基于4-CN沉淀法的食品H2O2可視化檢測

＊楊文瑞 路迎雪 顏妍 陳彥博 薛慧 胡善文

（福建醫科大學公共衛生學院 福建 350122）

H2O2是一種重要的氧化劑，廣泛應用于食品加工、醫藥消毒、工業漂白等領域[1]。它能有效殺滅病原微生物，并可分解生成水與氧氣，對環境影響很小。我國GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》中允許在食品加工中使用H2O2作為加工助劑[2]。但是，過量的H2O2也會對人體健康和食品安全造成危害。H2O2作為活性氧自由基的重要前體之一，可誘導氧化應激，損傷細胞膜脂雙層[3]、核酸和蛋白質[4]，殘留在食物中的H2O2也可引發消化道疾病。因此，快速準確檢測食品及生物樣本中H2O2殘留量，監控其在工業、醫藥及日常生活中的使用，對保護公共健康和食品安全非常必要。

當前對H2O2的分析方法主要有滴定法、分光光度法、電化學法、色譜法和比色傳感法[5]等。例如Klassen,Normal V.等人[6]探討和比較了碘離子法和高錳酸鉀滴定法兩種測定溶液中過H2O2濃度的方法。Qixin Liu等人[7]通過TMB-Fe3O4@AuNPs合成了一種以四甲基聯苯胺氧化為顯色反應的H2O2雙傳感器。這些方法靈敏度高，準確可靠，但對儀器要求高，操作復雜，不適用于現場快速篩查[8]。因此，亟需研發一種簡便快速的H2O2檢測方法，用于食品、醫藥等行業的現場監測。

沉淀法是一種簡便經典的分析檢測方法，利用發生沉淀反應產生的顏色變化實現可視化的定性或定量分析。本文旨在采用4-CN作為顯色試劑，研究建立H2O2的快速檢測方法。通過系統優化實驗條件，考察反應機理，建立檢測模式，并擴展至實際樣品檢測，為H2O2的快速監測提供一種新的可選途徑。

1.試驗部分

（1）試驗試劑。試劑：30% H2O2、4-CN（純度≥99%）、HRP、無水乙醇（純度≥99.7%）、1mg/mL羧基化石墨烯量子點、磷酸緩沖液。所有的化學試劑通過上海麥克林生化科技有限公司購買的，無需進一步提純就可以使用。

（2）試驗儀器。多功能微孔板酶標儀（Infinite 200 PRO，Tecan）。

（3）實驗原理。HRP含有血紅素類的活性中心，可催化各種化合物的氧化還原反應。4-CN為HRP的一種典型底物，在HRP催化下，4-CN被H2O2氧化，生成一個自由基中間產物，該自由基迅速偶聯形成不溶性的紫色聚合物。因此，溶液的顏色由無色變為紫色，顏色深淺和H2O2濃度呈正比。

（4）標準工作曲線的檢測。本實驗使用質量分數為30%的H2O2存儲液，通過系數稀釋的方法配制成12.5μM、25μM、50μM、75μM、100μM 5個不同濃度的H2O2溶液，再分別添加0.2mM 4-CN溶液和0.1mg/mL的HRP溶液，充分混勻后靜置于室溫條件下反應10min。顯色結束后，在光學拍照箱中使用手機進行拍攝，圖片使用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0讀取色度值。

（5）可視化試紙檢測。利用羧基化石墨烯量子點和HRP修飾硝酸纖維素試紙步驟如下：取1mg/mL羧基化石墨烯量子點和0.1mg/mL的HRP溶液制備石墨烯-HRP混合液，超聲處理使其充分吸附。取硝酸纖維素濾紙，裁剪成小片（1cm×5cm），將石墨烯-HRP混合液涂布在濾紙片上，自然晾干。加入等量的4-CN溶液后按上節所述完成檢測，使用智能手機記錄濾紙顏色。

（6）實際樣品分析。取新鮮牛奶樣品，配制一系列濃度分別為12.5μM、30μM、45μM、60μM、90μM的H2O2溶液，按上述步驟在紙上完成檢測后拍照。

2.結果與討論

（1）反應動力學和穩定性。啟動反應后，使用多功能微孔板酶標儀測試混合液在540nm波長下的吸光度變化，如圖1（a）、（b）所示。每60s記錄一次吸光度值，連續測試35min，獲取反應動力學曲線，如圖1（c）。從結果曲線可以看出，前5min吸光度快速升高，5～10min吸光度緩慢升高，10min后基本達吸光平臺期。這表明反應體系在前10min內“-C-H”基團被H2O2不斷氧化生成著色產物，10min后反應基本完成。綜合反應動力學規律，確定該體系的最佳反應時間為10min。另外對反應體系的穩定性進行考察，結果如圖1（d）所示，在2h內色度值基本保持一致。實驗結果表明，在給定反應時間內，該體系的RGB值變化很小，反應穩定，驗證了方法的穩定性和可靠性，為后續樣品分析奠定了基礎。

圖1 檢測方法性能分析

（2）標準曲線。在最優條件下，按實驗部分1.4的方法分別測定不同濃度的H2O2標準溶液，讀取RGB數值對H2O2的濃度建立定量分析的標準曲線。使用圖像分析軟件讀取各樣品瓶中溶液的RGB色值，以藍色色度值（色度值越低代表顏色越深）為計數依據，樣品瓶檢測結果如圖2（a）、（c）、（e）所示。對標準溶液濃度與對應的RGB值進行線性擬合，如圖2（b）所示，其呈現出良好的線性關系，線性方程為y=122.8-0.84x，R2=0.992，在優化條件下，該體系可檢測到濃度最低達到5μM的H2O2標準溶液，如圖2（d）所示。

圖2 不同濃度H2O2在樣品瓶中的顯色結果與對應的RGB數值

（3）試紙性能檢測。試紙上檢測不同濃度H2O2結果如圖3（a），讀取的RGB數值如圖3（b）所示。另外取新鮮牛奶樣品進行測定，并與空白對照樣品同時檢測。結果顯示，牛奶樣品與空白對照樣品的檢測結果無明顯差異，均未檢出H2O2如圖3（c），讀取的RGB數值如圖3（d）所示。為驗證方法有效性，對牛奶樣品進行標準溶液的加標回收實驗。向牛奶樣品中分別加入濃度已知的H2O2標準溶液，測定加標樣本中的H2O2含量如圖3（e），讀取的RGB數值如圖3（f）所示。將檢測值與加標量進行比較，計算加標回收率在90.0%～105.0%之間如表1所示。表明在食品樣本中，該方法可以準確檢測H2O2。

表1 牛奶樣品加標回收率計算結果

圖3 方法檢測性能表征結果

3.結論

（1）方法檢驗性能及實際樣品檢測。標準曲線結果顯示，在12.5～100μmol/L的范圍內，該沉淀反應的色度與H2O2濃度呈現良好的線性關系（R2＞0.99），因此可用于建立的半定量檢測模型。重復性實驗結果顯示，在最佳反應條件下，同一濃度樣品的RGB數值相對標準偏差小于5%，說明方法具有良好的重現性。動力學研究發現，隨反應時間延長，樣品顏色逐漸加深，吸光值持續增加，約5min達到穩定值。樣品穩定性研究表明，色度穩定后，2h內變化不大。

（2）根據以上參數制作的H2O2可視化檢測試紙，可以有效完成對標準溶液、牛奶樣品、加標牛奶樣品的H2O2檢測。本實驗中，在牛奶樣品中未檢測到H2O2殘留，對加標樣品均有明顯的顯色反應，加標回收實驗中回收率在90.0%～105.0%范圍內，表明該方法可以用于食品中H2O2可視化快速檢測。對于其他顏色的樣品，可以采用對照線對比的方式扣除基質顏色干擾。

（3）本研究采用的4-CN沉淀法具有操作簡便、快速、試劑易得等優點，可在短時間內指示樣品中H2O2的大致含量，尤其適用于高濃度H2O2的快速篩查。但作為一種半定量分析手段，該方法檢測結果的準確性還需要其他標準定量方法如電化學、色譜等進行驗證。另外該法靈敏度有限，僅適用于高濃度樣品快速檢測，對低濃度H2O2檢測靈敏度有待提高。因此，建議該方法作為一種快速現場預篩工具，與其他標準定量分析方法聯用，發揮各自的優勢，以獲得準確可靠的H2O2定量結果。本研究為快速檢測食品樣品中H2O2殘留提供了一種簡便有效的方法，具有一定的應用前景和推廣價值。