SiewertⅡ型食管胃結合部腺癌中TRIB3表達及預后分析

朱小娟 時振國 亢崇照 侯 鵬 葛東峰 趙芳宗 李丹丹 高社干

食管胃結合部腺癌(adenocarcinoma ofesophagogastric junction, AEG)是指腫瘤中心處于食管胃結合部上下5cm范圍內的腺癌,是一類比較特殊的疾病[1, 2]。AEG最常用的分型為Siewert分型,分別為3種類型:(1)Siewert Ⅰ型:腫瘤的中心位于食管胃結合部以上1～5cm距離,即食管下段腺癌。(2)Siewert Ⅱ型:腫瘤的中心位于食管胃結合部上1cm到下2cm的距離,即賁門癌。(3)Siewert Ⅲ型:腫瘤中心位于食管胃結合部下2～5cm的距離,即賁門下癌或胃底癌。其中,Siewert Ⅱ型在我國最常見,在全球癌癥相關死亡的主要原因中排名第4位,且大多數患者就診時已是局部晚期或出現全身性轉移,預后相對較差[3～6]。因此,早期診斷對于提高Siewert Ⅱ型AEG患者預后顯得尤為重要。

假激酶Tribbles同源物3(tribbles homology 3, TRIB3)作為一個新的內質網應激(endoplasmic reticulum stress, ERS)誘導基因,參與細胞代謝、應激反應、細胞存活、增殖和分化等多種生物過程的調節[7]。TRIB3可通過激活轉錄因子-4-同源蛋白(activating transcription factor 4-C/EBP homologous protein, ATF4-CHOP)通路誘導細胞凋亡,阻斷ATF4-CHOP途徑可降低TRIB3的表達[8]。研究發現,TRIB3的表達與管腔型乳腺癌患者的無病生存率增加和對治療的更好反應相關[9]。因此,TRIB3很有可能成為腫瘤治療的新靶點,而TRIB3在Siewert Ⅱ型AEG中的研究尚未見大量報道。本研究通過Western blot法及免疫組化法檢測TRIB3在Siewert Ⅱ型AEG與對應癌旁組織中的表達情況,并分析其與患者臨床病理參數及預后之間的關系,為Siewert Ⅱ型AEG的診斷、治療及預后判斷提供一定的理論基礎。

對象與方法

1.實驗對象:收集2010年1月～2013年12月于河南科技大學第一附屬醫院R0切除的Siewert Ⅱ型AEG術后的石蠟標本55例,其中男性44例,女性11例;患者年齡42～80歲,中位年齡63歲;參照美國癌癥聯合會(American Joint Committee on Cancer, AJCC)第8版的TNM分期標準:Ⅰ期5例,Ⅱ期11例,Ⅲ期39例;分化程度:高分化12例,中分化31例,低分化12例;組織學類型:潰瘍型35例,蕈傘型2例,隆起型7例,浸潤型11例;其中無淋巴結轉移13例,有淋巴結轉移42例。另隨機選取12例保存于-80℃冰箱的AEG癌組織及對應的癌旁組織用于Western blot法檢測。納入標準:①患者術前均行頭顱、頸胸腹盆CT或MRI掃描、全身骨掃描等檢查;②術前未行放、化療及其他針對腫瘤的治療;③均經術后病理確診;④臨床病理資料及隨訪數據完整。排除標準:①遠處轉移及合并較嚴重基礎疾病的患者;②臨床數據不完整。本研究經河南科技大學第一附屬醫院醫學倫理學委員會批準(倫理學審批號:2022-03-B125),該研究已征得患者或授權親屬知情同意。

2.主要試劑:兔抗人TRIB3多克隆抗體購自英國Abcam公司;SP試劑盒、枸櫞酸修復液、磷酸鹽緩沖液及二氨基聯苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色劑均購自福州邁新生物技術開發有限公司;二喹啉甲酸法(bicinchoninic acid,BCA)試劑盒和電化學發光(electrochemiluminescence,ECL)試劑盒均購自上海碧云天生物技術研究所,十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)所用溶液購自美國Sigma公司。

3.實驗方法:免疫組化采用SP法,具體實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。已知陽性切片作為陽性對照,磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對照。免疫組化的結果由兩名病理科醫生獨立閱片判定,每張切片觀察5個高倍鏡視野,TRIB3在腫瘤細胞中表達為棕黃色顆粒,主要定位于細胞質,偶見細胞核染色。按著色強度分為不著色、淡黃色、棕黃色及棕褐色,并分別記分為0、1、2、3分;觀察陽性細胞所占百分比,≤5%為0分,6%～25%為1分,26%～50%為2分,51%～75%為3分,76%～100%為4分。2項相乘所得分即為陽性等級:0～1分為陰性(-),2～4分為弱陽性(+),5～8分為陽性(++),9～12分為強陽性(+++)[10]。Western blot法檢測蛋白表達:取保存于-80℃冰箱的Siewert Ⅱ型AEG及癌旁組織提取蛋白,按BCA試劑盒進行蛋白質濃度測定。蛋白定量、變性后,在上樣孔內加入目的蛋白樣品和預染分子marker,電泳、轉膜,用5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉,加入兔抗人TRIB3多克隆抗體(1∶1000稀釋) 4℃孵育過夜,快速封閉緩沖液(Rapid Blocking Buffer (instant powder, TBST)洗膜;加二抗室溫孵育2h,用ECL化學發光試劑盒檢測,膠片顯影。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作為內參照,應用Image J灰度分析軟件對目的蛋白TRIB3和內參的條帶進行灰度分析、比較。重復測量3次,取平均值。

4.隨訪:通過門診復診和電話隨訪,隨訪時間截至2022年3月31日,患者總體生存期定義為從術后第1天開始到最后一次隨訪或任何原因造成的死亡。

結 果

1.Siewert Ⅱ型AEG及癌旁組織中TRIB3的表達:在免疫組化中,TRIB3在Siewert Ⅱ型AEG及癌旁組織中的表達主要定位在細胞質,偶見細胞核染色(圖1);其中,AEG中TRIB3表達的陽性率為27.3%(15/55),其中強陽性(+++)6例(10.9%),陽性(++)5例(9.1%),弱陽性(+)4例(7.3%),陰性(-)40例(72.7%),顯著低于癌旁組織的89.1%(49/55),差異有統計學意義(χ2=43.193,P<0.01),詳見圖1和圖2。Western blot法檢測結果顯示,TRIB3在Siewert Ⅱ型AEG組織中的表達明顯低于癌旁組織(P<0.01),詳見圖3和圖4。

圖1 TRIB3在Siewert Ⅱ型AEG及癌旁組織中的表達(SP法,×400)A.TRIB3在AEG癌組織中陰性;B.TRIB3在AEG癌組織中弱陽性;C.TRIB3在AEG癌組織中陽性;D.TRIB3在AEG癌組織中強陽性;E.TRIB3在AEG癌旁組織中陰性;F.TRIB3在AEG癌旁組織中弱陽性;G.TRIB3在AEG癌旁組織中陽性;H.TRIB3在AEG癌旁組織中強陽性

圖2 TRIB3在Siewert Ⅱ型AEG癌組織及癌旁組織中的表達

圖4 Western blot法檢測Siewert Ⅱ型AEG癌組織及癌旁組織中TRIB3的表達水平

2.Siewert Ⅱ型AEG患者臨床病理特征與TRIB3表達的關系:TRIB3在Siewert Ⅱ型AEG組織中的表達與AEG的分化程度、臨床TNM分期及淋巴結轉移均顯著相關(P<0.05),而與患者的年齡、性別及病理形態無關(P>0.05),詳見表1。

表1 Siewert Ⅱ型AEG癌組織中TRIB3的表達與臨床病理特征的關系[n(%)]

3.TRIB3表達與Siewert Ⅱ型AEG患者生存的關系:所有患者均完成隨訪,55例患者的中位隨訪時間為116(107,134)個月。Kaplan-Meier分析顯示,TRIB3表達陽性患者的5、10年總生存率分別為86.7%和71.5%;TRIB3陰性患者的5、10年總生存率分別為62.5%、28.6%,差異有統計學意義(χ2=7.177,P=0.007),詳見圖5。

圖5 TRIB3蛋白陰性和陽性SiewertⅡ型AEG患者生存曲線

4.Siewert Ⅱ型AEG患者TRIB3表達的預后分析:單因素(HR=0.290, 95%CI: 0.110～0.761,P=0.012)和多因素(HR=0.263, 95%CI: 0.091～0.758,P=0.013)COX回歸分析結果顯示,TRIB3的表達可作為SiewertⅡ型AEG患者預后判斷的重要指標,是影響AEG患者總體生存期的獨立危險因素,詳見表2。

表2 Siewert Ⅱ型AEG患者總體生存率的單因素和多因素COX回歸分析

討 論

近年來研究發現,腫瘤微環境內也存在ERS,TRIB3作為一種應激傳感器,可對各種腫瘤微環境或生態位豐富的應激源做出反應,包括氨基酸或葡萄糖缺乏、內質網中未折疊蛋白質積累和氧化損傷等[11～13]。研究表明,內質網相關基因TRIB3在ERS期間表達增加,其在神經元凋亡中起重要作用[14];同樣,在帕金森病(Parkinson′s disease, PD)中,TRIB3過度表達可以促進神經元死亡[15]。而Wu等[16]研究表明,下調TRIB3可以促進細胞死亡,TRIB3在細胞凋亡中起著抗凋亡的作用。因此,TRIB3失調與預后的好壞有關,當TRIB3與許多關鍵信號成分相互作用并調節其活性時,它可以以上下游依賴的方式作為腫瘤抑制基因或癌基因[17]。

目前,關于TRIB3在癌癥中的確切作用存在爭議。Lin等[18]研究證明,辣椒素通過上調癌細胞中TRIB3的表達促進細胞死亡。TRIB3的腫瘤抑制作用與ERS和Akt信號通路有關,TRIB3引起的磷酸化Akt減少,導致線粒體外膜Bax表達增強,從而進一步促進細胞凋亡[19]。而不同觀點的研究則表明,TRIB3在食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)組織和細胞系中過度表達,在ESCC組織活檢中,TRIB3高表達的患者生存率更差[20]。Yu等[21]研究證明,TRIB3的高表達與乳腺癌的發生、發展以及與乳腺癌患者的不良預后呈正相關。因此,TRIB3在腫瘤進展中可能為分化相關基因,在癌癥進展中的作用存在著特異性。

為更好地了解TRIB3在Siewert Ⅱ型AEG中的作用,本研究分別通過Western blot法和免疫組化法檢測TRIB3在Siewert Ⅱ型AEG中的表達,一致的結果顯示,TRIB3在Siewert Ⅱ型AEG中的表達水平顯著低于癌旁組織,這提示食管胃結合部黏膜在早期受到致癌因素的影響后,可能存在強烈的ERS,AEG中的TRIB3的表達缺失,可能促進了食管胃結合部黏膜的癌變及其腫瘤的發生、發展。由此可見,TRIB3可能在Siewert Ⅱ型AEG的形成階段發揮著重要的保護性作用。

此外,經過長期的隨訪,本研究分析了TRIB3與SiewertⅡ型AEG患者臨床病理參數及預后的關系,發現TRIB3的表達與腫瘤患者的TNM分期、分化程度及淋巴結轉移存在明顯的相關性,而與患者的病理形態、性別及年齡無關。生存分析發現,TRIB3陽性表達的患者總體生存期明顯優于陰性的患者。單因素COX回歸分析結果顯示,患者的TNM、分化程度等因素與其預后無關,分析其原因可能由于本研究納入的患者均為R0切除,從而導致由腫瘤分期、分化程度造成的個體化預后差異顯著下降。多因素COX回歸分析結果顯示,TRIB3可作為SiewertⅡ型AEG患者的獨立預測因子。因此,TRIB3表達陽性的患者有更低的死亡風險,而對于TRIB3表達缺失的患者需加強隨訪,以便及早發現腫瘤的進展,及時采取更加有效的治療,對改善SiewertⅡ型AEG患者的預后有重要意義。然而,本研究也有相應的局限性,主要是樣本量相對較小,下一步筆者團隊將增加樣本量,深入研究TRIB3在AEG中的作用機制,進一步明確TRIB3對Siewert Ⅱ型AEG的診斷和預后價值。

綜上所述,TRIB3有望成為Siewert Ⅱ型AEG的潛在靶點及預后判斷的重要生物學標志物。因此,深入研究TRIB3在AEG中的表達及機制,旨在為AEG提供新的治療方法。