N6-腺苷酸甲基化結合蛋白的遺傳變異與胃癌風險關聯分析

陸欣苑 馮延璐 李潔 許思易 李成云 劉桐 王新華 梁戈玉

1東南大學公共衛生學院，環境醫學工程教育部重點實驗室（南京 210009）；2蘭州大學公共衛生學院（蘭州 730000）；3甘肅省武威腫瘤醫院（甘肅武威 733000）

胃癌因其進展迅速，易向淋巴結轉移和遠端轉移，已經成為對人類健康最具威脅的惡性腫瘤之一。2020年全球癌癥報告數據指出，胃癌在癌癥中發病率和病死率高居第五和第四位［1］，嚴重危害人類健康。胃癌的發病復雜且多變，幽門螺旋桿菌感染、吸煙、飲酒、高鹽飲食等環境因素已經被報道與胃癌的發病相關［2］。此外，對胃癌病因深入研究發現，其發生發展與個體間存在的遺傳易感性差異相關［3］。因此，探索與胃癌發生發展相關的遺傳易感基因，能為胃癌的防治提供分子水平依據。

N6-腺苷酸甲基化（m6A）修飾是RNA轉錄后最廣泛的修飾類型，受甲基轉移酶（writers）、去甲基化酶（erasers）和甲基化結合蛋白（readers）調控［4］，廣泛參與調控各種生命進程［5］。YTH結構域家族蛋白1（YTHDF1）是一種m6A結合蛋白，能結合mRNA中終止密碼子區域周圍的m6A結合位點，并可招募多種翻譯起始復合物，提高目標RNA的翻譯的效率，是最重要的m6A結合蛋白之一［6-7］。異質核核糖核蛋白A2B1（HNRNPA2B1）是另一種m6A結合蛋白，能識別初級microRNA轉錄子集上的m6A修飾，從而介導m6A修飾對初級microRNA加工和替代拼接［8］。YTHDF1和HNRNPA2B1已被報道與包括胃癌在內的多種人類癌癥的發生發展密切相關，在多種惡性腫瘤中發揮癌基因或抑癌基因的作用［9］。

單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）是每100～300個堿基就可能發生一次的、人類最常見、最廣泛的可遺傳變異，分布于整個基因組，能揭示人種、人群及個體之間的遺傳差異［10］。全基因組關聯研究為探索胃癌病因提供了重要思路，并為胃癌病例確定了各種常見變異，其中大多數為SNPs［11］。

YTHDF1的功能性SNPs已經被報道與肝母細胞瘤、腎母細胞瘤和神經母細胞瘤等惡性腫瘤的發病風險和臨床進展相關［12-14］，可能成為腫瘤遺傳易感性的生物標志物。但目前鮮見研究探究YTHDF1 SNPs與胃癌發病風險和臨床進展的關聯。此外，尚未有研究發現HNRNPA2B1的功能性SNPs。因此，本研究在中國胃癌高發區——甘肅省武威市人群中，結合研究對象生活方式和臨床信息和，探索YTHDF1和HNRNPA2B1的SNPs與胃癌發生發展的關聯，為胃癌的預防和診斷提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象收集2016-2019年甘肅省武威腫瘤醫院的胃癌患者457例為病例組，納入標準：經組織學病理診斷確診患胃癌者。排除標準：（1）經診斷患其他惡性腫瘤；（2）經診斷患嚴重的消化道疾病者；（3）經診斷患包括嚴重心腦血管疾病在內的慢性疾病者。收集同期在該院進行健康體檢且年齡和性別匹配的健康人525 例為對照組。采集研究對象2 mL外周靜脈血于EDTA抗凝管，負80 ℃冰箱保存。收集研究對象的一般人口統計學資料、生活方式（吸煙、飲酒、飲茶、吃腌制食物和吃油炸食物）、腫瘤家族史以及臨床信息。其中生活方式各因素定義如下：吸煙為每天吸煙1支以上，累計6個月；飲酒為平均每周至少飲酒1次，累計6個月；飲茶為平均每周至少飲茶3次，累計6個月；吃腌制食品為平均每周至少吃腌制食品2次；吃油炸食品為平均每周至少吃油炸食品2次。本研究通過醫學倫理委員會批準（編號：2019ZDKYSB137）。

1.2 主要試劑與儀器TIANamp Blood DNA Kit提取試劑盒（中國天根生化科技有限公司），dNTP試劑盒（中國有漁生物科技有限公司），PCR引物由上海百力格生物技術有限公司設計合成。A-100 PCR儀（中國朗基科學儀器有限公司），Gene Amp PCR system 9600 PCR儀（美國Perkin Elmer公司），JY600+電泳儀（中國君意東方電泳設備有限公司），FR-200A全自動紫外與可見分析裝置（中國復日科技有限公司）。

1.3 研究方法

1.3.1 SNPs的篩選使用NCBI db數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/）篩選本研究納入的SNPs，篩選標準如下：（1）在中國漢族人群中最小等位基因頻率＞0.1，P（Hardy-Weinberg）＞0.05，基因呼叫率＞0.95，連鎖不平衡值r2＞0.8的SNPs位點；（2）使用GTEx（https：//www.gtexportal.org/）、HaploReg（http：//compbio.mit.edu/HaploReg）和RegulomeDB（https：//regulomedb.org/）等在線工具功能性SNPs分析軟件預測可能與胃癌發生發展相關的SNPs。最終，YTHDF1rs6011668、HNRNPA2B1 rs2070601和rs76558212這3個SNPs納入了本次研究。

1.3.2 全血基因組DNA提取應用TIANamp Blood DNA Kit試劑盒提取外周血基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳實驗鑒定DNA質量，負80 ℃冰箱保存。

1.3.3 基因分型本研究的SNPs基因分型應用了結合多重PCR 技術和高通量測序技術的Hi-SNP高通量基因分型法：針對檢測位點設計特異性引物，在單管內進行多重 PCR 擴增，不同的樣本以不同的 Barcode引物區分。建庫產物混合樣本后，在Illumina測序平臺上，對擴增子進行高通量測序。測序結果使用生物信息學方法區分不同的樣本，獲得所有候選SNPs的基因分型。使用Primer 3在線軟件（0.4.0版http：//frodo.wi.mit.edu/）設計多重 PCR的rs6011668的正向引物序列為5'-CTAAAGGAGAAAGACCTGGAATGG-3'，反向引物序列為5'-CAGTTTCCACCTCCTC CTG-3'；rs2070601的正向引物序列為5'-TTAAAAGTACATCAAGCCCAAGAC-3'，反向引物序列為5'-GGGGGTGTTCAGTAGTTTAATTTC-3'；rs76558212的正向引物序列為5'-CTATCCTTGGTAAACATTTGGTGG-3'，反向引物序列為5'-AAACTTTATCTTTTGGGCCAGTAG-3'。SNPs的基因分型由上海翼和應用生物技術有限公司完成。

1.4 統計學方法數據分析使用SPSS 22.0統計軟件。應用χ2檢驗分析對照組中YTHDF1rs6011668、HNRNPA2B1 rs2070601和rs76558212的基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律；應用兩獨立樣本t檢驗和χ2檢驗分別分析兩組之間定量和定性資料的分布差異；應用logistic回歸計算95%置信區間（confidence interval，CI）和比值比（odds ratio，OR），估計3個候選 SNPs與胃癌發病風險的關聯；使用單因素和多因素logistic回歸探究與胃癌發病風險密切相關的遺傳和環境因素，以回歸系數作為權重，對與胃癌相關的遺傳和環境因素加權后計算風險評分（risk score，RS），計算公式如下：

RS=β0 + ∑i=1kβiXi

其中，β0為常量，k為納入因素的個數，Xi為第i個研究因素，βi為logistic回歸得到的第i個因素的回歸系數。

使用RS評估胃癌發病風險，以四分位數將RS分為0（RS＜Q25），1（Q25 ≤ RS＜Q50），2（Q50 ≤ RS＜Q75），3（RS＞Q75），以0組作為參照組，使用logistic回歸計算其他組的95%CI和OR，探究RS與胃癌發病風險的關聯。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 研究對象特征本研究納入了總計982例研究對象，其中胃癌病例457例（胃腺癌447例），健康對照525例。病例組男性257例，女性200例；年齡范圍35～73歲，平均年齡（58.03 ± 6.95）歲；對照組男性278例，女性247 例；年齡范圍35～75歲，平均年齡（57.51 ± 5.74）歲。病例組和對照組之間，性別、年齡、吸煙、吃油炸食物和腫瘤家族史的分布差異均無統計學意義（P＞0.05），飲酒、飲茶和吃腌制食物的分布差異均有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 研究對象特征Tab.1 Characteristics of study participants 例（%）

2.2 候選 SNPs的基因分型和群體代表性分析YTHDF1 rs6011668基因分型為CC、TC和TT基因型；HNRNPA2B1 rs2070601基因分型為AA、AG和GG基因型；rs76558212基因分型為TT、TC和CC基因型。在對照組中，rs6011668、rs2070601和rs76558212的基因型符合Hardy-Weinberg平衡（均P＜0.05），該人群具有較好的群體代表性，見表2。

表2 對照組人群 Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗Tab.2 The Hardy-Weinberg equilibrium test for the controls

2.3 候選SNPs與胃癌發病風險的相關性分析在共顯性、顯性、隱性和等位基因4 種遺傳模型下，應用logistic回歸分析YTHDF1 rs6011668、HNRNPA2B1 rs2070601和rs76558212與胃癌發病風險的關聯。結果表明，在共顯性模型中，rs6011668TT基因型攜帶者的胃癌發病風險是CC基因型攜帶者的3.075倍（OR=3.075，95%CI：1.128～8.382，P=0.028）；在隱性模型中，TT基因型攜帶者的胃癌發病風險是CC/TC基因型攜帶者2.961倍（OR=2.961，95%CI=1.091～8.033，P=0.033）；未發現HNRNPA2B1rs2070601 和rs76558212與胃癌發病風險的關聯，見表3。

表3 候選SNPs基因型及等位基因頻數分布Tab.3 Genotype distribution and allele frequencies of the candidate SNPs

2.4 YTHDF1 rs6011668與胃癌發病風險的分層分析為了進一步探究YTHDF1 rs6011668與胃癌發病風險的關聯，本研究使用logistic回歸對可能與胃癌發病風險相關的因素（年齡、性別、吸煙、飲酒、飲茶、吃腌制食物、吃油炸食物和家族腫瘤史）進行分層分析。結果表明：不飲茶亞組、吃腌制食物亞組和吃油炸食物亞組中，與CC/TC基因型相比，TT基因型攜帶者的胃癌的發病風險顯著增加（P＜0.05），見表4。

表4 YTHDF1 rs6011668與胃癌發病風險的分層分析Tab.4 Subgroups-analysis of YTHDF1 rs6011668 and the risk of gastric cancer

2.5 YTHDF1 rs6011668與胃癌臨床特征的分層分析為了探究YTHDF1 rs6011668與胃癌臨床進展（浸潤程度、淋巴結轉移、遠端轉移和臨床分期）的關聯，本研究使用logistic回歸對不同胃癌臨床病理特征進行分層分析。結果表明，與CC/TC基因型攜帶者相比，TT基因型攜帶者的胃癌浸潤超過固有肌層、淋巴結轉移、遠端轉移和中晚期胃癌的風險增加（P＜0.05），見表5。

表5 YTHDF1 rs6011668與胃癌臨床病理特征的分層分析Tab.5 Subgroups-analysis of YTHDF1 rs6011668 and the clinicopathological characteristics of gastric cancer

2.6 遺傳-環境因素綜合風險評分與胃癌發病風險的關聯

2.6.1 單因素logistic回歸分析胃癌相關環境因素單因素logistic回歸分析胃癌相關因素，結果表明，飲酒、飲茶、吃腌制食品與胃癌發病風險相關：飲酒者胃癌的發病風險是不飲酒者的1.815倍（OR=1.815，95%CI：1.345～2.450，P＜0.001）；與不飲茶者相比，飲茶者發生胃癌的風險降低了89.5%（OR=0.105，95%CI：0.064～0.172，P＜0.001）；吃腌制食品者的胃癌發病風險是不吃腌制食品者的3.473倍（OR=3.473，95%CI：2.452～4.919，P＜0.001），見表6。

表6 單因素logistic回歸分析胃癌相關因素Tab.6 A one-way logistic regression analysis of factors related to gastric cancer

2.6.2 多因素logistic回歸分析胃癌相關因素及綜合遺傳-環境因素的 RS 在病例和對照中的分布YTHDF1 rs6011668是本研究新發現與胃癌發生風險相關的遺傳因素，將遺傳因素（rs6011668）和環境因素（飲酒、飲茶、吃腌制食品）納入多因素logistic回歸，結果顯示，rs6011668、飲酒、吃腌制食品是胃癌的危險因素，飲茶是胃癌的保護因素。使用多因素logistic回歸計算回歸系數，從而計算研究對象的遺傳·-環境因素綜合的RS，公式為RS=-1.034 + 1.089 × wGRS + 0.991 × 飲酒 +（-2.560） × 飲茶 + 1.227 × 吃腌制食物。病例組和對照組的RS分別為0.33 ± 0.80和-0.62 ± 1.30，RS在兩組間的分布差異有統計學意義（P＜0.001），見表7和圖1。

圖1 遺傳-環境因素綜合 RS 在病例和對照中的分布Fig.1 Distribution of risk scores for combined geneticenvironmental factors in cases and controls

表7 多因素 logistic 回歸分析胃癌的遺傳和環境因素Tab.7 Multifactorial logistic regression analysis of genetic and environmental factors of gastric cancer

2.6.3 RS的四分位數分組與胃癌發病風險的關聯RS得分越高，胃癌的發病風險越大。以RS四分位數對所有研究對象分組，與RS＜Q25組相比，Q25 ≤ RS＜Q50 組胃癌發病風險為3.090（OR=3.090，95%CI：1.718～5.559，P＜0.001），Q50 ≤ RS＜Q75組胃癌發病風險為 9.731（OR：9.731，95%CI：5.811～16.294，P＜0.001），RS ≥ Q75組胃癌發病風險為 19.949（OR=19.949，95%CI：11.207～35.510，P＜0.001），見表8。

表8 不同 RS 的四分位數分組與胃癌發病風險的相關性分析Tab.8 Correlation analysis between quartile groupings of different RS and the risk of gastric cancer

3 討論

胃癌是全球發病率和致死率最高的惡性腫瘤之一，遺傳因素和環境因素共同導致了胃癌的發生和發展。m6A修飾是一種廣泛參與腫瘤和疾病發生發展的RNA修飾類型。SNP是人類基因組中最豐富的可遺傳變異，可作為腫瘤遺傳易感性生物標志物。因此，探究與胃癌發生發展相關的m6A修飾調控因子的功能性SNPs，成為探究胃癌危險因素的新方向。例如，LI等［15］研究發現，m6A去甲基化酶FTO和 ALKBH1的SNPs與胃癌風險相關：FTO rs2287142的AG/AA基因型與胃癌風險的降低顯著相關；ALKBH1 rs1076496的GA/GG基因型與年齡≥ 55歲人群的胃癌風險增加密切相關，但與年齡＜55歲人群的胃癌風險降低顯著相關。此外，WANG等［16］研究發現m6A結合蛋白IGF2BP1的新型SNP rs9906944的CT/TT基因型與胃癌發病風險降低顯著相關。

YTHDF1是一種重要的m6A結合蛋白，其被廣泛報道參與調控宮頸癌、乳腺癌、卵巢癌、腸癌等多種人類癌癥的發生發展［17-20］。課題組的前期研究發現 YTHDF1可能與胃癌的發生發展相關，YTHDF1在胃癌組織和胃癌細胞中表達上調，其表達譜變異與胃癌患者的高危亞型明顯相關，有成為胃癌診斷生物標志的潛在可能［21］；BAI等［22］研究發現YTHDF1在胃癌組織中過量表達，并通過誘導細胞增殖和抑制DCs介導的抗腫瘤免疫反應促進胃癌的發生發展；YOU等［23］實驗證明具有高CD47表達和環狀精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸修飾的工程化小細胞外囊泡，用于有效傳遞針對YTHDF1的短干擾RNA，通過表觀遺傳和免疫調節治療胃癌。截至目前，YTHDF1 rs6011668與腫瘤遺傳易感性的相關性研究較少，LIU等［14］分析發現，rs6011668TC/TT基因型與年齡≤ 18個月兒童腎母細胞瘤風險的增加顯著相關，但是在年齡＞18個月兒童中，TC/TT基因型呈現保護因素。關于YTHDF1 rs6011668與胃癌遺傳易感性的相關性尚未得知，本研究應用病例-對照研究，結合研究對象的一般人口統計學資料、生活方式和臨床信息，探究rs6011668與胃癌風險的關聯。研究發現，與CC/TC基因型攜帶者相比，TT基因型攜帶者胃癌的發病風險增加2.961倍，進一步分層分析發現，TT基因型主要增加不飲茶者、吃腌制食物者和吃油炸食物者的胃癌發病風險；此外，TT基因型攜帶者增加胃癌浸潤程度、淋巴結轉移、遠端轉移和中晚期風險。

HNRNPA2B1是另一種m6A結合蛋白，已經被報道在包括卵巢癌、食道癌、乳腺癌在內的多種癌癥中發揮致癌作用［24］，同時HNRNPA2B1與胃癌發生、發展和預后的研究也被報道：HNRNPA2B1在胃癌組織中高表達，化學靶向HNRNPA2B1恢復p53活性有成為治療胃癌新策略的潛在可能［25］；BIRC5異構體202（BIRC5-202）在胃癌細胞中發揮了致癌功能，HNRNPA2B1調節BIRC5的剪接，有成為化療抗性胃癌細胞治療目標的潛在可能［26］。目前鮮有HNRNPA2B1 SNPs與腫瘤發生發展相關性的研究報道，本研究探究了HNRNPA2B1 rs2070601和rs76558212位點與胃癌發病風險的關聯，但未發現其與胃癌發病風險具有顯著相關性。

胃癌的發生發展是環境因素和遺傳因素共同作用的結果。研究表明，幽門螺旋桿菌感染、吸煙、飲酒、高鹽飲食和高脂肪飲食等環境因素會增加胃癌的發病風險，飲茶、多水果蔬菜飲食和低鹽飲食可以減少胃癌的發病風險［27］。例如，LI等［28］通過13.4年的隨訪研究發現，在男性中，飲酒與胃癌，尤其是賁門癌和非賁門癌風險的增加顯著相關；亞硝胺大量存在于腌制食物中，REN等［29］研究發現食用咸肉或腌制蔬菜可能增加50%的胃癌發病風險；MARTIMIANAKI等［30］發現飲用綠茶能預防胃癌的發病。本研究發現飲酒、吃腌制食物是胃癌危險因素，飲茶是胃癌保護因素，與上述結果一致。為了探究環境-遺傳因素與胃癌發病風險的關聯，本研究將遺傳（rs6011668TT基因型）和環境因素（飲酒、飲茶和吃腌制食物）加權后分別計算病例組和對照組的RS，探究兩組間RS分布差異并分析其與胃癌發病風險的關聯。研究發現，RS評分越高，胃癌的發病風險越高，與RS＜Q25組相比，Q25 ≤ RS＜Q50組、Q50 ≤ RS＜Q75組和RS ≥ Q75組的胃癌發病風險分別為3.090、9.731和19.949，綜合環境-遺傳因素對胃癌發病風險的評估更準確。

綜上所述，本研究通過病例-對照研究，首次探究了YTHDF1 rs6011668、HNRNPA2B1 rs2070601和rs76558212遺傳變異與高發區人群胃癌風險的相關性，研究發現YTHDF1 rs6011668突變基因型與胃癌風險增加和臨床進展加速相關，結合環境因素和遺傳變異能夠更好地評估胃癌的發病風險，為高發區人群胃癌發病風險的預測提供更好的參考依據。在今后的研究中，需要在更大規模的人群中進行進一步驗證，并深入探究rs6011668對YTHDF1表達的影響，以便更科學地解釋rs6011668與胃癌發生發展的關聯。