帕金森病的細胞治療

王雅倩 曹杜娟 劉曉蕾 張峻偉 王瑞鵬 閆衛紅

山西醫科大學第三醫院（山西白求恩醫院 山西醫學科學院 同濟山西醫院），山西 太原 030032

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是世界第二大常見的神經退行性疾病，影響全球約1%的老年人。由于人口老齡化加劇，給家庭和社會帶來巨大的經濟負擔。肌強直、運動遲緩、姿勢平衡障礙和震顫是其主要癥狀［1-2］。炎癥、氧化應激、興奮毒性、線粒體功能障礙、蛋白質清除障礙導致黑質致密部（substantia nigra pars compacta，SNpc）A9 多巴胺能（dopaminergic，DA）神經元變性［3-7］，這些致病因素的作用機制目前尚不清楚。PD 的病理標志是路易體的積累，由SNCA基因編碼的α-突觸核蛋白的錯誤折疊組成［8-9］。α-突觸核蛋白不僅與PD 的運動癥狀有關，也與自主神經功能障礙、睡眠障礙和神經精神癥狀（抑郁、精神病、幻覺）等非運動癥狀有關［10］。

常規治療是長期服用左旋多巴以改善癥狀，但這只在疾病早期有效，隨著時間的推移其有效性會降低，當左旋多巴被運到大腦的其他部位時會產生幻覺、認知障礙和運動障礙以及開-關波動等現象，影響患者的長期治療效果［11-12］。除藥物治療外，外科手術治療——深部腦刺激（deep brain stimulation，DBS）也可改善帕金森病患者運動與非運動癥狀［13-14］，但DBS 并不能徹底根治，且運用DBS 治療受以下因素限制：較高的成本，可能有更大的并發癥如手術后的抑郁和自殺，以及需要多學科和高度專業化的醫護人員進行圍手術期和術后管理［15-16］。開發PD新的治療制劑成為一項挑戰。由于PD 病理生理學靶點是SNpc多巴胺能神經元的退行性變性與丟失，細胞替代療法成為一種新的治療策略［17］。將源于供體組織或供體干細胞移植到SNpc 處可替代原有細胞產生多巴胺，逆轉神經缺損癥狀并恢復運動功能［18］。

1 胎兒腹側中腦（fetal ventral mesencephalon，fVM）同種異體移植物

20世紀70年代，瑞典的OLSON及其同事揭示了胎兒fVM 多巴胺能細胞存活和生長的最佳孕齡為6.5～9周，并且使用合適的組織和因子（如星形膠質細胞、成纖維細胞因子）的共移植來增強胎兒fVM的存活率［19］。20世紀80年代初的研究顯示，將fVM組織制成的細胞懸液移植入PD小鼠模型中，移植物不僅存活下來且能夠支配宿主紋狀體、接收傳入纖維、釋放多巴胺并逆轉運動功能缺陷［20］。1987年第一次對PD患者進行fVM組織移植，證實fVM移植細胞可在人腦中存活，并可恢復多巴胺水平，改善患者運動癥狀，術后10 a內使用正電子斷層發射掃描在紋狀體中監測到多巴胺，表明fVM 同種異體移植物對一些患者10 a 內有效［21］。因此，將胎兒fVM 同種異體移植到損傷的黑質紋狀體處可釋放多巴胺，具有長期治療效果和存活率，改善帕金森病患者生活質量。

并非所有的移植都有效，這可能與供體的胎齡、數量（每側1～7 個供體）、移植的靶部位（殼核、尾狀核）等有關［22-23］。移植物在移植數年后會產生相關不良反應，如移植導致的運動功能障礙［24］，一種可能是由于移植物中較高比例的5-羥色胺能神經元導致的運動障礙，因為5-羥色胺能末梢以不受調節的方式釋放多巴胺［25］；另一種可能是宿主對移植物產生了免疫排斥反應，損害了移植物的功能［26］。另外胎兒組織的獲取所涉及的倫理問題，進一步阻止將該方法標準化運用于臨床［27］。研究顯示一種可大規模運用于臨床的替代性組織—干細胞，具有自我更新和向多種細胞分化的潛能［28］。但胎兒fVM同種異體移植技術為后期干細胞治療帕金森病提供了理論依據和技術指導，作出了巨大的貢獻。

2 干細胞治療帕金森病的研究進展

干細胞存在于胚胎和成人細胞中，是人體的非特化細胞，具有分化為不同種類的細胞和自我更新的能力。按其分化潛能分為全能干細胞和多能干細胞［29］。干細胞主要有兩個來源：從胚泡的內細胞團中分離出的胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs），以及各種組織中的成體干細胞，如神經干細胞（neural stem cells，NSCs）和 間 充 質 干 細 胞（mesenchymal stem cells，MSCs），或通過重編程從成人體細胞獲得的誘導多功能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）和來自化學激活的未受精卵母細胞——人類孤雌生殖干細胞（human parthenogenetice stem cells，hPSCs）［30］。這些干細胞通過誘導可衍生成多巴胺能神經元，補充損傷部位的多巴胺，支配紋狀體神經元，恢復運動功能并改善非運動癥狀。本文簡述了ESCs、PECs、iPSCs 治療帕金森病的研究進展。

2.1 ESCs 衍生的神經祖細胞為行神經細胞再生治療，開發了一種從人類胚胎干細胞（human embryonic stem cells，hESCs）產生神經祖細胞的方法。ESCs是從胚胎發育囊胚期的內細胞團分離獲得到全能性細胞，具有很高的自我更新能力和潛在的分化能力，能夠分化為任何一種體細胞［31-32］。

1981 年小鼠ESCs 的分離和建立徹底改變了生物學研究，由于干細胞具有無限自我更新和產生任何身體細胞類型的能力，引起了研究者極大的興趣。THOMSON等［33］首次從人類胚泡中建立了hESC系，其能替代胎兒組織hESC系的建立推動細胞替代治療進入新的時代。NEETA 等［34］將sonic hedgehog（SHH）和成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）-8介導的胚胎干細胞誘導多巴胺能神經元形成過程中與端粒酶永生化的人胚胎中腦星形膠質細胞共同培養，實現了多巴胺能神經元的高效富集，將這些多巴胺能神經元移植到6-羥基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）損傷的大鼠中，發現其能顯著改善大鼠的運動功能。目前將ESCs 衍生的多巴胺能祖細胞移植入PD 患者紋狀體內的實驗（European clinical trial STEM-PDtrial）正在進行，此實驗避免了ESCs分化成不需要的細胞類型，并且可以將其冷凍保存，實現了臨床化細胞替代治療的廣泛性和實踐性。KIM等［35］將人類ESCs中產生的中腦多巴胺能神經元MSKDA01，移植到PD 患者的殼核中（ClinicalTrials.gov標識符：NCT 04802733），檢測到了多巴胺能神經元的存活。這些實驗結果表明使用ESCs 來源的神經祖細胞（neural progenitor cells,NPCs）的可行性。

從胎兒組織中收集未分化的胚胎干細胞，進行誘導分化形成NPCs，然后將其移植到黑質致密部，分化形成多巴胺能神經元，獲得大量干細胞衍生的多巴胺能神經元。ESCs 來源的細胞具有高再現性，為研究人類神經發育、細胞命運和神經疾病機制提供了新的模型并為再生醫學開辟了新的策略。但因神經祖細胞移植后產生的細胞種類范圍不確定且具有無限生長的致瘤性的特征，人胚胎干細胞神經化方案可能是反復無常的，需要延長體外培養時間，且需經過修飾（如使用生長因子或者模擬腹側中腦分化多巴胺的環境）才能獲得高數量的多巴胺能神經元［36］。

2.2 孤雌生殖干細胞（PSCs）人類孤雌生殖干細胞是通過抑制未受精的卵母細胞第二次減數分裂，產生只含有母體染色體的多能二倍體細胞系［37］，其是一種多能、自我更新的干細胞。2016年，澳洲開始了孤雌干細胞的Ⅰ期臨床試驗（ClinicalTrials.gov標識符：NCT 02452723）［38-39］。有幾項開放性臨床試驗測試hPESCs 在PD 患者中運用（ClinicalTrials.gov 標識符：NCT 02452723，NCT 03119636），但其存在的問題是，未受精卵本身的遺傳異常和hPESCs 來源的神經前體細胞能否在移植部位分化為多巴胺能神經元［40］。在使用孤雌生殖干細胞移植的試驗中，移植的神經干細胞仍不成熟，因為此干細胞會產生PAX6［41］，但真正的中腦多巴胺能神經元屬于PAX 6陰性腹側中腦神經祖細胞，不會表達PAX6。因此，表達PAX6陽性的孤雌生殖干細胞在移植后不會分化成真正的中腦多巴胺能神經元。即使一些移植的神經干細胞可能分化成為多巴胺能神經元，也只能是間腦多巴胺能神經元［42-43］。

2.3 iPSCs衍生的神經祖細胞誘導多能干細胞是運用無整合方法或使用蛋白質或化學化合物等重新編程的方法將體細胞轉化為胚胎干細胞［44］。這些體細胞可以是成纖維細胞、角質細胞、星形膠質細胞、人臍帶血或外周血中的單核細胞、腎小管上皮細胞等，幾乎任何體細胞都可以被重編程為多能干細胞，但目前最常用于重編程的細胞類型是皮膚成纖維細胞和血細胞［45-46］。2006 年YAMANAKA 等［47-48］利用四種轉錄因子（OCT4、SOX2、KLF4 和c-Myc）的雞尾酒，首次將皮膚成纖維細胞重新編程為多能干細胞，為其可持續來源打開了大門。HARGUS等［49］利用重編程技術把真皮成纖維細胞誘導形成iPSC，然后將其分化為多巴能神經元移植入未進行免疫的PD 大鼠模型中，16 周后發現了大量存活的無神經變性的多巴胺能神經元，大鼠運動功能顯著改善。YEFROYEV 等［50］將PD 恒河模型自體iPSC 衍生的多巴胺能神經元移植入自身大腦中，24 個月后觀察到其運動功能和精神障礙的緩解。2018 年京都大學iPSC 細胞研究和應用中心招募了第一批患者進行iPSC 衍生多巴胺能祖細胞移植試驗（臨床試驗：R 000038278），并運用了能分選多巴胺能祖細胞的方法：CORIN+法（一種多巴胺能祖神經元的標記），提高了移植過程的安全性和有效性。這項實驗將于2023年完成，將首次顯示PD患者使用iPSC誘導分化多巴胺能神經祖細胞移植的可行性［51］。

此方案的缺點是自體的iPSCs細胞保留著本身導致PD的遺傳變異因素，且iPSCs來源的某些體細胞具有表觀遺傳記憶（具有向來源組織偏向分化的能力），這種能力會影響iPSCs在體外分化的潛能，不同體細胞類型重新編程形成體細胞的效率也不一樣［45，53］，因此選擇合適的體細胞誘導分化為iPSCs 也是一個挑戰。此外移植位置和移植細胞的區域特性以及神經元的成熟階段將決定移植細胞在受損宿主腦回路中進行功能整合的能力，影響移植后的效果［54］。細胞在培養基中培養幾個月，才能產生遺傳修飾的iPSCs細胞系，文獻報道細胞培養時間的增加與基因組完整性的變異有關，如致癌基因的復制和其他核型異常［55］。但不可否認的是該方案為PD 患者提供了豐富的干細胞來源，為施行細胞替代療法提供了巨大的發展潛能，避免了胚胎組織移植的倫理問題。使用自身iPSCs 分化形成多巴胺能祖細胞進行自體移植消除了組織排斥風險［8］，是細胞替代療法治療帕金森病最有前景的一個策略。

3 結論

DBS由于術后管理問題和高昂的費用并不是治療PD最佳方案。胎兒中腦腹側組織作為PD的細胞替代療法，已具有大量證據基礎，但此策略的安全性和有效性以及涉及的倫理問題阻礙了該方案進展。ESCs 衍生細胞移植雖涉及較少倫理問題，但需嚴格的分化方法，才能避免形成不需要的細胞類型。未受精的生殖胚胎干細胞可獲取性大，實行臨床標準化細胞替代治療的可行性較前提升，但其本身所具有的遺傳變異因素尚未解決。使用iPSCs 誘導分化的多巴胺能祖細胞是PD 實行細胞治療并有廣闊前景的策略。

4 未來展望

改善帕金森病患者功能需要大量容易獲得且可以廣泛運用的多巴胺能神經元細胞。近年來通過不同方案獲得足夠的多巴胺能細胞方面已經取得了顯著的進展。使用細胞替代療法治療PD 開辟了新的可能性，但是PD 除了運動癥狀外還有非運動癥狀，這些非運動癥狀并不是細胞療法的目標，在未來的療法中也應考慮到。另外PD 的細胞替代療法存在移植物的潛在問題。多巴胺能神經元在移植后只有3%～20%的存活率，移植后局部微環境所產生的免疫反應和神經炎癥是干擾其存活的主要因素［25］。原始材料和最終結果基因測試等問題仍有待解決，如細胞核型分析、排除致瘤突變、防止神經過度生長，是否需要進行下一代基因測序分析，細胞移植后其長距離軸突生長、方向性以及神經再支配仍然是需要研究的問題［28，56］。但相信細胞移植能夠有效治療帕金森病，恢復受損的大腦結構，隨著科學技術的發展，終會將細胞移植帶來的不良反應降到最低。