NETosis調控心肌細胞自噬促進小鼠急性心肌梗死的作用機制研究

吳迦勒 徐精彩 周 佳 駱麗菊

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是由冠狀動脈主干或分支阻塞而引起的急性心肌缺血/梗死性疾病[1]。冠狀動脈的血流異常最終導致心肌細胞的不可逆性梗死[2]。目前認為,AMI的心肌損傷機制包括Na+、K+-ATPase的抑制和線粒體功能異常,通過降解作用破壞細胞膜的穩定性[3, 4]。越來越多的研究指出,發生缺血損傷時包括中性粒細胞、巨噬細胞等炎性細胞大量浸潤心臟組織,這提示抑制過度激活的炎性反應為AMI的防治提供了新的治療策略[5, 6]。

自噬(autophagy)是機體的重要代謝過程,參與保持組織功能和機體內環境穩態[7]。研究表明,針對自噬的調節為疾病的診治提供了重要的研究方向和理論依據[8]。對于自噬在AMI中的作用,目前普遍承認其作用的復雜性,基礎狀態下的自噬對維持正常的心臟功能和心肌生理活動發揮了至關重要的作用[9]。研究表明,過度激活的自噬可能會產生組織破壞作用,加重心肌缺血及缺血再灌注損傷,引起進一步的炎性細胞浸潤,加重心肌損傷[10]。發生AMI時,中性粒細胞大量浸潤心臟組織,引起繼發炎癥免疫級聯反應,加重缺血條件下的心肌細胞損傷[11]。活化的中性粒細胞可以釋放出非濃縮染色質形成網狀支架,對病原體進行包圍及限制,這一過程稱為中性粒細胞胞外陷阱相關死亡(NETosis)[12]。同時,NETosis可以促進血栓形成,進而引起動脈粥樣硬化、AMI等急慢性心血管事件的發生,這些研究提示了NETosis在心血管系統疾病防治中的重要作用[13]。但在AMI中,NETosis對心肌細胞作用的具體機制尚未闡明。此外,已有研究指出,NETosis和自噬作為兩種重要的細胞死亡方式有著緊密的聯系,提示NETosis可能通過調節心肌細胞自噬水平從而影響心肌細胞的病理生理功能[14]。因此,本研究主要探討小鼠AMI與中性粒細胞NETosis調控心肌細胞自噬的相關性,為AMI治療藥物的研發提供新的方向和理論依據。

材料與方法

1.實驗材料與試劑:8周齡C57BL/6小鼠購自杭州醫學院,脫氧核糖核酸酶Ⅰ(DNas Ⅰ)購自北京索萊寶科技有限公司,自噬誘導劑雷帕霉素(rapamycin,Rap)購自美國Med Chem Express公司,TTC染液(2%)購自北京索萊寶科技有限公司,LC3、Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62、cleaved caspase-3、caspase-3抗體購自美國Cell Signaling Technology公司,小鼠心肌肌鈣蛋白I(cTnI)、MPO-DNA、MPO、NE ELISA試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司,佛波酯(PMA)購自美國Med Chem Express公司,TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

2.小鼠AMI造模:將8周齡C57BL/6小鼠分為兩組,每組6只:假手術組和模型組,模型組通過冠狀動脈左前降支結扎法構建小鼠AMI模型,假手術組只開胸,不做冠狀動脈左前降支結扎處理。本研究通過筆者單位實驗動物倫理學委員會批準(倫理學審批號:ZJCLA-IACUC-20120004)。

3.TTC染色:結扎6h后取出心臟,通過TTC染色檢測小鼠心肌梗死面積。切取心臟切片,厚度為2mm,將切片放入2%TTC溶液中37℃避光水浴30min,每5min輕微晃動容器,使充分染色,取出心臟切片用PBS溶液洗滌3～5min,拍照后進行分析,檢測心肌梗死面積。

4.ELISA試劑盒檢測血清中cTnI水平:采血后4℃靜置3h后,3000r/min(離心半徑10cm)離心10min,取上清,通過ELISA試劑盒檢測血清中cTnI水平,具體實驗操作詳見試劑盒說明書。

5.TUNEL染色檢測心肌細胞凋亡:組織或細胞,經二甲苯、梯度乙醇、蒸餾水漂洗后,用Proteinase K工作液處理組織15min,加入含2% H2O2的PBS,室溫反應5min;3% H2O2處理20min,PBS洗滌3次;加入生物素標記液,37℃避光孵育60min,加標記反應終止液,室溫孵育10min;加Streptavidin-HRP工作液,室溫孵育30min,PBS洗滌3次,加DAB顯色液,室溫孵育20min,PBS洗滌3次;拍照后再用蘇木精或甲基綠復染,PBS洗滌3次,經脫水、透明、封片后,用光學顯微鏡觀察凋亡細胞并拍照。

6.Western blot法檢測自噬相關蛋白水平:取小鼠心臟提取總蛋白,BCA法測定蛋白總量;用12.5% SDS-PAGE丙烯酰胺凝膠進行電泳,80V 30min,120V 50min后,250mA轉膜80min,室溫下5%脫脂奶粉封閉2h,加入一抗4℃搖床孵育過夜,將一抗洗干凈后熒光二抗室溫避光孵育2h,將二抗洗干凈后進行曝光,檢測各組Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62、caspase-3及cleaved caspase-3蛋白水平。

7.小鼠原代心肌細胞提取:乳鼠心臟分離掉心房,放入含 4℃ PBS 的安瓿瓶中,清洗心臟至無血絲;將其移至錐形瓶中,加消化液后置于恒溫磁力攪拌器上(37℃,320r/min)進行消化;取上清液至5%的血清培養基中,放置37℃水浴鍋;加入消化液再次消化,上清液都加入至5%血清培養基中,直到心臟消化成白色絲狀,將消化下來的幾管細胞進行兩次過濾;過濾后離心棄上清,加入1ml紅細胞裂解液裂解 2min,加入培養基終止消化1200r/min(離心半徑8cm),5min進行離心,棄上清,加10%血清培養基吹勻并接種到大皿中,搖勻后放入培養箱中進行貼壁 1.5h,將大皿中的細胞吸到 50ml 離心管中,搖勻備用,留取部分細胞做心肌細胞鑒定。

8.細胞免疫熒光:心肌細胞爬片后用PBS洗3次,4%多聚甲醛固定15min,PBS洗3遍后用0.5% Triton X-100室溫通透20min,PBS洗凈后山羊血清封閉30min,隨后加入一抗α-SMA 4℃過夜,第2天PBS洗3次后加入熒光二抗,PBS洗3次,DAPI染核,加入抗熒光淬滅劑,熒光顯微鏡下觀察。

9.氧糖剝奪(oxygen glucose deprivation,OGD)構建心肌損傷體外模型:提取小鼠原代心肌細胞后,在OGD條件下培養24h構建心肌損傷模型,即使用不含血清和葡萄糖的培養基作為缺氧溶液,用氣體混合物(95% N2和 5% CO2)平衡低氧溶液使液體飽和 2h以上;接著,棄去心肌細胞的正常培養基,立即加入飽和的低氧溶液。隨后將心肌細胞置于 37℃ 的缺氧培養箱(95% N2和 5% CO2)中,在缺氧條件下培養 24h。

10.中性粒細胞提取:采集小鼠新鮮血液,EDTA抗凝處理,加入等體積的淋巴細胞分離液,500×g離心35min,離心后收集低帶中性粒細胞。

11.驗證NETosis對心肌細胞凋亡的影響:分別使用PMA(NETosis誘導劑)和(或)DNasⅠ(NETosis抑制劑)處理中性粒細胞,對照組使用正常培養基培養中性粒細胞,取上清液,ELISA檢測上清液中NETosis標志物MPO-DNA、MPO、NE水平。再取上清液處理OGD誘導的心肌細胞,并設置自噬誘導劑Rap處理組,TUNEL染色檢測心肌細胞凋亡,Western blot法檢測相關蛋白水平[15]。

結 果

1.小鼠AMI模型構建成功:通過小鼠結扎冠狀動脈左前降支來構建小鼠AMI模型。TTC染色顯示,與假手術組比較,模型組小鼠的心肌梗死面積顯著增加(圖1A)。同時,通過ELISA試劑盒檢測血清中cTnI水平,相較于假手術組,模型組小鼠血清中cTnI水平顯著升高(P<0.01,圖1B)。

2.小鼠AMI模型中心肌細胞凋亡增多、自噬水平顯著升高:對照組中有少量凋亡心肌細胞,模型組梗死區可見大量凋亡心肌細胞,較對照組明顯增多(圖2A)。通過Western blot法檢測心臟自噬相關蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62水平,Beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平顯著升高,p62蛋白水平顯著降低,差異有統計學意義(圖2B)。

3.原代心肌細胞鑒定:如圖3所示,體外提取的乳鼠原代心肌細胞經α-SMA染色后,在熒光顯微鏡下呈現綠色熒光,細胞核呈藍色(DAPI)。

圖3 原代心肌細胞鑒定(×400)

4.OGD處理的心肌細胞構建體外模型:相較于對照組,OGD條件下細胞凋亡水平顯著升高(圖4A)。Western blot法檢測caspase-3水平,結果顯示OGD誘導的心肌細胞中cleaved caspase-3 的表達水平也顯著升高(P<0.001,圖4B)。

圖4 OGD對心肌細胞的影響A.心肌細胞TUNEL染色檢測凋亡(×200);B.Western blot法檢測凋亡相關蛋白caspase-3、cleaved caspase-3表達水平

5.NETosis會促進OGD條件下心肌細胞凋亡:提取小鼠中性粒細胞,分別通過PMA(誘導NETosis)和(或)NETosis抑制劑DNas Ⅰ處理中性粒細胞,對照組使用正常培養基培養中性粒細胞,緊接著取上清液處理OGD誘導的心肌細胞。心肌細胞凋亡結果顯示,PMA+DNas Ⅰ組相較于單純PMA處理組,細胞凋亡水平顯著下降(圖5A)。同時,ELISA結果顯示,上清液中MPO-DNA、MPO、NE水平在PMA+DNas Ⅰ組被顯著抑制(圖5B),Beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平也在PMA+DNas Ⅰ組顯著降低,p62蛋白水平顯著升高(圖5C),表明NETosis會促進OGD條件下心肌細胞凋亡。

圖5 NETosis對OGD心肌細胞的影響A.心肌細胞TUNEL染色檢測凋亡(×200);B.ELISA檢測中性粒細胞上清液中MPO-DNA、MPO、NE水平;C.Western blot法檢測心肌細胞中自噬相關蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ、p62水平(*P<0.01,**P<0.001)

6.NETosis通過誘導自噬促進OGD條件下心肌細胞凋亡:在上述實驗條件的基礎上,給予心肌細胞自噬誘導劑Rap處理。相較于PMA+DNas Ⅰ組,Rap處理能夠增強Beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平,抑制p62水平(圖6A)。Rap處理也顯著逆轉了由PMA+DNas Ⅰ誘導的細胞凋亡降低(圖6B),上述結果表明NETosis可能通過誘導自噬而降低OGD條件下心肌細胞活力。

圖6NETosis對氧糖剝奪心肌細胞自噬和凋亡的影響A.Western blot法檢測自噬相關蛋白Beclin-1、LC3、p62水平(與OGD組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001);B.心肌細胞TUNEL染色檢測凋亡(×200)

討 論

AMI是由于心肌灌注不足導致心肌細胞大量、不可逆的損失,是全世界心血管疾病死亡的主要原因之一[16]。及時打開梗死相關動脈,恢復缺血心肌血供,挽救受傷心肌至關重要。研究顯示,過度激活的炎性反應可促進AMI的發展[17]。盡管進行積極治療,但 AMI 仍可發展為病理性心臟重塑和心力衰竭,因此應積極開發AMI的新型診療策略,改善AMI預后水平。

自噬參與保持組織功能和機體內環境穩態,但過度激活的自噬會導致心肌損傷加重[18, 19]。中性粒細胞是先天免疫系統中抵御病原體入侵的第一道防線[20]。但有研究表明,NETosis與心血管疾病如粥樣動脈硬化、AMI有關,會對心肌細胞造成損傷。NETs是糖尿病介導的動脈粥樣硬化的重要機制,在糖尿病狀態下,NETs 的產生顯著增加,通過直接破壞血管內皮細胞,促進先天性和適應性免疫細胞炎性反應,促進血栓形成參與糖尿病相關動脈粥樣硬化的發展;中性粒細胞會被無序地募集到組氨酸脫羧酶缺乏(Hdc-/-)小鼠心肌的缺血性損傷區域,此外,Hdc 缺乏會導致黏附減弱,遷移增強,并增加中性粒細胞中 ROS/NETs的產生, Hdc-/- 小鼠衍生的 NETs 促進心肌細胞死亡和心臟成纖維細胞增殖/遷移[21, 22]。而在AMI中,NETosis對心肌細胞的直接效應及其機制,尚未明確闡明。

NETosis和自噬作為兩種重要的細胞死亡方式有著緊密的聯系,這提示了NETosis可能通過調節心肌細胞自噬水平從而影響心肌細胞的病理生理功能[23, 24]。本研究發現,小鼠AMI模型中心肌細胞凋亡增多,自噬水平顯著升高。在OGD構建的心肌細胞損傷體外模型中,OGD條件下細胞凋亡水平顯著升高,并且OGD誘導的心肌細胞中cleaved caspase-3 的表達水平也顯著升高。同時,筆者發現NETosis會促進OGD條件下心肌細胞凋亡,而Rap處理逆轉了由PMA+DNas Ⅰ誘導的細胞凋亡降低,表明NETosis通過誘導自噬促進OGD條件下心肌細胞凋亡。

綜上所述,在小鼠AMI中,中性粒細胞NETosis通過調控心肌細胞自噬發揮促進小鼠AMI的作用。本研究利用體內小鼠AMI模型和體外心肌細胞損傷模型探究中性粒細胞對急性心肌梗死的作用,已得出初步結論,但其在人體中的作用機制仍需要開展臨床實驗予以進一步證實。