、宮頸浸潤≥2/3、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及FIGO 分期為Ⅲ～Ⅳ期的宮頸癌患者宮頸癌組織中circ_0010423 表達(dá)水平分別明顯高于無高危型HPV 感染、宮頸浸潤＜2/3、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及FIGO 分期為Ⅰ～Ⅱ期患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；不同年齡、腫瘤大小、分化程度、組織學(xué)類型及CA125、SCC-Ag 水平宮頸癌患者宮頸癌組織中circ_0010423 表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征宮頸癌患者宮頸癌組織中circ_0010423表達(dá)水平的比較

2.3 circ_0010423 表達(dá)與宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系

以腫瘤組織中circ_0010423 表達(dá)水平的均數(shù)（0.611）為界，將宮頸癌患者分為circ_0010423 高表達(dá)患者95 例與circ_0010423 低表達(dá)患者85 例。Kaplan-Meier 生存曲線分析結(jié)果顯示，circ_0010423 高表達(dá)患者5 年生存率明顯低于circ_0010423 低表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.493，P＜0.01）。（圖1）

圖1 circ_0010423高表達(dá)（n=95）與circ_0010423低表達(dá)（n=85）宮頸癌患者的生存曲線

2.4 宮頸癌組織中circ_0010423 與MMP2、MMP9表達(dá)的相關(guān)性

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測結(jié)果顯示，宮頸癌組織中MMP2、MMP9mRNA 表達(dá)水平分別為（1.03±0.18）、（4.62±0.80），分別明顯高于癌旁組織中的（0.34±0.09）、（1.55±0.23），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.290、21.584，P＜0.01）。宮頸癌組織中circ_0010423 與MMP2、MMP9的表達(dá)水平均呈正相關(guān)（r=0.703、0.855，P＜0.01）。

2.5 circ_0010423、CA125、SCC-Ag 檢測對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和宮頸浸潤的診斷價(jià)值

ROC 曲線分析結(jié)果顯示，circ_0010423 單獨(dú)檢測診斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和宮頸浸潤的AUC 大于CA125和SCC-Ag 單獨(dú)檢測，但三者聯(lián)合檢測時(shí)AUC 最大。（表2、表3）

表2 circ_0010423、CA125、SCC-Ag 單獨(dú)及聯(lián)合檢測對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷價(jià)值

表3 circ_0010423、CA125、SCC-Ag 單獨(dú)及聯(lián)合檢測對宮頸浸潤的診斷價(jià)值

3 討論

circRNA 是一類內(nèi)源性、保守的單鏈RNA，由于沒有5'帽和3'poly-A 尾結(jié)構(gòu)，使得其穩(wěn)定表達(dá)于各種組織和細(xì)胞外液中[6]。隨著高通量測序和生物信息學(xué)的發(fā)展，越來越多的circRNA 在各種物種、組織及細(xì)胞系中被鑒定出來[7]。目前一些circRNA 已被證明可參與腫瘤相關(guān)的生物學(xué)過程，包括增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移等[8-9]。例如，circ_P4HB 通過調(diào)節(jié)miRNA-1184/溶質(zhì)載體家族7成員 11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）通路保護(hù)肺腺癌免于鐵死亡并促進(jìn)惡性進(jìn)展[10]。circ_NFATC3 作為腫瘤抑制因子通過調(diào)節(jié)JUN 氨基末端激酶（JUN N-terminal kinase，JNK）、c-Jun、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）和雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）信號(hào)通路抑制肝細(xì)胞癌進(jìn)展[11]。此外，宮頸癌中circ_0000745 下調(diào)通過降低E-鈣黏蛋白表達(dá)來增強(qiáng)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的能力[12]，而circ_0087429 上調(diào)則可抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的能力[13]。因此，針對circRNA 作為腫瘤候選生物標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn)的研究具有十分廣闊的應(yīng)用前景和科學(xué)意義[14]。

本研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中circ_0010423 表達(dá)水平高于癌旁組織，與GSE169057 和GSE166466芯片報(bào)道結(jié)果一致。通過分析circ_0010423 表達(dá)與宮頸癌臨床特征之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，circ_0010423表達(dá)與高危型HPV 感染有關(guān)，提示circ_0010423 可能參與HPV 介導(dǎo)的宮頸癌致癌過程；circ_0010423表達(dá)與FIGO 分期有關(guān)，說明circ_0010423 可以影響宮頸癌進(jìn)展，與已發(fā)表的調(diào)控宮頸癌進(jìn)展相關(guān)的circRNA 具有相似性，如circ_ABCB10[15]、circ_0087429[13]、circ_CLK3[16]等；此外，circ_0010423 表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及宮頸浸潤有關(guān)，說明circ_0010423 可以影響宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移。MMP2 和MMP9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員，是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白水解酶，與宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中MMP2、MMP9mRNA表達(dá)水平均高于癌旁組織，該結(jié)果與既往文獻(xiàn)報(bào)道一致[18]。并且circ_0010423 與MMP2、MMP9表達(dá)水平均呈正相關(guān)，進(jìn)一步說明circ_0010423 可以調(diào)控宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移。以上證據(jù)表明，circ_0010423 在宮頸癌進(jìn)展中具有重要作用。

通過生存曲線分析circ_0010423 表達(dá)與宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，circ_0010423 高表達(dá)患者5 年生存率低于circ_0010423 低表達(dá)患者，說明circ_0010423 表達(dá)與預(yù)后有關(guān)，可以作為宮頸癌預(yù)后監(jiān)測的一個(gè)重要指標(biāo)。眾所周知，腫瘤預(yù)后與侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，高侵襲轉(zhuǎn)移患者往往預(yù)示預(yù)后不良。因此，早期監(jiān)測宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移從而合理制訂治療方案對提高患者預(yù)后具有重大意義。本研究通過ROC 曲線比較circ_0010423、CA125、SCC-Ag 檢測對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與宮頸浸潤的診斷價(jià)值發(fā)現(xiàn)，circ_0010423 單獨(dú)檢測對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和宮頸浸潤的診斷效能高于CA125 和SCC-Ag 單獨(dú)檢測，但三者聯(lián)合檢測時(shí)診斷效能最高，說明circ_0010423 聯(lián)合CA125 和SCC-Ag 是診斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與宮頸浸潤的潛在標(biāo)志物。

眾多研究表明，miRNA參與調(diào)控宮頸癌進(jìn)展，如miRNA-93-5p[19]、miRNA-18a[20]、miRNA-485-5p[21]及miRNA-132 等[22]。circRNA 可作為競爭性內(nèi)源性RNA調(diào)控miRNA表達(dá)從而影響腫瘤發(fā)生發(fā)展[23]。為了進(jìn)一步從分子機(jī)制層面解釋circ_0010423與宮頸癌進(jìn)展有關(guān)，研究組采用生物信息學(xué)工具（https://circinteractome.nia.nih.gov/mirna_target_sites.html）發(fā)現(xiàn)一批miRNA 可能受circ_0010423 調(diào)控，其中包括miRNA-1290、miRNA-149、miRNA-296-5p、miRNA-331-3p、miRNA-432、miRNA-503、miRNA-524-3p、miRNA-525-3p、miRNA-564、miRNA-589、miRNA-639 及miRNA-885-3p。這些miRNA 中miRNA-149[24]、miRNA-296-5p[25]、miRNA-331-3p[26]、miRNA-432[27]及miRNA-503[28]已被證實(shí)可以抑制宮頸癌進(jìn)展。據(jù)此推測，circ_0010423 可能通過調(diào)控上述miRNA 參與宮頸癌進(jìn)展，但仍有待細(xì)胞實(shí)驗(yàn)與動(dòng)物模型驗(yàn)證。

綜上所述，circ_0010423 在宮頸癌中表達(dá)上調(diào)，與高危型HPV 感染、宮頸浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FIGO分期及預(yù)后有關(guān)。circ_0010423 聯(lián)合CA125 和SCC-Ag 有作為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與宮頸浸潤診斷標(biāo)志物的潛力。